Met behulp van gefixeerde, bevroren weefsels naar Natural Mucine Distribution Studie

Het algemene doel van het volgende experiment is om de natuurlijke glycosyleringsdistributie van uitgescheiden mucus in weefselmonsters te behouden. Dit wordt bereikt door de weefsels eerst in te bedden in optimal cutting temperature medium (OCT) om de weefselverwerking te minimaliseren, om vervolgens de detectie van glycaanstructuren, mucine en mucus mogelijk te maken. De coupes worden geïncubeerd met lectines, antilichamen en histochemische kleurstoffen.

Lectinebinding kan verder worden getest door competitieve inhibitie of enzymatische splitsing van glycaan-epitopen om de specificiteit van de lectinebinding te bevestigen. Uiteindelijk kan de conservering van slijm en ingevroren weefselmonsters worden vergeleken met de conservering van slijm in paraffine-ingebedde monsters via mystieke chemische analyse. De belangrijkste voordelen van het gebruik van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het inbedden van weefsel in paraffine en fixatie met carnoseus-oplossing, zijn dat deze methode geen gebruik maakt van gespecialiseerde fixatiemiddelen en dat het gebruik van ingevroren weefsels mogelijk maakt die wellicht al in het laboratorium aanwezig zijn.

Begin met het laten opwarmen van het snap-gevroren weefsel tot -20 °C door het in een cryomicrotoomkamer te plaatsen. Maak ondertussen een vriesbad door methylbutaan toe te voegen aan een ondiepe piepschuimdoos en vervolgens droogijs aan de doos toe te voegen. Voeg daarna net genoeg OCT toe om de bodem van een peel-away vriesvorm te bedekken en plaats vervolgens het weefsel in de vorm.

Zorg ervoor dat het weefsel op de bodem van de mal rust in de gewenste oriëntatie. Bedek het weefsel met meer OCT en plaats de mal vervolgens in het vriesbad. De OCT-compound wordt wit naarmate het weefsel bevriest. Zodra het bevroren is, pelt u de mal van het bevroren blok en plaatst u het blok in een gemarkeerd vrieszakje.

Bewaar de ingevroren blokken bij min 80 graden Celsius tot aan het gebruik voor het doorsnijden van het weefsel. Plaats de betreffende ingevroren blokken gedurende ongeveer 30 minuten in de cryomicrotoomkamer om ze een temperatuur van min 20 graden Celsius te laten bereiken. Zodra de blokken opgewarmd zijn, snijdt u een sectie van drie tot vijf micrometer dik en plaatst u vervolgens een positief geladen glazen objectglas bovenop de sectie.

Het weefsel zal aan de objectglas hechten nadat de weefsels 30 tot 60 minuten aan de lucht zijn gedroogd. Fixeer de objectglazen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 10% gebufferde formaline en was de objectglazen vervolgens drie keer in PB PBS door ze 10 keer kort in 250 milliliters buffer te dippen om weefsels te kleuren met aum. Blue eerst, spoel de objectglazen met water en incubeer ze vervolgens gedurende drie minuten in 3% azijnzuur.

Incubeer vervolgens de weefsels met AUM-blauwoplossing. Was de coupes na 30 minuten gedurende 10 minuten onder stromend kraanwater en spoel ze daarna met DI-water. Kleur de kernen tegen met nuclear fast red gedurende vijf minuten en was de coupes vervolgens drie keer met DI-water. Dehydrateer en maak de coupes nu transparant door ze één minuut te incuberen in 95%ethanol, gevolgd door drie snelle wissels in 100%ethanol en daarna drie wissels in citrus resolve gedurende telkens twee minuten.

Plaats tot slot een dekglas op de objectglas met een montagemedium zoals cyto seal 60 om weefsels te kleuren met periodischzuur-Schiff. Spoel eerst de objectglazen met water en incubeer ze vervolgens gedurende vijf minuten met vers bereide 1% periodischzuur. Was de objectglazen nu drie keer met di water.

Dompel de objectglazen eenmaal in Milli Q-water en kleur de weefsels vervolgens met Schiff-reagens. Was de objectglazen na 15 minuten nog 10 minuten onder stromend kraanwater en dompel ze daarna eenmaal in gedestilleerd water. Kleur de kernen tegen met sgio metine gedurende 30 seconden en was de objectglazen vervolgens drie keer met gedestilleerd water.

Incubeer de coupes tot slot gedurende 30 seconden. Was drie keer extra met DI-water in Scot's tap water bluing reagent, en dehydrateer vervolgens de weefsels zoals zojuist is aangetoond voor calcium-blauwkleuring. Monteer de coupes met een dekglas voor fluorescentiedetectie van glycaan-epitopen met behulp van lectinen.

Blokkeer eerst de slide met BSA in PBS gedurende 10 tot 30 minuten. Blokkeer vervolgens het endogene biotine door de slide 15 minuten te incuberen met avadon, gevolgd door een wasbeurt met PBS, en daarna een incubatie van 15 minuten met 0,01% biotine na nog een wasbeurt met PBS. Plaats de slide in een kleuringsbak, breng een vers bereid mengsel van de gewenste lectinen aan op elke weefselsectie en dek het lectinenmengsel vervolgens voorzichtig af met parfum.

Incubeer de objectglas nu gedurende één uur in het donker. Verwijder voorzichtig het parfum en was het objectglas drie keer met PBS. Bedek het objectglas vervolgens met strep avid in geconjugeerde SCI vijf en incubeer het opnieuw in het donker na 30 minuten, was de objectglazen drie keer met PBS en kleur vervolgens de kernen tegen met dappy.

Monteer tenslotte de slide met een dekglas met behulp van een waterig medium, zoals vector mount monteermedium voor de sase-enzymcontrole. Begin met het toevoegen van water aan de bodem van een lege tipdoos om een vochtige kamer te creëren. Plaats de slides van de negatieve controle met de bovenkant naar boven op het bovenste plateau van de tipdoos.

Breng 150 tot 200 µL van een US-oplossing aan op de weefselcoupes en dek vervolgens elk objectglas af met een dekglas, waarbij luchtbellen worden vermeden. Sluit het deksel van de doos en incubeer de doos gedurende twee en een halve uur bij 37 °C. Was de objectglazen drie keer met PBS bij kamertemperatuur om alle vrije slic-zuren te verwijderen.

Incubeer de coupes vervolgens een uur bij kamertemperatuur met SNA voor de competitieve inhibitie. Verdeel 200 µL van het lectinemengsel als controle-aliquot over twee Eppendorf-buisjes. Voeg vervolgens 200 mM van de SNA-inhibitor melibiose toe aan één van de buisjes en voeg het WGA-inhibitor chitinestrol bij een verdunning van 1:10 toe aan het andere buisje.

Incubeer de coupes vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur met de mengsels die de inhibitor bevatten. In deze eerste figuur zijn coupes van colonmonsters van cumin-muizen of kippen, bevroren in OCT of ingebed in paraffine, gekleurd met periodisch zuur-Schiff in roze of calciumblauw in blauw. Een vergelijking tussen in paraffine ingebedde weefselmonsters en bevroren weefsels ingebed in OCT-cryoprotectiemedium onthulde opvallende verschillen in de preservering en de kwaliteit van de kleuring voor mucine-glycoproteïnen in de bevroren weefsels.

Naast mucine in slijmbekercellen was ook uitgescheiden slijm zichtbaar, zoals aangegeven door de pijlen in de in paraffine ingebedde weefsels. De slijmkleuring was beperkt tot de slijmbekercellen. In deze figuur kan het substantiële verlies van mucine en weefsels worden waargenomen die zijn geïncubeerd in citrus resolve.

Seriële coupes van bevroren kip-ileummonsters werden gefixeerd in 10% gebufferde formaline en gehydrateerd gehouden, gedehydrateerd in ethanol door opeenvolgende incubatie in 70%, 90% en 100% ethanol gedurende elk 20 minuten, of gedehydrateerd in ethanol en vervolgens gedurende één uur geklaard met citrus oil. Alleen ethanol-dehydratie en ethanol-dehydratie gevolgd door klaring met citrus oil verbeterden de weefselmorfologie. Verdere ethanol-dehydratie alleen had geen significant effect op de blauwe kleuring.

In tegenstelling hiermee reduceerde de incubatie van citrus alle blauwe kleuring en beperkte deze tot de bekercellen in een patroon dat vergelijkbaar was met dat van de in paraffine ingebedde weefsels uit de vorige figuur. De kaders geven de gebieden van hogere vergroting aan in de weefselcoupes met allium blauwe kleuring. In deze volgende reeks beelden worden specimens van chicken ileum getoond die zijn ingevroren in OCT of ingebed in paraffine en vervolgens zijn gesondeerd met Jacqueline in blauw, SWG in groen en SNA in rood in bevroren weefsels.

Binding van Jacqueline aan olink-glycanen onthulde structuren die leken uit de bekercellen in het lumen te sijpelen, zoals aangegeven door de pijlen in de OCT-bevroren weefselcoupe. Daarentegen was de binding van Jacqueline aan paraffine-ingebed weefsel beperkt tot de bekercellen en de borstelzoom van de villi, aangegeven door deze pijlen. SWGA-kleuring van bèta 1-4 GL colocaliseert gedeeltelijk met de binding van het Jacqueline-lectine in zowel bevroren als paraffine-ingebed weefsel, zoals aangegeven door de pijlen.

In tegenstelling hiermee bindt SNA-lectine, in het rood en aangegeven door de pijlpuntjes, intracellulair aan alfa twee zes-gekoppelde sialinezuren en colocaliseert het niet met Jacqueline, dat blauw is en in deze figuur wordt aangegeven met de gestreepte pijlen. Sialinezuurepitopen werden van kluikileummonsters gesplitst door de weefselcoupe te behandelen met een neuraminidase, of ze bleven ongesplitst door incubatie in natriumacetaatbuffer, zoals hier te zien is. De behandeling met neuraminidase hief de kleuring met gebiotineerd SNA op die in het onbehandelde weefsel werd waargenomen, wat de bindingsspecificiteit van SNA voor sialinezuren bevestigt.

Lectinspecificiteit kan ook worden bevestigd door een competitieve remmer toe te voegen, zoals melybios voor Jacquelyne-kleuring of chitinestrol voor SWGA-kleuring. Monsters van de kip-ileum werden opnieuw geïncubeerd met een mengsel van Jacquelyne en SWGA. Ditmaal gebeurde dit ook in de aanwezigheid van specifieke lectinremmers, melybios of chitinestrol. De Jacquelyne-kleuring werd geremd door melybios, maar niet door chitinestrol. Omgekeerd werd de SWGA-kleuring geremd door chitinestrol, maar niet door melybios.

Deze laatste reeks beelden demonstreert dat vries-fixeerde weefselmonsters, die routinematig in de kliniek en in onderzoekslaboratoria worden verkregen, verder kunnen worden ingebed in OCT en gebruikt kunnen worden om glycanen op mucine, glycoproteïnen, glycolipiden en glycanen te bestuderen. Deze colorectale kankersbiopten van villeus carcinoom- en mucuscarcinoomweefsels werden snap-frozen in vloeibare stikstof, ingebed in OCT en succesvol gekleurd voor de verschillende aangegeven mucine- en glycaan-epitopen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe weefsels in OCT ingebed moeten worden en hoe slijm- en weefselglycosylering geanalyseerd kan worden met immunochemische methoden.