Identificatie en isolatie van Slow-delende cellen in Human Glioblastoma Met behulp van Carboxy fluoresceïne succinimidylester (CFSE)

Dit videoprotocol demonstreert de identificatie en isolatie van langzaam delende cellen in menselijk glioblastoom met behulp van carboxyfluoresceïne-diacetaat, CFSE. Glioblastoomtumorcellen worden eerst gekweekt met behulp van de neurosfeer-assay. Vervolgens worden de resulterende sferen gedissocieerd tot enkelvoudige cellen en gekleurd met CFSE.

De met CFSE gelabelde cellen worden opnieuw uitgeplaat. In de neurosfeer-cultuur worden de resulterende sferen gedissocieerd tot enkelvoudige cellen en door de flowcytometer geanalyseerd. Langzaam en snel delende cellen worden geïdentificeerd en gesorteerd op basis van de fluorescentie-intensiteit als functie van de celdeling.

Frequentieheterogeniteit is een essentieel kenmerk van kanker. Deze heterogeniteit ondersteunt de robuustheid van de tumor en vormt een groot obstakel voor de ontwikkeling van volledig effectieve behandelingen. Daarom is het van cruciaal belang om instrumenten en assays te ontwikkelen om deze heterogeniteit, die genetisch, fenotypisch en functioneel is gedefinieerd, te bestuderen en te begrijpen.

In dit videoprotocol beschrijven we een standaardmethode met behulp van de flues en I-C-F-S-C. Deze techniek maakt de identificatie en scheiding via flowcytometrie mogelijk van individuele subpopulaties binnen een cultuur van menselijke glioblastoom-afgeleide cellen die verschillende functionele kenmerken bezitten. We hebben deze techniek gebruikt om een tumorpopulatie van cellen te isoleren en te karakteriseren die een trage delingssnelheid vertoont, een functionele eigenschap waarvan is aangetoond dat deze geassocieerd is met tumorinitiatie in kanker. De Gliomas sphere Culture wordt opgezet en onderhouden met behulp van de neuros sphere assay, die wordt beschreven in een aparte video op het adres op het scherm.

Wanneer de glioom-sferoïden een diameter van 150 tot 200 µm bereiken, wordt het medium dat de sferoïden bevat verwijderd en in een steriele kweekbuis van passende grootte geplaatst en gecentrifugeerd bij 800 RPM of 110 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens wordt het supernatant weggegooid en wordt het pellet van sferoïden geresuspendeerd in 1 mL voorverwarmde trypsine-EDTA en geïncubeerd bij 37 °C in een waterbad gedurende drie tot vijf minuten. Er wordt vervolgens een gelijk volume trypsineremmer toegevoegd, waarbij voorzichtig met de pipet op en neer wordt bewogen om de sferoïden te dissociëren.

De cel-suspensie wordt opnieuw gecentrifugeerd. Het supernatant wordt verwijderd en de cellen worden geresuspendeerd in 1 ml neuro stem cell basal medium. 10 µL van de single-cell suspensie wordt goed gemengd met 90 µL trypaanblauw en er wordt een celtelling uitgevoerd voor elke 1 miljoen cellen die gekleurd moeten worden.

Eén ml kleuringsreagens wordt bereid door één µL van vijf millimolaire CFSE-kleurstof toe te voegen aan één ml basaal medium voor neurale stamcellen, om een uiteindelijke kleuringsconcentratie van vijf micromolair te verkrijgen. Vervolgens wordt de kleuringsoplossing goed gemengd. Het gewenste aantal cellen wordt daarna overgebracht naar een aparte buis, gecentrifugeerd en het supernatant wordt verwijderd.

De CFSE-kleuringsoplossing wordt vervolgens aan de pellet toegevoegd en voorzichtig gemengd tot homogeniteit en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd om het kleuringsproces te stoppen. Vijf tot 10 volumes ijskoud basaal medium voor neurale stamcellen worden toegevoegd aan de CFSE-geladen cellen en goed gemengd. De celsuspensie wordt vervolgens gecentrifugeerd en het supernatant wordt verwijderd.

Op dit punt moet er onderin de buis een pellet van cellen verschijnen met een groenige tint, wat aangeeft dat de kleuring is geslaagd. Om overtollige CFSE-kleurstof te verwijderen, worden twee tot drie wasbeurten uitgevoerd door de pellet te resuspenderen in 1 ml neuro stem cell basal medium, te centrifugeren en het supernatant weg te gooien.

Na de derde wasbeurt worden de cellen geresuspendeerd in 1 ml neuro stem cell basal medium, en er wordt een cel telling uitgevoerd zoals eerder beschreven om de cellen uit te platen. Compleet neuro stem cell medium wordt aangevuld met EGF tot een eindconcentratie van 20 ng/ml. Vervolgens worden de cellen van de CFSE-geladen en ongeladen groepen toegevoegd aan hun respectievelijke buisjes om een eindconcentratie van 50.000 cellen/ml te bereiken.

Vervolgens worden de cel-suspensies grondig gemengd en uitgeplaat in steriele weefkulturflessen. De flessen worden daarna gelabeld. De cellen kunnen onder een fluorescentiemicroscoop worden gecontroleerd om de CFSE-kleuring te verifiëren, waarna ze gedurende vijf tot 10 dagen in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 worden geplaatst.

Om de CFSE-kleuring met flowcytometrie te verifiëren, worden 500 000 cellen van de CFSE-geladen groep en de niet-geladen negatieve controlegroepen overgebracht naar afzonderlijke fax-buisjes. De flowcytometer wordt ingesteld volgens de instructies in de gebruikershandleiding voor de relevante parameters. Eerst worden de niet-geladen controlecellen geanalyseerd en worden de events geregistreerd op basis van forward scatter- en side scatter-eigenschappen; vervolgens wordt in een histogramplot, waarin de celfrequentie tegenover de CFSE-intensiteit is uitgezet, de belangrijkste celpopulatie gegated om het niveau van de CFSE-fluorescentie-intensiteit te verifiëren.

Vervolgens worden de met CFSE gelabelde cellen geanalyseerd met dezelfde parameters als voor de controlecellen, zoals duidelijk zichtbaar is. De CFSE-positieve cellen vertonen een fluorescentie-intensiteit die vele malen hoger is dan die van de controlecellen. Wanneer de glioomsferen een gemiddelde grootte van ongeveer 150 tot 200 microns in diameter hebben bereikt.

De sferoïden worden gepasseerd en er wordt een enkelcellige suspensie bereid van zowel de met CFSE beladen als de onbeladen groepen, zoals eerder beschreven. Vervolgens worden de cellen resuspenderd in een passend volume steriele 1x PBS en wordt een cel telling uitgevoerd om dode of beschadigde cellen uit te sluiten. Bij sortering via flowcytometrie wordt propidiumjodide toegevoegd in een concentratie van 1 µL per ml celsuspensie om langzaam delende en snel delende cellen te verzamelen.

Voor het sorteren worden twee steriele 15 ml weefselkweekbuisjes klaargemaakt, elk gevuld met één ml compleet medium voor neurale stamcellen. Vervolgens worden de cellen op ijs geplaatst tijdens het transport naar de flowcytometrie-faciliteit. Eerst wordt de celsuspensie van de onbeladen celgroep door de flowcytometer gehaald.

De gebeurtenissen worden uitgezet op basis van forward scatter versus side scatter om dode of beschadigde cellen uit te sluiten. Cellen worden uitgezet op basis van side scatter versus PI-reactiviteit en een enkele levende celpopulatie wordt geselecteerd als populatie één. Vervolgens wordt een homogene celpopulatie uit populatie één geselecteerd op basis van forward- en side-scatter-eigenschappen en geselecteerd als populatie twee. Populatie twee wordt daarna uitgezet in een histogram op basis van celfrequentie versus CFSE-intensiteit op een logaritmische schaal, met gebruik van dezelfde parameters en gating-strategie.

De met CFSE gelabelde cellen worden door de flowcytometer geleid en geanalyseerd. Vervolgens worden de onderste 85% van de cellen gegated als snel delend en de bovenste 5% als langzaam delende cellen. Deze verschillende celpopulaties van belang worden geselecteerd en gesorteerd in afzonderlijke steriele weefselkweekbuisjes van 15 ml die één ml volledig neuro-stamcelmedium bevatten.

De sorteerdrempelwaarde moet worden aangepast zodat deze 2.500 events per seconde niet overschrijdt. Na voltooiing van de sortering worden de cellen gecentrifugeerd, wordt het supernatant weggegooid en wordt het pellet geresuspendeerd in een geschikt volume medium, waarna een cel telling wordt uitgevoerd. Vervolgens worden de cellen uit de verschillende gesorteerde populaties uitgeplaat met een dichtheid van 50.000 cellen per ml.

In comple neurostammencellenmedium, aangevuld met 20 nanogram per ML EGF, worden de cellen vervolgens vijf tot 10 dagen geïncubeerd om sferoïden te laten groeien. Dit is een voorbeeld van cellen. Kort na belading met CFSE-kleurstof vertonen alle cellen een intense groene fluorescentie, zoals gevisualiseerd onder de fluorescentiemicroscoop.

Dit is een afbeelding van een representatieve gliomsfeer, afgeleid van cellen geladen met A-C-F-S-E, zes dagen na het uitplaten. Let erop dat sommige cellen nog een zeer felle CFSE-kleuring vertonen. Dit is een voorbeeld van een flowcytometrie-histogram dat laat zien dat de CFSE-intensiteit na verloop van tijd afneemt.

Blauw stelt de cellen voor die vers zijn geladen met CFSE, waarbij de fluorescentie-intensiteit zichtbaar is. Deze is orden van grootte hoger dan die van de niet-geladen cellen, weergegeven in rood. Groen stelt de fluorescentie-intensiteit voor die over een periode van zes dagen na het laden met CFSE is afgenomen als gevolg van celdeling.

Dit zijn representatieve sferen die zeven dagen na het isoleren van snel en traag delende populaties zijn gegroeid. De frequenties van sfeervorming verschillen niet tussen de twee groepen, maar de cellen die CFSC behouden groeien langzamer en resulteren in kleinere sferen vergeleken met de CFSC-verdunningscellen. Het gebruik van CFSC om subpopulaties van cellen te identificeren en te isoleren op basis van de delingssnelheid is een uitgangspunt voor downstream experimenten en verdere karakteriseringen.

Dit protocol biedt een voorbeeld voor het identificeren van langzaam delende cellen in een kweek afgeleid van menselijk glioom, maar het kan ook worden toegepast op andere typen tumorcellen of op niet-kankerogene systemen. Bedankt voor het kijken en we hopen dat u dit protocol nuttig vindt voor uw onderzoek.