Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie

Het algemene doel van deze procedure is het extraheren van LPS uit Gram-negatieve bacteriën. Dit wordt bereikt door eerst een overnight-cultuur van vijf milliliter bacteriën te kweken in een geschikt medium en de cultuur aan te passen naar een optische dichtheid van 0,5 bij 600 nanometer. Vervolgens worden de bacteriën gepellet door middel van microcentrifugatie en worden de cellen geresuspendeerd in een tris-buffer die SDS en beam of capto ethanol bevat.

Vervolgens worden de cellysaten gekookt en behandeld met protease en nuclease. Ten slotte worden twee opeenvolgende extracties uitgevoerd met warm waterig fenol en diethylether, waarbij de waterige blauwe laag zorgvuldig wordt verwijderd en bewaard. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die zowel de hoeveelheid als de aanwezigheid of afwezigheid van LPS en bacteriestammen aantonen, alsofmede de modaliteit van de O-antigeenketenlengte via scheiding door SDS-PAGE en western blot-analyses met LPS-specifieke antilichamen of directe kleuring van de polysachariden in de gel.

Het voordeel van deze techniek ten opzichte van de proteasebehandeling van Hitchcock en Brown is dat deze techniek leidt tot zuivere LPS-monsters die beter gescheiden kunnen worden via SDS-page en western blotting. Deze methode kan inzicht bieden in de synthese en regulatie van lipopolysacharide in VIR in vrijwel elke gram-negatieve bacterie, inclusief E. coli en Salmonella, evenals biodefensie- en opkomende pathogenen zoals Ella en Acetobacter respectievelijk. Om bacteriën te kweken voor LPS-extractie, wordt een overnight-cultuur van gram-negatieve bacteriën opgesteld in vijf milliliter LB aangevuld met antibiotica.

Indien nodig, kweek de cultuur gedurende de nacht in een schudincubator bij 200 RPM en 37 graden Celsius. Gebruik LB om de cultuur 1:10 te verdunnen en meet vervolgens de optische dichtheid bij 600 nanometer op basis van het resultaat. Bereid een suspensie van de bacteriën van 1,5 milliliter voor met een uiteindelijke optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5.

Centrifugeer de bacteriën in een microcentrifuge bij 10.600 ×g gedurende 10 minuten om een pellet te vormen. Verwijder vervolgens het supernatant en gooi dit weg. Bereid voor de extractie van LPS de volgende oplossingen voor: een 1X SDS-buffer, 4% betta-mercapto-ethanol of BME, 4% SDS en 20% glycerol in 0,1 M Tris-HCl pH 6,8 met een snufje bromofenolblauw, en oplossingen van 10 mg/mL DNase I, RNase en proteinase K in steriel gedestilleerd water voor resuspensie.

Zorg ervoor dat de gepelletteerde bacteriën in 200 µL 1X SDS-buffer volledig worden geresuspendeerd door de oplossing herhaaldelijk met een pipet op en neer te trekken. Kook de gesuspendeerde bacteriën vervolgens langzaam gedurende 15 minuten in een waterbad. Laat de oplossing daarna 15 minuten afkoelen op kamertemperatuur.

Voeg als optionele stap vijf µL van elk van de DNA 1- en RNA-oplossingen toe en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C. Voeg 10 µL van de protease K-oplossing toe en incubeer de monsters gedurende drie uur bij 59 °C. Voeg bij elk monster 200 µL ijskoud tris, verzadigd fenol toe.

Sluit de dopjes stevig en vortex elke buis gedurende vijf tot 10 seconden. Incubeer de monsters bij 65 °C gedurende 15 minuten. Koel ze, met af en toe vortexen, af tot kamertemperatuur.

Voeg vervolgens onder een zuurkast één milliliter ethyléther op kamertemperatuur toe aan elk monster en vortex dit gedurende vijf tot 10 seconden. Centrifugeer de monsters bij 20.600 ×g gedurende 10 minuten en haal ze voorzichtig uit de centrifuge. Extraheer de onderste blauwe laag uit elk monster, waarbij de bovenste heldere laag wordt vermeden.

Voeg een extra 200 µL ijskoud tris en verzadigd fenol toe aan elke buis en herhaal de extractie. Voeg 200 µL twee XSDS-buffer toe. Scheid vijf tot 15 µL van elk LPS-monster op acht tot 15% SDS-polyacrylamidegels.

Hier wordt een 12% SDS-PAGE-gel getoond van LPS-monsters die zijn bereid uit verschillende stammen van bur cold area de losa, geïsoleerd uit sputummonsters van patiënten met cystische fibrose. De verschillende bandpatronen weerspiegelen de verschillende aantallen herhalende eenheden van het O-antigeen die gebonden zijn aan de kern-oligosachariden. Een vergelijkbaar aantal herhalende eenheden is te zien in monster één en zes.

Vergeet niet dat werken met fenol-dathylether gevaarlijk kan zijn; er moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen zoals een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril, en deze experimenten moeten in een zuurkast worden uitgevoerd tijdens het uitvoeren van deze procedure. Het is belangrijk om de extracties snel uit te voeren, zodat de monsters niet verloren gaan tijdens de verwerking. Na deze procedure moeten Western immuno blotting of methoden om lipopolysachariden te visualiseren via zilverkleuring of andere methoden worden toegepast om de verwantschap tussen stammen te visualiseren.