Zuivering en Visualisatie van Lipopolysaccharide van Gram-negatieve bacteriën door Hot Waterige-fenolextractie

Het algemene doel van deze procedure is om LPS uit Gram-negatieve bacteriën te extraheren. Dit wordt bereikt door eerst een vijf milliliter overnachtelijke kweek van bacteriën in geschikt medium te laten groeien en de kweek aan te passen tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5. Vervolgens worden de bacteriën gepelleteerd door microcentrifugering en worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in een tris-buffer bevattende SDS en beam of capto-ethanol.

Vervolgens worden de cellysaten gekookt en behandeld met protease en nuclease. Ten slotte worden twee opeenvolgende extracties uitgevoerd met heet waterig fenol en dyl-ether, waarbij de waterige blauwe laag zorgvuldig wordt verwijderd en behouden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de hoeveelheid evenals de aanwezigheid of afwezigheid van LPS en bacteriestammen laten zien, evenals de modaliteit van de lengte van de O-antigeenketen door scheiding met SDS-pagina en westerse bloedanalyse met LPS-specifieke antilichamen of directe kleuring van de polysacchariden in de gel.

Het voordeel van deze techniek vergeleken met de protease-behandeling van Hitchcock en Brown is dat deze techniek leidt tot zuivere LPS-monsters die beter kunnen worden opgelost door SDS-pagina en westerse blotting. Deze methode kan inzicht geven in de synthese en regulatie van lipopolysacharide in VIR in vrijwel elke gram-negatieve bacterie, inclusief e coli en salmonella, evenals biodefensie en opkomende pathogenen zoals Ella en Acetobacter respectievelijk om bacteriën te laten groeien. Voor LPS-extractie, zet een overnachtelijke kweek van gram-negatieve bacteriën in vijf milliliter LB aangevuld met antibiotica op.

Indien nodig, laat de kweek een nacht groeien in een schuddende incubator bij 200 RPM en 37 graden Celsius. Gebruik LB om de kweek te verdunnen met een verhouding van 1 op 10 en meet vervolgens de optische dichtheid bij 600 nanometer op basis van het resultaat. Bereid een 1,5 milliliter suspensie van de bacteriën voor met een uiteindelijke optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5.

Pellet de bacteriën in een microcentrifuge bij 10.600 keer G gedurende 10 minuten. Verwijder vervolgens en gooi het supernatant weg. Om LPS te extraheren, bereid de volgende oplossingen voor: één XSDS-buffer, 4% betta me capto-ethanol of BME 4%SDS en 20% glycerol in 0,1 molaire tris-HCl pH 6,8 met een snuifje broomfenolblauw en 10 milligram per milliliter oplossingen van DNA een RNA's en proteinase K in steriel gedestilleerd water resuspenderen.

De gepelleteerd bacteriën in 200 microliters van één XSDS-buffer zorgen ervoor dat de pellet volledig wordt gesuspendeerd door de oplossing op en neer te pipetten. Laat de gesuspendeerde bacteriën gedurende 15 minuten langzaam koken in een waterbad. Laat de oplossing vervolgens 15 minuten afkoelen op kamertemperatuur.

Als optionele stap, voeg vijf microliter van elk van de DNA een en RNA-oplossingen toe en incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg 10 microliter van de protease K-oplossing toe en incubeer de monsters gedurende drie uur bij 59 graden Celsius. Voeg naast elk monster 200 microliter ijskoud tris, verzadigd fenol toe.

Sluit de doppen goed en vortex elke buis gedurende vijf tot 10 seconden. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 65 graden Celsius. Vortex, laat ze af en toe afkoelen tot kamertemperatuur.

Voeg vervolgens onder een afzuigkappen één milliliter ethylether op kamertemperatuur toe aan elk monster en vortex gedurende vijf tot 10 seconden. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 20.600 keer G en verwijder ze voorzichtig uit de centrifuge. Extraheer de onderste blauwe laag uit elk monster, waarbij de bovenste heldere laag wordt vermeden.

Voeg een extra 200 microliter ijskoud tris, verzadigd fenol toe en herhaal de extractie in elke buis. Voeg 200 microliter van twee XSDS-buffer toe. Scheid vijf tot vijftien microliter van elk LPS-monster op acht tot vijftien% SDS polyacrylamide gels.

Hier is een 12% SDS-pagina-gel van LPS-monsters weergegeven die zijn bereid uit verschillende stammen van bur cold area de losa, geïsoleerd uit sputummonsters van cystische fibrose-patiënten. De verschillende bandpatronen weerspiegelen de verschillende aantallen O-antigeen, herhalende eenheden die zijn bevestigd aan de kernoligosacchariden. Een vergelijkbaar aantal herhalende eenheden is te zien in monsters één en zes.

Vergeet niet dat het werken met fenol dathyl-ether gevaarlijk kan zijn. Voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van beschermende, persoonlijke beschermingsmiddelen zoals een labjas, handschoenen en veiligheidsbril moeten worden genomen en deze experimenten moeten worden uitgevoerd in een afzuigkap terwijl u deze procedure probeert. Het is belangrijk om de extracties snel uit te voeren, zodat u de monsters tijdens de verwerking niet verliest. Na dit proces moeten westerse immunoblotting of methoden om de lipopolysacharide te visualiseren door zilver STR of andere methoden worden genomen om de verwantschap tussen de stammen te visualiseren.