Name: Identificatie en isolatie van Slow-delende cellen in Human Glioblastoma Met behulp van Carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Leer de identificatie en isolatie van langzaam delende cellen in menselijk glioblastoom met CFSE-kleuring en flowcytometrie. Deze methode helpt onderzoekers tumoerheterogeniteit te begrijpen en gerichte therapieën te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de Florida Center for Brain Tumor Research, de Preston A. Wells Jr Center for Brain Tumor Therapie en de National Institutes of Health (1R21CA141020-01).

1. Voorbereiden Glioblastoma enkele celsuspensie <ol><li> Gliomasphere cultuur wordt opgesteld en bijgehouden met behulp van de neurosfeer assay (NSA) zoals eerder beschreven 2,11,12. </li><li> Zijner tijd voor de passage gliomaspheres, is het medium dat de gebieden verwijderd, geplaatst in een geschikte grootte steriele kweekbuis, en gecentrifugeerd bij 800 rpm (110 g) gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> De supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd van gebieden in 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA en geïncubeerd bij 37 ° C in een waterbad gedurende 3-5 min. </li><li> Een gelijk volume sojaboontrypsineremmer wordt vervolgens gebruikt om de trypsine te beëindigen. </li><li> De celsuspensie wordt voorzichtig gepipetteerd op en neer om homogeniteit en volledige neutralisering van de trypsine-activiteit te garanderen. </li><li> De celsuspensie wordt opnieuw gecentrifugeerd bij 800 rpm gedurende 5 minuten. De supernatant wordt verwijderd en de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 1 ml NeuroCultNSC Basal Medium. </li><li> 10 pl van de single-celsuspensie wordt gemengd met 90μl van trypan blauw om een ​​celgetal voeren. </li></ol> 2. Kleuring met Cell Trace carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) Green Fluorescent Dye <ol><li> Per 1 miljoen cellen gekleurd is, wordt 1 ml van kleuring reagens bereid door toevoeging van 1 pi 5 mM Cell Trace CFSE kleurstof (Molecular Probes, Invitrogen) met 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium tot een uiteindelijke concentratie van 5 kleuring geven uM . </li><li> De kleuring reagens dat de cellen goed gemengd tot homogeniteit en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Tijdens de incubatie wordt ijskoude NeuroCult NSC Basal Medium bereid als quenching oplossing. </li><li> De kleuring te stoppen, wordt ongeveer 5-10 volumes van ijskoud quenching oplossing toegevoegd aan de CFSE-beladen cellen. </li><li> De oplossing wordt vervolgens gecentrifugeerd bij 800 rpm gedurende 5 minuten en het supernatant wordt weggegooid. </li><li> Op eis punt moet er verschijnt een pellet van cellen op de bodem van de buis met een heldere groene tint van kleur, waarin de kleuring is geslaagd. </li><li> De cellen worden gewassen door opnieuw suspenderen van de pellet in 1-2 ml vers NeuroCult NSC Basal Medium, centrifugeren bij 800 rpm gedurende 5 minuten en de supernatant. Deze procedure wordt herhaald voor een totaal van drie wasbehandelingen. </li><li> Na de derde wassen worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in 1 ml van NeuroCult NSC basismedium en een celgetal uitgevoerd. </li><li> De CFSE gekleurde cellen worden vervolgens uitgeplaat in steriele weefselkweekflessen bij een geschikte dichtheid [50.000 cellen / ml] en in een 37 ° C / 5% CO2 bevochtigde incubator. </li></ol> 3. CFSE Laden Verificatie <ol><li> Cellen uitgeplaat in NSA cultuur kan worden gecontroleerd onder een fluorescentiemicroscoop met CFSE kleuring verifiëren. In dit stadium alle cellen vertonen heldergroene kleur (figuur 1). Als alternatief, een druppel van de suspensie vanCFSE gekleurde cellen kunnen worden op een microscoopglaasje en bedekt met een dekglaasje om cellen te visualiseren onder de fluorescentiemicroscoop. </li><li> Succesvolle CFSE labeling wordt verder bevestigd via flowcytometrie. Zoveel als 1-5 x 10 5 cellen uit elke groep voldoende voor CFSE kleuring verificatie. De CFSE geladen en ongeladen cellen negatieve controle cellen respectievelijk geresuspendeerd in 1 x PBS-of NeuroCult NSC Basal Medium voor een totaal volume van 500 ul en in aparte buizen FACS. </li><li> De flowcytometer is aangepast op basis van de handleiding instructies parameters. CFSE heeft een golflengte excitatie maximum van 492 nm en emissie maximum van 517 nm. </li><li> Eerst worden de onbelaste controle cellen uitgevoerd en de verkregen events worden in voorwaartse en zijwaartse verstrooiing (FSC vs SSC) en histogram plots en de belangrijkste celpopulatie gated (Figuur 2A). </li><li> Evenzo worden de CFSE beladen cellen geanalyseerd met dezelfde parameters voor controle cellen (Figuur 2B). </li></ol> 4. Isolatie van de Slow-delende [dwz CFSE Behoud] Cel Bevolking Met behulp van fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) <ol><li> Na splitsing wordt CFSE-intensiteit verlaagd en hGBM cellen vormen gliomaspheres die zijn samengesteld uit cellen vertonen verschillende groene fluorescentie intensiteit (Figuur 3). Wanneer de gliomaspheres hebben een gemiddelde grootte van ongeveer 150 tot 200 micrometer in diameter (ongeveer 5 tot 10 dagen na CFSE loading afhankelijk van de cellijn groei) bereikt, wordt het medium dat de bollen verwijderd, geplaatst in een geschikte grootte steriele weefselkweek buis en gecentrifugeerd bij 800 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Een enkele celsuspensie wordt bereid zoals beschreven in voorafgaande stappen en de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in PBS voor een celtelling om een celsuspensie te bereiden met een dichtheid tot 10 7 cellen per milliliter. </li><li> Achteruiter opnieuw suspenderen van de cellen in een geschikt volume PBS wordt propidiumjodide (PI, Sigma, 500 ug / ml) toegevoegd in een concentratie van 1 pi / ml celsuspensie om dode cellen uit te sluiten wanneer gesorteerd / geanalyseerd door doorstroomcytometrie. </li><li> Twee 15 ml steriele kweekbuisjes die elk 1 ml volledig NeuroCult NSC Medium wordt gebruikt om de gesorteerde slow-delende cellen (CFSE behoud cellen) en de snel delende cellen (CFSE verdunning cellen) te verzamelen. </li><li> Eerst wordt de celsuspensie uit de onbelaste celgroep lopen door de flowcytometer. </li><li> De cellen (events) uitgezet op basis van voorwaartse verstrooiing (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC) en spanning parameters voor beide parameters zodanig aangepast dat de meerderheid van de cellen in de stroom plot. </li><li> Om dode of beschadigde cellen uit te sluiten, worden de cellen uitgezet op basis van SSC versus PI reactiviteit en de single live-celpopulatie (PI negatief) is omheind. </li><li> Vervolgens wordt een homogene celpopulatie geselecteerd op forward verstrooiing (FSC) versus zijwaartse verstrooiing (SSC). </li><li> De homogene enkele levende cel populatie wordt dan uitgezet in een histogram op basis van cel-frequentie versus CFSE intensiteit ingesteld op een logaritmische schaal. De CFSE laser intensiteit wordt aangepast om het negatieve signaal tussen 0 en 100 plaatsen. </li><li> Met dezelfde parameters en een vergelijkbare gating strategie worden de CFSE gemerkte cellen lopen door de stromingscytometer en geanalyseerd (Figuur 4C). </li><li> Vervolgens wordt een langzame delende populatie van cellen en een totale populatie (sneller delende cellen) geïdentificeerd op basis van hun vermogen om CFSE (CFSE hoge top 5% en CFSE laag bodem 85%, respectievelijk) behouden. </li><li> Deze verschillende celpopulaties worden vervolgens gesorteerd in afzonderlijke 15 ml steriele weefselkweek buizen met 1 ml van complete NSC medium. </li><li> Gesorteerde cellen gecentrifugeerd bij 800 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in een gepassende volume medium (afhankelijk van het aantal afzonderlijke gebeurtenissen of korrelgrootte) en een celgetal uitgevoerd. </li><li> Cellen van de verschillende populaties gesorteerd vervolgens uitgeplaat bij 50.000 cellen per milliliter in een geschikte steriele weefselkweekfles en geplaatst in een 37 ° C / 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende 5-10 dagen voordat zij opeenvolgend doorgekweekt of voor downstream experimenten. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Na CFSE laden alle cellen presenteren een intense groene fluorescentie gevisualiseerd onder de microscoop (Figuur 1). Deze groene getinte kleur te zien zelfs met het blote oog (zie video). Analyse van deze cellen met flowcytometrie toont ook zeer intense groene fluorescentie vergeleken met controle cellen (Figuur 2). Bij plating CFSE geladen cellen in neurosfeer cultuur, deze cellen prolifereren en vormen 150 tot 200 micrometer gliomaspheres in 5-10 dagen. De cellen prolifereren, t<html> hij fluorescerende kleurstof gelijkelijk verdeeld tussen dochtercellen op divisies leidt tot de halvering van de fluorescentie-intensiteit bij elke celdeling. Glioblastomas zijn functioneel heterogene en zijn samengesteld uit cellen prolifereren op verschillende tijdschalen. De werkwijze beschreven in dit protocol laat toe identificeren en snel en langzaam delende cellen te isoleren door hun vermogen om te verdunnen of te behouden CFSE respectievelijk (Figuur 3, zie ook de video). Flowcytometrieanalyse van gedissocieerde gliomaspheres gegenereerd door CFSE-beladen cellen in vergelijking met onbelaste cellen toont diverse CFSE retentie-eigenschappen (Figuur 4). Snel delende cellen (onderste 85%) of langzaam delende cellen (de top 5% - CFSE hoog) exhibit gliomapshere vormend vermogen indien gekweekt in de neurosfeer assay omstandigheden (figuur 5). guur 1 &quot;/&gt; Figuur 1. Gedissocieerde tumorcellen direct na belading met CFSE kleurstof. De cellen vertonen felle groene kleur te tonen succesvol etikettering. Originele vergroting, 10 x. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. CFSE Bevestiging laden met behulp van flowcytometrie. A) ongeladen cellen, B) CFSE geladen cellen en c) het vergelijken CFSE fluorescentie-intensiteit in beladen versus onbelast cellen. Merk op dat er verscheidene grootteordes verschil in fluorescentie-intensiteit tussen de gelabelde en ongelabelde cellen. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Een vertegenwoordiger gliomasphere afgeleid van een CFSE beladen cel 6 dagen na uitplaten. Sommige cellen vertonen zeer lichte CFSE kleuring. Originele vergroting, 63 x. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot; alt = &quot;Figuur 4&quot; /&gt; Figuur 4. Representatieve flowcytometrie plaatsen / histogrammen voor isolatie van snelle en trage delende cellen 6 dagen na CFSE kleuring. A) FSC vs SSC de gehele celpopulatie tonen, B) SSC vs PI reactiviteit van dode of beschadigde cellen uitsluiten C) FSC vs SSC tot poort homogene levende celpopulatie, D) toont de aanwezigheid van CFSE behouden cellen 6 dagen na CFSE labeling zoals blijkt uit een hogere fluorescentie-intensiteit in vergelijking met de negatieve controle. Het histogram geeft ook aan dat de CFSE intensiteit vervallen na verloop van tijd. E) Histogram weergave van de gating strategie om CFSE behoud van cellen (top 5%) en CFSE verdunnen cellen (onderste 85%) te identificeren. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Representatieve gliomaspheres gegenereerd <strong&gt; A) snel delende cellen (CFSE laag) en B) langzaam delende cellen (CFSE hoog). Originele vergroting:. 10x en 20x respectievelijk C) Vertegenwoordiger celgetal verkregen van snel of langzaam delende cel afkomstige cultuur op passagetijd. P &lt;0,05, t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

<ol><li>Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+cancer+robustness+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">The origins of cancer robustness and evolvability.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).</li>
<li>Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycholate+promotes+survival+of+breast+cancer+cells+by+reducing+the+level+of+pro-apoptotic+ceramide%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide.</a> Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).</li>
<li>Pece, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li>
<li>Roesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporarily+distinct+subpopulation+of+slow-cycling+melanoma+cells+is+required+for+continuous+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth.</a> Cell. 141, 583-594 (2010).</li>
<li>Dembinski, J. L., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+analysis+of+a+slow+cycling+stem+cell-like+subpopulation+in+pancreas+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).</li>
<li>Graham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive%2C+quiescent%2C+Philadelphia-positive+stem+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+are+insensitive+to+STI571+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro.</a> Blood. 99, 319-325 (2002).</li>
<li>Holyoake, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive+quiescent+leukemic+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+spontaneously+initiate+factor-independent+growth+in+vitro+in+association+with+up-regulation+of+expression+of+interleukin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3.</a> Blood. 97, 720-728 (2001).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li>
<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+Human+Glioblastoma+Multiforme+Tumor+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Steeds studies hebben het belang aangetoond van een langzaam delende sub-compartiment van cellen in kanker die bijdragen tot tumorvorming en behandeling weerstand 2-8. Daarom is het essentieel om te beschrijven en te standaardiseren experimentele methoden waarmee de studie van deze specifieke subpopulatie van cellen of meer in het algemeen om subpopulaties te vergelijken met verschillende groeicijfers. Met behulp van CFSE te identificeren en te isoleren sub-fracties van cellen op basis van hun snelheid van ce...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Type </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium (Human) </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC proliferatieverdrag Supplementen (Human) </td><td> Medium supplement </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td></tr><tr><td> % 0,05 trypsine-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> Sojaboontrypsineremmer </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 kolf </td><td> Cultuur software </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 kolf </td><td> Cultuur software </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> 15 ml buisjes </td><td> Cultuur software </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> 50 ml buisjes </td><td> Cultuur software </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Groeifactor </td><td> R &amp; D- </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CellTrace CFSE celproliferatie Kit </td><td> TL-Cell Division Tracking Dye </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identificatie en isolatie van slow-delende cellen in human glioblastoma met behulp van carboxy fluoresceïne succinimidylester (cfse)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeniteit is een fundamenteel kenmerk ondersteunende tumor robuustheid en presenteert een centrale belemmering voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën 1. Te overwinnen het probleem van tumor heterogeniteit is het noodzakelijk dat assays en instrumenten waarmee fenotypische, (epi) genetische en functionele identificatie en karakterisatie van tumor subpopulaties die specifieke ziekte pathologieën rijden en klinisch relevante doelen. Het is nu bekend dat tumoren vertonen verschillende deelfracties van cellen met verschillende frequenties van celdeling, en de functionele criterium dat langzaam fietsen positief geassocieerd met tumorvorming vermogen in verschillende kankers waaronder die van de hersenen, borst, huid en pancreas en leukemie 2-8. De fluorescente kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) is gebruikt voor het volgen van de verdeling frequentie van cellen in vitro en in vivo in bloed overgedragen tumors en vaste tumoren zoals 2,7,8 glioblastoma. De cel-permeant niet fluorescerend pro-drug van CFSE omgezet door intracellulaire esterasen in een fluorescente verbinding, die binnen cellen vastgehouden door covalente binding aan eiwitten door reactie van de succinimidyl groep met intracellulaire aminegroepen vormen stabiele amidebindingen 9. De fluorescerende kleurstof wordt gelijkelijk verdeeld tussen dochtercellen op divisies leidt tot de halvering van de fluorescentie-intensiteit bij elke celdeling. Dit maakt het volgen van celcyclus frequentie tot acht tot tien ronden van sector 10. CFSE retentie capaciteit werd gebruikt met hersentumor cellen te identificeren en te isoleren van een langzaam fietsen subpopulatie (top 5% kleurstof-behoud van cellen) aangetoond worden verrijkt in kankerstamcel activiteit 2. Dit protocol beschrijft de techniek van gekleurde cellen met CFSE en isolatie van afzonderlijke populaties in een cultuur van menselijke glioblastoom (GBM)-afgeleide cellen bezitten verschillende divisie tarieven met behulp van flowcytometrie 2. De techniek heeft gediend te identificeren en een hersentumor langzaam cycling populatie van cellen te isoleren door hun vermogen om de CFSE labeling behouden.

Deze video protocol toont de toepassing van de fluorescente kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) voor de identificatie en scheiding van verschillende sub-populaties van cellen in humane glioblastoma gebaseerd op de frequentie van de celdeling.

Identificatie en isolatie van Slow-delende cellen in Human Glioblastoma Met behulp van Carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE)

Tumorheterogeniteit is een fundamenteel kenmerk dat bijdraagt aan de robuustheid van tumoren en vormt een centraal obstakel voor de ontwikkeling van therapeutische ...

Dit videoprotocol demonstreert de identificatie en isolatie van langzaam delende cellen in menselijk glioblastoom met behulp van carboxyfluoresceïne-diacetaat, CFSE. Glioblastoomtumorcellen worden eerst gekweekt met behulp van de neurosfeer-assay. Vervolgens worden de resulterende sferen gedissocieerd tot enkelvoudige cellen en gekleurd met CFSE.De met CFSE gelabelde cellen worden opnieuw uitgeplaat. In de neurosfeer-cultuur worden de resulterende sferen gedissocieerd tot enkelvoudige cellen en door de flowcytometer geanalyseerd. Langzaam en snel delende cellen worden geïdentificeerd en gesorteerd op basis van de fluorescentie-intensiteit als functie van de celdeling.Frequentieheterogeniteit is een essentieel kenmerk van kanker. Deze heterogeniteit ondersteunt de robuustheid van de tumor en vormt een groot obstakel voor de ontwikkeling van volledig effectieve behandelingen. Daarom is het van cruciaal belang om instrumenten en assays te ontwikkelen om deze heterogeniteit, die genetisch, fenotypisch en functioneel is gedefinieerd, te bestuderen en te begrijpen.In dit videoprotocol beschrijven we een standaardmethode met behulp van de flues en I-C-F-S-C. Deze techniek maakt de identif

identification-isolation-slow-dividing-cells-human-glioblastoma-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

CFSE labels covalent langlevende intracellulaire moleculen met de fluorescente kleurstof, carboxyfluoresceïne. Als zodanig, als een CFSE-gelabelde cel zich deelt, zijn nakomelingen hebben de helft van de fluorescentie, die daarmee kan worden gebruikt om de celdeling te beoordelen. Dit artikel beschrijft de procedures doorgaans gebruikt voor het labelen muis lymfocyten met CFSE.

Het gebruik van carboxyfluoresceïne diacetaat succinimidylester (CFSE) om lymfocytproliferatie Monitor

In this video, we describe a protocol for genetically engineering glioma cells to express infrared fluorescent protein or iRFP. These fluorescent-tagged glioma cells hold utility in deep tissue imaging to understand the development of brain tumors.

Fluorescent Labeling of Glioma Cells: A Lentiviral Vector-based Transfection Method to Obtain Glioma Cells Expressing Fluorescent Protein for Deep Tissue Imaging

Source: Pericoli, G. et. al., Live-3D-Cell Immunocytochemistry Assays of Pediatric Diffuse Midline Glioma. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates live cell imaging to observe pediatric diffuse midline glioma cell migration using immunohistochemical labeling with anti-CD44 antibodies.

Immunocytochemistry-Based Imaging for Visualizing Pediatric Glioma Cell Migration

Source: Parker, J. J., et al. A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs. J. Vis. Exp. (2017)This video showcases the imaging of glioblastoma tissue slices expressing green fluorescent protein (GFP) via confocal microscopy. High-resolution images are captured at consistent intervals to track tumor cell movement and direction.

Imaging Tumor Cell Migration in Glioblastoma Tissue Using Time-Lapse Scanning Confocal Microscopy

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Een efficiënte screening-protocol wordt gepresenteerd voor de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van astroglial differentiatie in glioblastoma stamcellen (GSCs). De bepaling is gebaseerd op een stamcel differentiatie verslaggever waarbij de expressie van de verbeterde GFP (eGFP) wordt gedreven door de menselijke promotor van het algemeen kaderakkoord voor vrede.

Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Orthotopic intracraniële injectie van tumorcellen wordt in kankeronderzoek te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons uitgegaan. Hier presenteren we fluorescentie moleculaire tomografie van tumor xenografts, die biedt real-time intravital imaging en kwantificering van een tumor massa in preklinische glioblastoma modellen.

Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts

Gepresenteerd hier is een protocol voor het meten van prolifererende CD4+ T cellen in reactie op antigene eiwitten of peptiden met behulp van kleurstof verdunning. Deze bepaling is bijzonder gevoelig voor zeldzame antigeen-specifieke T-cellen en kan worden gewijzigd om het klonen van antigeen-specifieke cellen te vergemakkelijken.

Kwantificering van prolifererende humane antigeen-specifieke CD4+ T-cellen met behulp van Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Hier presenteren we een eenvoudig te gebruiken co-cultuurtest om glioblastoom (GBM) migratie op neuronen met patronen te analyseren. We ontwikkelden een macro in FiJi-software voor eenvoudige kwantificering van GBM-celmigratie op neuronen en merkten op dat neuronen GBM-celinvasieve capaciteit wijzigen.

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

We rapporteren een techniek die live beeldvorming mogelijk maakt van microtubule dynamica in glioblastoom (GBM) cellen die een gewerveld hersenweefsel binnendringen. Door de orthotopische injectie van fluorescerend gelabelde GBM-cellen te koppelen aan een transparant zebravisbrein met intravitale beeldvorming met hoge resolutie, kan de cytoskeletdynamiek worden gemeten tijdens in situ kankerinvasie.

Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen

We presenteren een 3D-glioblastoommigratiemodel met behulp van door patiënten afgeleide magnetische gliomasferen, gegenereerd uit nieuw gediagnosticeerde en terugkerende tumoren. Dit platform maakt het mogelijk om patiëntspecifieke migratiedynamiek te visualiseren en de therapeutische effectiviteit te beoordelen. De assay kan na migratie worden gemultiplexed om eiwitlokalisatie en expressiepatronen te evalueren.

Reproducerbare 3D glioblastoom migratietest met magnetische nanodeeltjesgemedieerde sferoidlokalisatie onder hypoxische omstandigheden

Leer de identificatie en isolatie van langzaam delende cellen in menselijk glioblastoom met CFSE-kleuring en flowcytometrie. Deze methode helpt onderzoekers tumoerheterogeniteit te begrijpen en gerichte therapieën te ontwikkelen.

Identificatie en isolatie van Slow-delende cellen in Human Glioblastoma Met behulp van Carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE) (Video) | JoVE Journal

Identificatie en isolatie van Slow-delende cellen in Human Glioblastoma Met behulp van Carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE)

Meer video's verkennen