Electroantennographic Bioassay als een screeningsinstrument voor Host Plant Vluchtige stoffen

Het algemene doel van deze procedure is om snel een groot aantal vluchtige stoffen van waardplanten te screenen op potentiële biologische activiteit. Dit wordt bereikt door eerst de vluchtige stoffen van de betreffende waardplant te verzamelen en te analyseren via GCMS. Vervolgens worden de chemische componenten geïdentificeerd en geverifieerd.

De derde stap is het screenen van de individuele componenten in voldoende herhalingen op bioactiviteit via electrografische analyse. De laatste stap is het formuleren en evalueren van mengsels van actieve componenten. Uiteindelijk kunnen de resultaten leiden tot een gereduceerde reeks componenten of een mengsel van componenten dat gereed is voor verder onderzoek in gedragsstudies met het betreffende insect.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals tijdrovende gedragsstudies, is dat snelle screening via elektrographische analyse het aantal verbindingen dat nodig is voor andere studies ter demonstratie van een procedure aanzienlijk vermindert. Is MR Wage een technicus voor mijn laboratorium? Zodra de relevante vluchtige stoffen zijn geïdentificeerd door gaschromatografie en massaspectrometrie, is het mogelijk om eerst een elektro-iconografische analyse of EAG uit te voeren voor elke beschikbare vluchtige stof.

De beschikbare vluchtige stoffen moeten echter eerst worden voorbereid. Bereid in een luchtdicht afsluitbare container, die bewaard kan worden bij 4 °C, voor elke vluchtige stof een oplossing in pentaan met een concentratie van 5 mg/mL. Bereid vervolgens de stimuluspipetten.

Label 10 Pasteurpipetten per vluchtige stof en wikkel hun uiteinden in een klein stukje Parafilm. 10 pipetten zijn voldoende om de vluchtige stof aan elk geslacht toe te dienen in een voorlopige screening met een laag aantal herhalingen. Plaats nu de overgebleven set van vijf pipetten in een rek en plaats in het open uiteinde van elke pipette een bioassay-schijfje.

Vouw een schijfje voorzichtig met een pincet en plaats het gedeeltelijk in het brede uiteinde van de pipet, zodat twee tot drie millimeter van het schijfje bloot blijft liggen. Breng met een pipethulp of spuit 10 µL van de vluchtige oplossing aan op elk schijfje. Het is uiterst belangrijk om de oplossingen correct te berekenen, te formuleren en voor te bereiden om consistente replica's te garanderen.

Wacht twee minuten en duw de schijven vervolgens volledig in de pipetten. Zodra ze zijn geladen, wordt elke pipet onmiddellijk afgesloten met param. Herhaal deze pipetvoorbereiding voor het gewenste aantal replica's.

Gebruik hetzelfde protocol. Bereid een negatieve controle van alleen pentanen en positieve controles voor, in dit geval acetofenon en geslachtshormoon. Ga nu verder met het prepareren van de insectenantennen.

In dit experiment brengt een voorversterker het signaal van een vorkelektrode over naar het EAG-acquisitie-instrument. De software die bij het EAG-instrument wordt geleverd, moet in de software op de juiste wijze worden geconfigureerd. Configureer de instellingen door eerst de bemonsteringssnelheid in te stellen op 106,7.

Zet de rectify-schakelaar op 'know' en stel het filter in op 0 tot 42 hertz onder het tabblad filter. Zet het EAG-filter op 'on' en stel de lage afsnijfrequentie in op 0.1 hertz. Sla de instellingen vervolgens op in een configuratiebestand voor toekomstig gebruik.

Het bedienen van het programma is vervolgens zo eenvoudig als het openen van een nieuw projectbestand, het opslaan ervan onder een specifieke naam en het starten van een opname. Het rode driehoek-icoon start het opnameproces en blijft ingeschakeld voor een vooraf bepaalde tijd voor elke individuele puff. Wanneer alle puffs voor de antennes zijn uitgevoerd, stopt het zwarte X-icoon de opname om de EAG-responsen gemakkelijker en nauwkeurig leesbaar te maken.

Een kleine liniaal kan met plakband op het computerscherm worden bevestigd bij de basislijn van het signaal. De respons wordt in millimeters geregistreerd en vervolgens omgezet naar de amplitude in microvolts. Indien nodig kunnen de opnames worden afgespeeld voor verdere evaluatie.

In dit voorbeeld worden drie tot vier dagen oude mannelijke naval orange motten en gepaarde vrouwelijke motten gebruikt. Dit protocol kan echter worden aangepast aan andere insecten. Breng elk insect over naar een klein plastic bakje met een deksel.

Voer op de dag van de analyse, vlak voor de bioassay, het insect in de grote opening van een pipetpunt, die een kleinere opening heeft die net groot genoeg is om de kop erdoorheen te laten passen. Duw het insect vervolgens met een kleinere pipetpunt voorzichtig naar de kleinere opening totdat de kop onder een stereoscoop zichtbaar is. Zorg ervoor dat de antennes zijn vastgezet in de houderbuis en dat de basis van de antennes is blootgesteld voor excisie.

Plaats vervolgens de vorkhouder met een dun laagje elektrodegel vlakbij de antenne. Vrijmaken met microschaartjes, vervolgens beide antennes excideren en een timer starten om de tijd tussen dit moment en de daaropvolgende stimuli vast te leggen. Pak met een gereedschap met een draadpunt en een stipje gel op het uiteinde één antenne op en plaats deze op de vork. Zorg ervoor dat de basis van de antenne op de niet-rode, onverschillige randelektrode van de vork wordt geplaatst.

Doe hetzelfde voor de tweede antenne. Plaats de basis van de antenne aan dezelfde zijde van de vork, twee tot drie millimeter verwijderd van de reeds geplaatste antenne. Trim de uiteinden van de antenne indien nodig.

Breng met een penseel elektrodegel aan en zorg ervoor dat zowel de basis als de punt in de elektrodegel zijn ondergedompeld, zodat er geen luchtbellen in de gel aanwezig zijn. Vermijd het bedekken van het centrale gedeelte van de antenne met gel om het oppervlak van de antenne dat wordt blootgesteld aan de wolk vluchtige stoffen te maximaliseren. Zodra de preparatie correct is gegeld, wordt de vork aangesloten op de voorversterker van de probe.

Breng nu een stroom bevochtigde lucht aan over het preparaat om de levensvatbaarheid van het antennepreparaat te behouden. Ga 10 minuten na het moment van excisie over tot het aanbrengen van de eerste stimuli. De volgorde van handelingen voor het stimuleren van een preparaat begint en eindigt met een positieve controle, waarbij tussentijds wordt gestimuleerd met een gerandomiseerde reeks verbindingen zonder identieke opeenvolgende verbindingen, en met ten minste één negatieve controle; het aantal verbindingen dat aan een antenne wordt toegediend, varieert per soort.

Een preparaat van een naval orange worm moth kan meer dan 30 minuten actief blijven, waardoor tot 10 vluchtige stoffen gemakkelijk geanalyseerd kunnen worden met een laag aantal replicates. Ditzelfde principe van monstertoevoer is van toepassing op daaropvolgende screenings van mengsels van verbindingen die in de preliminaire screening responsen opwekten. De eerste stimuluspipet moet 30 seconden voor het toedienen van de puff worden klaargemaakt; verwijder de afsluiting van de pipet en plaats deze in de houder zodat de luchtstroom twee tot drie millimeter van de antennes wordt gericht, 10 minuten na de excisie van de antennes.

Dien de eerste stimuluspuff gedurende één tot twee seconden toe met een snelheid van 300 milliliters per minuut. Vervang nu snel de pipet, zodat de tweede stimulus precies één minuut na de eerste wordt toegediend. Consistentie tussen de monsters zal de variabiliteit van de daadwerkelijk toegediende hoeveelheden vluchtige stoffen minimaliseren.

Nadat de laatste positieve controle-puff is toegediend, verwijdert u de antenne en reinigt u de vork. Gebruik hiervoor een met ethanol verzadigd doekje en laat het geheel volledig drogen voor volgend gebruik. Om de doorvoer van de assays te verhogen, dient een assistent de volgende antenne met schone vorken voor te bereiden 10 minuten voordat de vorige voorbereidingen zijn afgerond.

Testreeks, voor deze methode is meer dan één vork noodzakelijk. Euthanaseer na elk experiment de testmotten in een omgeving met droogijs en ontleed de vrouwelijke motten om hun paringsstatus te controleren. Ga ervan uit dat de samenwonende mannetjes gepaard moeten zijn; navel sinaasappelworm-antenne preparaties werden gestimuleerd met puffs van twee seconden en er werden opnames van tien seconden gemaakt met een venster van tien seconden op een schaal van vijf millivolt.

Een negatieve afbuiging was de typische respons. Desondanks werden de absolute waarden geregistreerd. Alle preparaten van vrouwtjes met een zwakke respons op de positieve controle werden verworpen.

De gemiddelde respons van de overige preparaten was 2 600 microvolts. Evenzo was de gemiddelde respons van mannetjes op de pH-controle voor geslacht doorgaans 3000 microvolts. Daarom werden dieren met een ondermaatse respons uitgesloten; gegevens van antennes die tijdens de proef een verslechterde respons vertoonden, werden eveneens weggelaten.

Degradatie trad op indien de Anton-respons op de puff van de laatste positieve controle minder dan 75% was van de eerste puff van de pre-con controle, of minder was dan de tweede puff van de pre-con controle voor de resterende experimentele runs. De responswaarden werden geanalyseerd door de ruwe metingen van elke run te nemen en de respons van de negatieve controle van die run af te trekken van elke waarde in die run. Vervolgens werden alle positieve controles in elke run gemiddeld en gecorrigeerd naar 1000 Microvolts, waarbij de correctieratio naar 1000 microvolts voor elke run werd genoteerd.

De waarden voor de geteste verbindingen werden vervolgens vermenigvuldigd met de correctieratio van de positieve controle. Ten slotte werd de gemiddelde gecorrigeerde respons van elke geteste verbinding over alle runs vergeleken om de geschiktheid van elke verbinding voor verder onderzoek te evalueren. Vergeet niet dat het werken met chemicaliën extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd passende voorzorgsmaatregelen moeten worden getroffen.