Name: Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Leer lipopolysaccharide (LPS) zuiveren uit Gram-negatieve bacteriën met een gemodificeerde heet waterige-fenolextractiemethode. Deze techniek maakt analyse via SDS-PAGE en visualisatie mogelijk voor microbiologisch en immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health en de Cystic Fibrosis Foundation.

1. Voorbereiding van bacteriën voor LPS Extraction <ol><li> Start een nacht cultuur in 5 ml Luria Broth (LB), aangevuld met antibiotica indien nodig. Groei cultuur overnacht (12-18 uur) in een schudincubator bij 37 ° C en 200 rpm. </li><li> Verdun de cultuur 1:10 met LB en neem een OD 600 lezing in een spectrofotometer. Op basis van de OD 600 lezen, maak dan een 1,5 ml schorsing van uw bacteriën om een OD 600 van 0,5. </li><li> Pellet de bacteriën in een microcentrifuge bij 10.600 x g gedurende 10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof. De pellet kan worden opgeslagen bij -20 ° C, indien LPS niet zal onmiddellijk geëxtraheerd. </li></ol> 2. Extractie van LPS <ol><li> In de eerste plaats voor te bereiden 2x SDS buffer. Een 50 ml oplossing van 4% β-mercaptoethanol (BME), 4% SDS en 20% glycerol in 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8. Voeg een snufje broomfenolblauw om de oplossing te verven. Maak een 1x SDS-buffer voorraad door te verdunnen 2X stock 1:1 in steriel gedistilleerd H 2 O. Dit kan bij kamertemperatuur bewaard. </li><li> Merk drie afzonderlijke 10 mg / ml oplossing van DNase I, RNase en Proteinase K in steriel gedestilleerd H2O </li><li> Resuspenderen de gepelleteerde bacteriën stap 1,3 in 200 ul 1 x SDS-buffer. Zorg ervoor dat de pellet volledig geresuspendeerd door pipetteren de oplossing op en neer te langzaam. Doe niet vortex. </li><li> Kook de gesuspendeerde bacteriën in een waterbad gedurende 15 minuten. Laat de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten afkoelen. </li><li> Voeg 5 pi van zowel DNase I en RNase bereide 2.2. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 30 minuten. * Deze stap is optioneel, er nauwelijks verschil in de kwaliteit van LPS tussen nuclease behandeld en onbehandeld monsters. </li><li> Voeg 10 ul van de Proteinase K bereid in 2.2. Incubeer de monsters bij 59 ° C gedurende 3 uur. Deze stap kan &#39;s nachts worden uitgevoerd, als er tijdsdruk. </li><li> Voor elk monster, add 200 ul ijskoude Tris-verzadigde fenol (water verzadigde fenol kunnen worden gebruikt als vervanging of Tris-verzadigde fenol niet beschikbaar is). Controleer de doppen op de buizen stevig gesloten en vortex elk monster gedurende 5 tot 10 seconden. </li><li> Incubeer de monsters bij 65 ° C gedurende 15 minuten, toe te vortexen. Na incubatie afkoelen tot kamertemperatuur, vervolgens 1 ml kamertemperatuur diethylether aan elk monster en vortex 5 tot 10 seconden. Zorg ervoor dat u handvat ether uit te voeren in een zuurkast, want het is vluchtig. </li><li> Centrifugeer de monsters 20600 x g gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de monsters uit de centrifuge en haal de onderste blauwe laag. Zorg ervoor dat de bovenste, heldere laag te voorkomen. Achterlating van een kleine hoeveelheid van de blauwe laag voorkeur besmetting met de bovenste laag. </li><li> Opnieuw uit te pakken de monsters door het herhalen van de stappen 2.7 - 2.9. Twee extracties meestal voldoende. Als de monsters lijkt troebel, kan meer extracties worden de presenced. Voeg 200 ul 2x SDS-buffer aan elk van de geëxtraheerde monsters voor scheiden door SDS-PAGE. Monsters kunnen worden uitgevoerd op 8% -15% SDS-polyacrylamide gels. Vijf tot vijftien ul van LPS opgesteld op basis van deze methode is meestal voldoende voor visualisatie. </li></ol> 3. Representatieve resultaten LPS monsters bereid zoals hierboven gevisualiseerd door aankleuring direct volgend scheiding op SDS-PAGE met een standaard zilver kleuringsprotocol of een commercieel verkrijgbare kit LPS kleuring. Als alternatief kan LPS gescheiden op een polyacrylamide gel worden overgebracht naar een nitrocellulose membraan onderworpen aan Western immunoblotting met LPS-specifieke antisera. Voor dit protocol hebben we gebruik gemaakt van de Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit (Molecular Probes), en volgde de instructies van de fabrikant. In figuur 1 is een Pro-Q Emerald 300 gekleurde 12% SDS-polyacrylamidegel. Elke baan bevat 15 pi LPS bereid uit diflende stammen van Burkholderia dolosa geïsoleerd uit sputum monsters van cystic fibrosis patiënten. Verschillende LPS strepen ladder patronen reflecterende verschillende getallen O-antigen herhalende eenheden aan kern oligosaccharide, zijn duidelijk deze methode, bijvoorbeeld monsters in laan 1 en 6 hebben soortgelijke bandenpatronen elkaar (doos in rood). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3916/3916fig1.jpg" /> Figuur 1. Pro-Q Emerald 300 gekleurde LPS van Burkholderia dolosa klinische isolaten. LPS zeven B. dolosa stammen van een uitbraak bij cystic fibrosis patiënten werden geïsoleerd zoals beschreven in dit protocol. Vijftien ul werden gescheiden op een 12% SDS-polyacrylamidegel en gekleurd met Pro-Q Emerald 300 volgens de instructies van de fabrikant. LPS kern is aangegeven een pijl, en LPS met soortgelijke strepen patronen van O-antigeen herhalingen zijn verpakt in rood. M = molecuulmassa marker.

<ol><li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+O-specific+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li>
<li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide%3A+a+major+virulence+factor%2C+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li>
<li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection%3A+LPS%2C+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li>
<li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).</li>
<li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1%3AK20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li>
<li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis%3A+a+class+of+serum-sensitive%2C+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li>
<li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li>
<li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li>
<li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohyr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83(1965).</li>
<li>Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+TD+%22Nat+Genet%22">Nat Genet</a>. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Wij hebben een werkwijze beschreven voor het zuiveren van LPS afstand van andere cellulaire componenten, zoals nucleïnezuren en eiwitten. Deze methode levert hoogwaardige LPS die gebruikt kunnen worden in verschillende gebruikelijke methoden, zoals koolhydraten kleuring van SDS-PAGE gels, zoals weergegeven in figuur 1. Deze methode kan worden gebruikt om LPS serotype van verschillende stammen, met specifieke antisera, of verwantschap tonen tussen isolaten door directe visualisatie. Bijvoorbeeld, een recente genoom-brede...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DNase I recombinant, RNAse-vrij </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Visser </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> Tris-Verzadigde Fenol </td><td> Visser </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Diethylether </td><td> Thomas Wetenschappelijk </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit </td><td> Molecular Probes </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

zuivering en visualisatie van lipopolysaccharide van gram-negatieve bacteriën door hot waterige-fenolextractie

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is een belangrijk onderdeel van Gram-negatieve bacteriën buitenste membranen. Het is een drieledige molecuul dat uit lipide A, die ingebed is in de buitenste membraan, een kern oligosaccharide en het herhalen O-antigeen eenheden die buiten uitstrekken vanaf het oppervlak van de cel 1, 2. LPS is een immunodominante molecule die belangrijk is voor de virulentie en Pathogenese van vele soorten bacteriën, zoals Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, en Escherichia coli 3-5, en verschillen in LPS O-antigen samenstelling vormen de basis voor serotypering stammen. LPS is betrokken bij de gehechtheid aan gastheercellen aan het begin van de infectie en biedt bescherming tegen complement-gemedieerde doden; stammen die LPS missen kunnen worden verminderd voor de virulentie 6-8. Daarom is het belangrijk om LPS te visualiseren name van klinische isolaten. Het visualiseren van LPS banding patronen en erkenning door middel van specifieke eenntibodies kan nuttig zijn hulpmiddelen om stam lijnen te identificeren en om de verschillende mutanten te karakteriseren. In dit verslag beschrijven we een hete waterige fenol werkwijze voor de isolatie en zuivering van LPS van Gram-negatieve bacteriële cellen. Dit protocol kan de extractie van LPS afstand van nucleïnezuren en eiwitten die interfereren met visualisatie van LPS dat optreedt bij kortere minder intensieve winningsmethoden 9. LPS deze wijze bereid kunnen worden gescheiden natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) en direct gekleurd met koolhydraten / glycoproteïne vlekken of standaard zilverkleuring methoden. Veel anti-sera aan LPS bevatten antilichamen die kruisreageren met buitenste membraan eiwitten of andere antigene doelen die kunnen hinderen reactiviteit waargenomen na West-immunoblot van SDS-PAGE gescheiden ruwe cellysaten. Protease behandeling van ruwe cellysaten alleen is niet altijd een effectieve manier van verwijderen van dezeachtergrond met behulp van deze of andere visualisatie methoden. Verder kan uitgebreid protease behandeling in een poging om deze achtergrond verwijderen tot slechte kwaliteit LPS dat niet goed is opgelost door elk van de bovengenoemde methoden. Om deze redenen zijn wij van mening dat de volgende protocol, aangepast van Westpahl en Jann 10, is ideaal voor LPS extractie.

Wij beschrijven een gemodificeerd hot waterige fenol extractie werkwijze voor het zuiveren lipopolysaccharide (LPS) van Gram-negatieve bacteriën. Afgetapt kan de LPS vervolgens geanalyseerd door SDS-PAGE en gevisualiseerd door directe kleuring of Western immunoblot.

Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie

Lipopolysaccharide (LPS) is een hoofdbestanddeel van de buitenmembranen van Gram-negatieve bacteriën. Het is een tripartite molecule bestaande uit lipide A, wat ...

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van LPS uit Gram-negatieve bacteriën. Dit wordt bereikt door eerst een overnachtcultuur van vijf milliliter bacteriën te kweken in een geschikt medium en de cultuur aan te passen naar een optische dichtheid van 0,5 bij 600 nanometers. Vervolgens worden de bacteriën gepellet door middel van microcentrifugatie en worden de cellen geresuspendeerd in een trisbuffer die SDS en beam of capto ethanol bevat.Vervolgens worden de cellysaten gekookt en behandeld met protease en nuclease. Ten slotte worden twee opeenvolgende extracties uitgevoerd met warm waterig fenol en diethylether, waarbij de waterige blauwe laag zorgvuldig wordt verwijderd en bewaard. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die zowel de hoeveelheid als de aanwezigheid of afwezigheid van LPS en bacteriële stammen aantonen, evenals de modaliteit van de O-antigeenketenlengte via scheiding door SDS-PAGE en western blot-analyses met LPS-specifieke antilichamen of directe kleuring van de polysachariden in de gel.Het voordeel van deze techniek ten opzichte van de proteasebehandeling van Hitchcock en Brown is dat deze techniek leidt tot zuivere LPS-monsters die beter

purification-visualization-lipopolysaccharide-from-gram-negative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the enrichment of bacterial lipoproteins using a non-ionic detergent that undergoes phase separation upon warming. Through sequential temperature shifts and centrifugation steps, lipoproteins are selectively partitioned into the detergent phase, while non-lipoprotein contaminants...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins Using Non-Ionic Detergent Phase Separation

Source: Hu, Y., et al. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the use of thin-layer chromatography (TLC) to assess the degradation of exopolysaccharides (EPS) by human fecal microbiota. EPS fragments in fermentation supernatants are separated based on size and polarity using TLC, then visualized as colored bands following carbohydrate-specific staining.

Performing Thin-Layer Chromatography to Assess Bacterial Exopolysaccharide Degradation

This video demonstrates the thin-layer chromatography-based separation of mycolic acids. This technique separates the different mycolic acids—long-chain lipids present in the cell wall of mycobacteria—based on their polarity.

Thin Layer Chromatography-Based Separation of Mycolic Acid Variants: A Method to Separate Mycobacterial Cell Wall Lipids Based on Polarity

Isolatie en karakterisering van het lipide Een domein van lipopolysaccharide (LPS) van gram-negatieve bacteriën geeft inzicht in celoppervlak gebaseerde mechanismen van resistentie tegen antibiotica, bacteriële overleving en fitness, en hoe chemisch diverse lipide Een moleculaire species verschillend moduleren gastheer aangeboren immuunrespons.

Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

De bacteriële celwand bestaat uit peptidoglycan, een macromoleculair netwerk van suikerstrengen gekruist door peptiden. Ultra Performance Liquid Chromatography biedt een hoge resolutie en doorvoer voor nieuwe ontdekkingen van peptidoglycan samenstelling. We presenteren een procedure voor de isolatie van celwanden (sacculi) en hun daaropvolgende voorbereiding voor analyse via UPLC.

Isolatie en bereiding van bacteriële celwanden voor compositorische analyse door Ultra Performance Liquid Chromatography

Fosfolipide vetzuren geven informatie over de structuur van de bodem microbiële gemeenschappen. We presenteren extractiemethoden uit grondmonsters met een eenfasige chloroformmengsel, fractionering van geëxtraheerde lipiden die vaste fase extractie kolommen en methanolyse tot vetzuurmethylesters, die met behulp van capillaire gaschromatografie produceren.

Extractie en analyse van Microbiële Phospholipid vetzuren in de bodem

De verrijking van bacteriële lipoproteins met behulp van een fase van de niet-ionogene oppervlakteactieve stof partitioneren methode wordt beschreven voor direct gebruik in TLR testen of andere toepassingen. Verdere stappen zijn gedetailleerd voor te bereiden al lipopeptides van N-terminale structurele karakterisering door massaspectrometrie.

Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie

Gram-negatieve bacteriën produceren twee ruimtelijk gescheiden membranen. Het buitenste membraan wordt van het binnenste membraan verdeeld door een periplasma en een peptidoglycanlaag. Het vermogen om de dubbele tweelagen van deze microben te isoleren is van cruciaal belang geweest voor het begrijpen van hun fysiologie en pathogenese.

Scheiding van de celenvelop voor gramnegatieve bacteriën in binnen- en buitenste membraanfracties met technische aanpassingen voor Acinetobacter baumannii

Dit protocol omvat een gedetailleerde analyse van de peptidoglycaansamenstelling met behulp van vloeistofchromatografie massaspectrometrie in combinatie met geavanceerde functie-extractie en bio-informatica-analysesoftware.

Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Er wordt een protocol gepresenteerd om het totale lipidegehalte van de celwand van een breed scala aan mycobacteriën te extraheren. Bovendien worden extractie- en analyseprotocollen van de verschillende soorten mycolzuren getoond. Een dunne-laag chromatografisch protocol om deze mycobacteriële verbindingen te controleren is ook aanwezig.

Analyse van de lipidesamenstelling van mycobacteriën door dunnelaagchromatografie

Gangliosiden zijn siaalzuurhoudende glycosfingolipiden die bijzonder overvloedig aanwezig zijn in de hersenen. Hun amfipathische aard vereist organische /waterige extractie- en zuiveringstechnieken om optimaal herstel en nauwkeurige analyses te garanderen. Dit artikel biedt een overzicht van analytische en preparatieve schaal ganglioside extractie, zuivering en dunne laag chromatografie analyse.

Ganglioside extractie, zuivering en profilering

Leer lipopolysaccharide (LPS) zuiveren uit Gram-negatieve bacteriën met een gemodificeerde heet waterige-fenolextractiemethode. Deze techniek maakt analyse via SDS-PAGE en visualisatie mogelijk voor microbiologisch en immunologisch onderzoek.

Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie

Meer video's verkennen