Een vloeibare fase Affiniteit Capture test met behulp van magnetische korrels aan eiwit-eiwit interactie te bestuderen: het poliovirus-Nanobody Voorbeeld

Dit protocol gebruikt de interactie tussen poliovirus en Poliovirus, herkenning van nanolichamen om een eenvoudige kwantitatieve vloeistof fase affiniteitsvangstanalyse te demonstreren. Hoofdzakelijk worden kobalt gecoate magnetische kralen gebruikt om gelabelde eiwitten te laten neerslaan, evenals eventuele interacterende radiogelabelde eiwitten. Meng eerst de gelabelde en gemerkte eiwitten en incubeer bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens magnetische kralen toe die de tag herkennen, scheid de gebonden fractie van gelabeld eiwit van de vrije fractie met behulp van magneten. Meet vervolgens het signaal van het gelabelde eiwit gevonden in de vrije fractie en bepaal de hoeveelheid gelabeld eiwit gevonden in de vrije fractie. Resultaten van deze vloeistof fase affiniteitstest zijn uiterst nuttig wanneer conformationeel conversieve gevoelige eiwitten worden getest.

Deze vloeistof fase affiniteitsvangstanalyse kan inzicht geven in de interactie tussen poliovirus, herkenning van nanolichamen en verschillende poliovirus antigenen. De methode kan ook worden toegepast op andere eiwit-eiwit interacties, op voorwaarde dat één eiwit kan worden gelabeld en het andere kan worden gedetecteerd. We hadden voor het eerst de ID voor deze methode toen we geïnteresseerd waren in het onderzoeken van de interactie tussen poliovirus, herkenning van nanolichamen en verschillende poliovirus antigenen.

Aangezien poliovirus gevoelig is voor conformationele conversie, wanneer het aan een vast oppervlak is bevestigd, is het gebruik van e LSA beperkt. Een op vloeistof gebaseerd systeem moet daarom worden geprefereerd. Een voorbeeld van een dergelijk op vloeistof gebaseerd systeem dat vaak wordt gebruikt in poliovirusonderzoek is de microproteïne.

Een immunoprecipitatietest. Hoewel deze test zijn toepasbaarheid heeft bewezen, vereist deze de gekristalliseerde structuur van een conventioneel antilichaam, die afwezig is in nanolichamen. Deze nanolichamen, die interessante en zeer stabiele enkeldomein antilichamen zijn, kunnen gemakkelijk worden geënginnerd met verschillende teksten.

De wijd gebruikte. Het stapel toont affiniteit voor bivalente ionen, zoals nikkel en kobalt, die op hun beurt gemakkelijk kunnen worden gecoat op magnetische kralen. We ontwikkelden daarom de eenvoudige kwantitatieve affiniteitsvangstanalyse op basis van kobalt gecoate magnetische kralen.

Reese's de voorraad magnetische kralen door te vortexen en breng 10 microliter voor elk monster over naar een buis, pellet de kralen met behulp van een magneet. Verwijder de heldere supinaat om de kralen te wassen. Voeg 150 microliter bindingsbuffer toe.

Verzamel de kralen met behulp van een magneet en verwijder de supinaat na een tweede wassing. Re-suspendeer de kralen in 40 microliter bindingsbuffer voor elk monster om te controleren. Voor de achtergrond in monster één, bereid een putje voor zonder radiogelabeld virus, maar met gelijk volume bindingsbuffer voor controle.

Monster twee van 100% radioactiviteit. Voeg alle componenten toe in een putje, behalve vervang de nano body met bindingsbuffer. Voeg nu 2000 tellen per minuut van S 35 gelabeld poliovirus zeven stam type één toe in een totaal volume van 80 microliter bindingsbuffer aan alle monsters.

Accepteer controle. Monster één. Voeg 10 microliter nano body verdunning toe aan elk monster.

Meng goed gedurende 10 seconden op een schudder en incubeer gedurende één uur op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 40 microliter van de gewassen magnetische kralensuspensie toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder continu schudden, pellet de kralen met een magneet en breng de opgeruimde SUP natant over in een buis om de radioactiviteit van elk monster te meten, breng 50 microliter van de supinaat over in een meetkolf. Voeg drie milliliter scintillatievloeistof toe en lees op deze isolatie.

Tel de gebruikte magnetische kralen af in een buis met behulp van water en centrifugeer 500 keer G gedurende twee minuten. Gooi de supinaat weg en resuspendeer de kralen in zes milliliter 0,5 molair natriumhydroxide. Deel vervolgens de suspensie in meerdere buisjes en incubeer in een ultrasone bad gedurende vijf minuten.

Na het pelleten van de kralen met een magneet en het verwijderen van de supinaat, voeg een milliliter 2%SDS-oplossing toe aan elk buisje, meng door te vortexen en folie gedurende vijf minuten. Oogst nu de kralen. Voeg een milliliter 0,2 molair EDTA pH zeven toe aan elk buisje en incubeer de buisjes in een ultrasoon bad gedurende vijf minuten.

Verzamel vervolgens de kralen, was de kralen met een milliliter water drie keer gevolgd door een milliliter 10 millimolair kobaltchlorideoplossing. Plaats buisjes gedurende 10 minuten op een schudder. Ga door met het verzamelen van kralen op een magneet en resuspendeer in één milliliter bindingsbuffer.

Was twee keer in één milliliter 20% ethanol, resuspendeer de kralen uiteindelijk in hun oorspronkelijke volume van 20% ethanol om geregenereerde kralen te verkrijgen in een concentratie van 40 milligram per milliliter. Compenseer voor achtergrondradioactiviteit door controle. Monster één in te stellen als de 0% radioactiviteit waarde en controlemonster twee als de 100% radioactiviteit waarde.

Bereken nu voor elk monster het percentage radioactiviteit in de sate als maatstaf voor de algehele precipitatie van het radiogelabelde virus door de nano body. Dit experiment evalueert de affiniteit van PVSS 38 C en antilichaam specifiek voor poliovirus met behulp van drie verschillende antigenen van poliovirus, natuurlijk antigeen, verhit antigeen en 14 s subeenheden. Interessant is dat de radioactiviteit in de sate van de monsters die radiogelabelde 14 s subeenheden bevatten, afneemt met toename van de concentratie van de nano body PVSS 38 C. Dit duidt op een toename van de hoeveelheid Poliovirus 14 s subeenheden verbonden aan de nano body P pvs, S 38 C, en indirect aan de magnetische kralen.

Aangezien er geen affiniteit van pvs S 38 C voor de N antigene en H antigene vorm van poliovirus wordt waargenomen, lijkt de nano body specifiek voor de 14 s subeenheid van poliovirus. De affiniteit van de nano body voor zijn antigenen zoals gemeten door deze methode is specifiek als de niet-gerelateerde nano body. NB een toont geen reactiviteit tegen de