Name: Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: Leer een geoptimaliseerde workflow voor DNA-methylatie- en genexpressieanalyse uit specifieke hersengebieden bij muizen. Deze methode maakt gelijktijdige isolatie van DNA en RNA mogelijk voor epigenetisch onderzoek naar vroeg-levenstress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door het Max Planck Instituut voor Psychiatrie en de Europese Unie Marie Curie Initial Training Network (NINA Contract 238665).

1. Programmering door Early Life tegenspoed Scheiding van de moeder (MS) wordt uitgevoerd om de jeugd stress (ELS) te induceren in pups geleverd door timed-zwangere C57BL/6N muizen (postnatale dag 0 (P0) op de dag van geboorte). <ol><li> Individuele nesten worden in schone kooien (met verwarmingselement) voor 3 uur per dag van P1-10. </li><li> Control (niet-ELS) pups blijven ongestoord in de moederlijke nest in. </li><li> Pups zijn die door hun moeder tot het spenen (P21), waarna ze worden ondergebracht in geslacht gematchte groepen (3-5 muizen per kooi) onder standaard laboratorium huisvesting van dieren. </li></ol> 2. Isolatie en dissectie van hersenweefsel <ol><li> Muizen worden gedood op de gewenste leeftijd door cervicale dislocatie. Opmerking: omdat dit protocol gaat om een stress-paradigma, geen verdoving wordt gegeven voorafgaande aan cervicale dislocatie, om te voorkomen dat de normale fysiologische regulatie van stresshormonen. Schedels worden geopend enhersenen zorgvuldig verwijderd en onmiddellijk snel bevroren door onderdompeling in iso-pentaan-droogijs, alvorens te worden opgeslagen bij -80 ° C. </li><li> Hersenen cryosectioned (10 urn dik) secties gemonteerd Superfrost glasplaatjes en gehandhaafd bij -20 ° C. Verwijzing naar een standaard muis stereotaxische atlas (bijv. Paxinos 6) wordt gebruikt om anatomische precisie te controleren en om opname van de regio van belang (bijvoorbeeld voor neuronen in de paraventriculaire kern te garanderen - PVN - verzamelen secties beginnen op het niveau van de rostrale PVN, bregma -0,75 tot -0,85). </li><li> Secties worden gekleurd met cresyl violet tot de identificatie van de verschillende hersenstructuren te vergemakkelijken. Ponsen (0,8 mm) van de regio&#39;s van belang (bijv. PVN) worden verkregen door in loco microdissectie. </li></ol> 3. Nucleic Acid Extractie van Brain Ponsen Optimaliseren van een protocol voor het gelijktijdig het extraheren van DNA en RNA van de kleine neuroanatomically gedefinieerde hersenen regionen bisulfiet en genexpressie analyses beschreven 7. Opmerking: Gezien het feit dat RNA is minder stabiel dan DNA in de GTC-Buffer, raden wij aan de verwerking van RNA eerst. Het homogenaat gebruikt voor DNA zuivering kan worden bewaard bij kamertemperatuur (RT) in die tijd. <ol><li> Meng stoten met een pipet vortexer in 400 ul guanidiniumthiocyanaat (AV) buffer (4.5 M guanidinium thiocyanate, 2% N-lauroylsarcosine, 50 mM EDTA pH 8,25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M beta-mercaptoethanol, 0,2% schuimwerend A) bij KT, langs een aantal keren door een injectiespuit (29g) (Figuur 2). </li><li> Splits lysaat in gelijke delen, zowel RNA als DNA kan worden gewonnen tegelijkertijd of afzonderlijk, afhankelijk van bijzondere experimentele behoeften. </li><li> Voor RNA-zuivering voeg 1/10 volume van NaOAc, een volume AquaPhenol (Appligene) (pH 4) en 1/2 volume chloroform isoamyl (24:1) aan lysaat. Vortex krachtig na elke stap enincuberen op ijs gedurende 10 minuten gecentrifugeerd (20 min bij 10.000 g bij 4 ° C), een gelijk volume van 70% EtOH aequous fase. </li><li> Breng mengsel aan een RNA-spin-kolom (bijvoorbeeld Nucleospin RNA II van Macherey-Nagel) en het uitvoeren van on-column DNase-vergisting en wasstappen (volg de fabrikant protocol); elueer RNA in 25 ul H 2 O. </li><li> Voor DNA-zuivering optimaliseren van een protocol van de Qiagen DNeasy bloed en weefsel Kit wordt gebruikt. Evenwicht lysaat met gelijke volumina van buffer AL en 100% EtOH, belasting op Spin kolom centrifuge (1 min bij 10.000 g bij kamertemperatuur) en doorstroming verwijderen. </li><li> Voeg 500 ul Buffer AW1 met 5 pi RNAse (1 mg / ml) kolom en incuberen 10 min bij KT. Spin (1 min bij 10.000 g, RT) en gooi de doorstroming. </li><li> Was kolom met 500 ul buffer AW2, gooi doorstroom en spin-droge lege kolom (1 min bij 15.000 g). </li><li> Voeg voorverwarmde (70 ° C) Buffer AE en incubeer kolommen 10 min bij 70 ° C. Elueren door centrifugeren (1 min, 10.000 g), opnieuw toe te passen doorstroom en herhaal centrifugatiestap. </li></ol> Gebruik een spectrofotometer om DNA-en RNA-concentraties te bepalen. Een typisch PVN punch opbrengsten ~ 600 ng DNA en ~ 400 ng RNA. Voor analyse van genexpressie door kwantitatieve PCR (qPCR), we meestal gebruik ~ 100 ng van RNA in de omgekeerde transcriptie reactie. 4. Bisulfiet Conversie Natriumbisulfiet wordt gebruikt om niet-gemethyleerde cytosines converteren naar uracils. In tegenstelling, zijn gemethyleerde cytosines beschermd tegen conversie. Daarom zijn alle cytosines die worden gedetecteerd in de uiteindelijke volgorde van de bisulfiet PCR-amplicon vertegenwoordigen gemethyleerde cytosines. Bisulfiet conversie leidt tot aanzienlijke DNA-degradatie die kan een beperkende factor zijn in de PCR-analyse. Optimale reactieomstandigheden die cytosine conversie maximaliseren verminderen DNA fragmentatie en handhaven enkelstrengs DNA ook bij lagere temperaturen kunnen worden bereikt metEpiTect bisulfiet Qiagen&#39;s Kit. In onze handen ~ 200 ng DNA gezuiverd uit micropunches een voldoende hoeveelheid uitgangsmateriaal voor de reactie bisulfiet. Om verschillen in de efficiëntie van de omzettingsreactie te voorkomen, dient de hoeveelheid template DNA constant gehouden onder alle monsters verwerkt in een experiment. Daarnaast volgorde leest moeten worden onderzocht voor de conversie-efficiëntie door het onderzoeken van het percentage niet-omgezette niet-CpGs. Dit percentage moet hoger zijn dan 98%. Lagere waarden duiden op onvolledige of inefficiënt bisulfiet conversie en de onderliggende sequenties worden uitgesloten van de analyse. 5. Bisulfiet PCR <ol><li> Ontwerp bisulfiet sequencing primers die specifiek zijn voor bisulfiet omgezet DNA (zie bespreking); Methyl Primer Express-software ( <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab</a>/ Nl / US / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 &amp; catid = 602121) zal helpen dit en helpen om een optimale gloeien temperaturen in pilot experimenten vast te stellen. </li><li> Bereid PCR-Master-Mix (voor een reactie) als volgt: 2.5 ul PCR-buffer 10x 0,5 ul 10 mM dNTP 1 pi 10 uM voorwaartse primer 1 pi 10 uM reverse primer 0,125 ul Qiagen Hotstart Taq Plus vullen tot 23 ßl met H2O </li><li> Voeg 2 pi bisulfiet behandelde DNA reactie. </li><li> Amplify met behulp van de volgende voorwaarden: 1 cyclus 6 min 95 ° C 45-50 cycli van 1 min. 95 ° C, 1 min bij optimale hybridisatietemperatuur 1 min 72 ° C 1 cyclus 5 min 72 ° C </li></ol> Analyse 7 pi PCR product met behulp van agarosegelelektroforese de grootte van het amplicon controleren en resterende PCR-reactie voor de daaropvolgende ligatie met een commercieel verkrijgbare PCR sanering kit (zuiveren bijvoorbeeld Macherey-Nagel Nucleospin Extract). Bij additionele ongewenste PCR-producten worden verkregen, wordt zuivering op gel aanbevolen. 6. Bisulfiet Sequencing Hoge resolutie DNA-methylatie profielen afgeleid uit enkele kloon metingen kunnen detecteren kleine veranderingen in DNA methylatie en nagaan welke regelgevende regio&#39;s die inspelen op de behandeling (milieu-programmering). De bisulfiet sequentie werkwijze omvat drie opeenvolgende stappen werken. Ten eerste zijn PCR producten verkregen door voorafgaande bisulfiet PCR geligeerd in een vector en omgezet in bacteriën. Ten tweede wordt kolonie-PCR van enkele klonen toegepast om de juiste grootte van het inzetstuk te bepalen. Ten derde worden positieve kolonie PCR&#39;s opgeruimd en onderworpen aan Big-Dye sequencing reactie. Na een clean-up stap worden de producten geëlektroforeerd op een capillaire sequencer. 6,1 ligatie en transformatie Let op: We routinematig gebruik maken van de pGEM-T vector cloning kit (Promega). Onze ervaring is dat de kloneringsefficiëntie mate afhankelijk zijn van de insert te ligeren. Verschillende vectoren worden getest bij lage aantal recombinante klonen herhaaldelijk verkregen. <ol><li> Stel ligatie reactie: 5 pi 2x ligatiebuffer 1 pi pGEM-T Vector 1 pi T4-Ligase 3 pi opgeschoond PCR product </li><li> Meng reactie van pipetteren en incubeer overnacht bij 4 ° C. Opmerking: Ligatie kan ook worden uitgevoerd gedurende 1 uur bij RT ook. Om aantal recombinante klonen verhogen overnacht ligatie bij 4 ° C de voorkeur. </li><li> Reiniging van ligatieproducten door ethanolprecipitatie: <ol class="lalpha"><li> Voeg 1 pi glycogeen, 1 ul 3M NaAc en 25 pl 100% EtOH de ligatiereactie neerslag gedurende 1 minuut in vloeibare stikstof. </li><li> Centrifuge (15,0000 g gedurende 30 minuten bij 4 ° C) en gooi supernatant. </li><li> Was met 300 ul70% EtOH en gecentrifugeerd (15000 g 20 minuten bij 4 ° C), verwijderen supernatant en pellet bij kamertemperatuur droog (10 min). </li><li> Resuspendeer pellet in 10 ul H 2 O. </li></ol></li></ol> 6.2 Transformatie van ligatieproducten in electrocompetente bacteriën <ol><li> Precool elektroporatie cuvetten (1 mm breedte) op ijs en dooi hoeveelheid van elektrocompetente DH5a bacteriën op ijs. </li><li> Voeg 45 ul DH5a bacteriën tot en met 10 ul opgeruimd ligatieproduct (zie hierboven) en over te dragen aan cuvette. </li><li> Maak van bacteriën op 1,5 kV, 200 Ω, 15 uF en voeg 1 ml voorverwarmde SOB medium direct na de puls levering. </li><li> Herstel bacteriën gedurende 1 uur bij 37 ° C, verdeeld 100 ul suspensie op LB / ampicilline bekleed met IPTG / X-Gal. </li><li> Incubeer plaatjes gedurende een nacht bij 37 ° C. </li></ol> 6,3 kolonie-PCR Let op: Colony PCR van enkele klonen wordt uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de inserts zijnvan de voorspelde grootte. Vertraagde kleur ontwikkeling van de blauw / witte screening, ongewenste recombinatie gebeurtenissen tijdens ligatie, integratie van oligomere primerparen of ingekort PCR-producten kunnen dan immers leiden tot defecte sequencing resultaten. We routinematig gebruik van T7 en SP6 primers om gekloonde inserts versterken; deze aanpak leidt tot extra vector sequenties van ongeveer 150 bp. T7 primer wordt gebruikt in de sequentie reactie in een later stadium. <ol><li> Stel kolonie PCR-reactie in 96-wells plaat. Voor een reactie gebruikt: 3 pi 2,5 mM MgCl2 2,5 pl Taq 10x buffer 1,5 pi 10 mM dNTP 2 pi 2,5 mM T7 primer 2 pi 2,5 mM SP6 primer 1 pi Taq polymerase Fermentas vullen tot 25 ßl met H2O </li><li> Doseer 25 ul / putje van de master mix in elke well van een 96-wells plaat. </li><li> Kies een positieve (wit) kloon van de plaat met pipetpunt en duik in PCR-reactie. </li><li> Amplify met folde volgende voorwaarden: 1 cyclus 4 min bij 95 ° C 10 cycli 30 s bij 94 ° C, 30 seconden bij 56 ° C en 30 s bij 72 ° C 30 cycli 30 s bij 94 ° C, 30 seconden bij 48 ° C en 30 s bij 72 ° C 1 cyclus 5 min bij 72 ° C </li><li> Plaats 5 pi kolonie-PCR op een agarosegel en bepalen reacties die de juiste insertgrootte bevatten. </li><li> Kolonie PCRs die de gewenste amplicons worden gereinigd met behulp van een commercieel verkrijgbare kit (Nagel Machery Nucleofast). </li></ol> 6,4 Big-Dye terminator reactie en sequencing <ol><li> Bereid Master mix voor Big-Dye reactie. Voor een reactie gebruikt: 1 pi H2O 0,5 ul Big-Dye reagens 1,5 ul Sequencing buffer </li><li> Breng 3 ul / putje in elk putje van een 96-wells plaat, aan elk putje toegevoegd 2 pi schoongemaakt kolonie-PCR product en uitvoeren reactie op een thermocycler met de volgende parameters: 35 cycli van 10 seconden bij 96 ° C, 5 sec bij 50 ° C en 4 min bij 60 ° C </li><li> De Big-Dye reactie wordt opgeruimd met behulp van een commerciële kit (Millipore Montage 96 Sequencing Clean-Up Kit) en verwerkt op een capillaire sequencer (bijv. ABI 3100 DNA). </li><li> Sequenties worden geanalyseerd met behulp van de Biq Analyzer ( <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) of de online tool Bisma ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/</a> ) het afleiden van de methylering patroon van de onderzochte DNA (Figuur 4). </li></ol> 7. Representatieve resultaten Om inzicht te krijgen in de invloed van ELS op de AVP expressie en methylatie status te verkrijgen, werden C57BL/6N muizen verwerkt volgens de workflow hierboven beschreven. Kortom, een groep C57BL/6N muizen was deubjected naar ELS, terwijl de controlegroep werd ongemoeid gelaten. De PVN en de supraoptische kern (SON) werden geslagen en DNA en RNA werden tegelijkertijd geïsoleerd van de enkele stoten. RNA werd reverse getranscribeerd en de niveaus van Avp transcripten werden gemeten door qPCR analyse en genormaliseerd op de expressie van HPRT en GAPDH housekeeping genen. DNA werd bisulfiet behandeld, geamplificeerd met primers specifiek voor de Avp versterker (figuur 4a) en de PCR producten werden gekloond en gesequentieerd. Ten minste 20 recombinante klonen uit elke muis / PCR werd geanalyseerd om methylering frequenties bepalen de CpGs in de PCR amplicon (figuur 4b). In vergelijking met controles, ELS leidden tot een significante hypomethylatie op CpG10, CpG12, CpG13 en Cpg14 van de AVP enhancer (p &lt;0,05, n = 6-8 dieren) suggereert epigenetische markering van deze regelgeving regio door middel van vroege levenservaringen. In tegenstelling tot de PVN methylering vanDe AVP versterker werd niet beïnvloed door ELS in de Zoon illustreren weefsel specificiteit van epigenetische markering (Figuur 4c). Analyse van het DNA-methylatie status bij CpG10 en AVP expressie van genen in de controle dieren (n = 6) blijkt een negatieve correlatie te wijzen op een rol van DNA-methylatie in de fine-tuning van de AVP genexpressie (figuur 4d). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> Figuur 1. Micropunches zijn verkregen uit ontleed hersenen van controle en de jeugd benadrukt muizen. Na DNA en RNA isolatie wordt genexpressie bepaald door qRT-PCR terwijl bisulfiet behandeld DNA wordt versterkt en gezuiverde producten worden gekloneerd in een geschikte vector identificatie van recombinant-klonen door blauw / wit selectie. Correct insert maten zijn gecontroleerd doorkolonie PCR voorafgaand aan het uitvoeren van Big-Dye reactie en verwerking op een capillaire sequencer. Methylatiepatroon worden gevisualiseerd door middel van passende software tools. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> Figuur 2. Tijdlijn van DNA / RNA extractie naar bisulfiet sequencing. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> Figuur 3. Workflow voor de gelijktijdige winning van DNA en RNA. De stempel van de hypothalamus kern paraventricularis, een klein Avp gen uiten gebied van de hersenen, wordt geplaatst in 400 ul GTA buffer, vortex tot verstoord en verder gehomogeniseerd door het passeren van een injectiespuit (29g). Het homogenaat wordt opgesplitst voor de zuivering van RNA en DNA. De splitsing kan 1:1 zijn of verschillende verhoudingen afhankelijkde bepaalde experimentele vraag. Homogenaten moeten worden verwerkt binnen een paar uur. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> Figuur 4. CpG methylering op de AVP locus in 6 weken oud-controle en ELS dieren. (A) Regeling van de AVP en oxytocine genen georiënteerd staart aan staart-en gescheiden door de intergene regio (IGR). Exonen worden weergegeven door open (genummerde) dozen. De verdeling van CpG residuen wordt vermeld en grootte en de positie van de respectieve PCR-amplicon met CpG 10 tot CpG14 wordt gekenmerkt door een dikke lijn. (B) Methylering van de AVP enhancer in de PVN in de controle en ELS dieren (n = 6-8). (C) Methylering van de AVP enhancer in de Zoon in de controle en ELS dieren (n = 8-10). (D) Avp genexpressie werd gecorreleerdmet de methylatie van CpG10 (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

<ol><li>Jirtle, R. L., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+epigenomics+and+disease+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Environmental epigenomics and disease susceptibility.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).</li>
<li>Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+programming+of+the+HPA+axis%3A+Early+life+decides%5BTitle%5D)+AND+%22Stress+%28Amsterdam%2C+Netherlands%29%22%5BJournal%5D)">Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides.</a> Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).</li>
<li>Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+that+underpin+metabolic+and+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases.</a> Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).</li>
<li>Murgatroyd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+methylation+programs+persistent+adverse+effects+of+early-life+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress.</a> Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).</li>
<li>Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockmühl, Y., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+learn+from+stress%3A+How+infantile+trauma+programs+us+for+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression.</a> Epigenetics. 5, (2010).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%2C+Compact%3A+The+Coronal+Plates+and+Diagrams%3A+Compact.+The+Coronal+Plates+and+Diagrams%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams</a>. , Elsevier Science Publishing Co Inc. (2008).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+research+notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC research notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+bisulfite+sequencing+PCR+with+pyrosequencing+for+measuring+differences+in+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation.</a> Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Epigenetische programmering wordt steeds meer erkend als een belangrijk mechanisme dat ten grondslag gezondheid en ziekte. Hier vormen een verfijnde methode voor de gelijktijdige isolatie van DNA en RNA uit micropunches en de volgende stappen DNA methylering profielen verkrijgen door bisulfiet sequencing. De geoptimaliseerde workflow maakt gemakkelijke analyse van epigenetische programmering in de hersenen als reactie op prikkels uit de omgeving. Bovendien is deze aanpak maakt het onderzoek naar de functionele relatie tussen DNA methylatie en gen-expressie als beide worden geanalyseerd uit dezelfde steekproef. Tot slot kan het aantal dieren nodig zijn voor het experiment aanzienlijk worden verminderd. Sommige voorzorgsmaatregelen en richtlijnen moeten worden gevolgd tijdens het uitvoeren van de gepresenteerde workflow. Gezien de buitengewone complexiteit en de heterogeniteit van de hersenen en sinds methylatie en expressie patroon kan variëren in een cel-en weefsel specifieke manier is het van grootbelang dat micropunching wordt uitgevoerd op een gestandaardiseerde manier. Als voorbeeld wordt epigenetische programmering van Avp gedetecteerd in de paravaventriuclar, maar niet in de supraoptic nucleus (figuur 4b-d), twee Avp expressie gebieden van de hypothalamus 4. In dit verband beschikbaarheid van DNA en RNA uit hetzelfde weefsel punch voordelig als RNA-expressie van bepaalde weefselspecifieke markergenen worden in sommige gevallen te bevestigen dat het juiste gebied is geperforeerd. Hoewel micropunching kan verminderen cellulaire heterogeniteit, moet worden herinnerd dat deze aanpak niet leidt tot de isolatie van enkele cel soorten of populaties. Extra zuiveringsstappen kunnen worden beschouwd dit onderwerp pakken. Voor bisulfiet sequencing primer optimaal ontwerp voor PCR-amplificatie volgende bisulfiet behandeling is essentieel. PCR producten dan 400 bp in lengte problematisch door de afbraak van DNA door bisulfite behandeling. Ook moet worden opgemerkt dat geneste PCR vertekende resultaten geven als een paar intact templates bijdragen aan het amplificatieproces. Primerparen die specifiek zijn voor de gewijzigde amplicon moeten worden ontworpen, hun sequenties niet bevatten CpG dinucleotiden om methylering voorgespannen versterking te vermijden. Bovendien moet primers bevatten niet CpG cytosines om amplificatie van ongemodificeerde of onvolledig omgezet DNA voorkomen. Versterking van een aantal templates kunnen baat hebben bij het uitvoeren van Hot-start PCR. In ieder geval dient geschikt primerparen worden gecontroleerd modelexperimenten teneinde bederf van waardevolle experimentele monsters voorkomen. Bisulfiet sequencing is een standaard methode voor het site-specific methylatie analyse als het in staat om betrouwbaar en nauwkeurig opsporen van de methylatie van CpG enkele residuen in een allel-specifieke manier 8. Direct sequencing van het PCR-product wordt niet aangeraden als gemengde methylatie oFA CpG residu wordt weergegeven als een C / T dubbele piek in de elektroferogram, die kwantificering van methylering kan voorkomen dat op het betrokken gebied. Daarom een ​​tussenproduct klonen stap wordt uitgevoerd en verschillende klonen worden gesequenced (~ 20-30) om de mate van methylering bepalen. Pyrosequencing is een alternatieve methode om DNA-methylatie te kwantificeren. Het maakt ook gebruik van bisulfiet conversie en bisulfiet PCR maar in plaats van het klonen en de volgorde van de amplicon wordt onderworpen aan een directe pyrosequencing reactie waarbij de methylatie status van een CpG residu wordt gelezen als een C / T single nucleotide polymorfisme die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd. Beide methoden te sporen hetzelfde niveau van methylatie 9, maar sinds het klonen-stap kan worden overgeslagen pyrosequencing meer tijd-efficiënt. Afhankelijk van het sjabloon 40 tot 100 nucleotiden keer kan worden gesequenced zodat meerdere rondes van Pyrosequencing verschillende sequencing primer noodzakelijk. Dit is een kritieke beperking, gegeven that grotere hoeveelheden DNA (ongeveer 1 ug per reactie) nodig zijn, die voorzienbaar meer bedragen dan de bedragen die beschikbaar zijn van de kleine hersenweefsel stoten. Zo eerste aftasten van gebieden in het bereik van enkele kilobasen door Pyrosequencing weergegeven minder geschikt als enkele kloon lezen. Niettemin moet na de identificatie van een klein gebied van belang pyrosequencing beschouwd. Collectief, het protocol dat hierboven beschreven biedt een nauwkeurige, efficiënte en gestroomlijnde aanpak voor de snelle en kosteneffectieve analyse van de hersenen micropunches voor epigenetische veranderingen. Meerdere exemplaren kunnen worden verwerkt in een enkele run en de methoden geschikt zijn bij het uitvoeren van steekproeven uit intermediaire-en kleinbedrijf experimenten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DNeasy Blood &amp; Tissue Kit </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.955,50 </td></tr><tr><td> Epitect bisulfiet Kit </td><td> Qiagen </td><td> 59104 </td></tr><tr><td> Nucleospin Extract </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740.609,50 </td></tr><tr><td> pGEM-T Vector Cloning Kit </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743.100,50 </td></tr><tr><td> Montage 96 Sequencing Clean-Up </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar Taq polymerase </td><td> Qiagen </td><td> 203203 </td></tr><tr><td> Taq polymerase </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

geoptimaliseerd analyse van dna-methylatie en gene expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Blootstelling aan voeding, kan drugs en ​​het vroege leven tegenslag tijdens gevoelige ramen van het leven 1,2 leiden tot blijvende veranderingen in genexpressie die bijdragen aan de weergave van fysiologische en gedragsmatige fenotypes. Dergelijke milieu-programmering is waarschijnlijk de gevoeligheid te verhogen tot metabolische, cardiovasculaire en psychische aandoeningen 3,4. DNA-methylatie en histon modificaties worden beschouwd als de belangrijkste processen in de bemiddeling van de gen-omgeving dialoog en lijken ook voor het milieu programmering ten grondslag 5. In zoogdieren, DNA methylering omvat typisch de covalente toevoeging van een methylgroep aan de 5-plaats van cytosine in het kader van CpG dinucleotiden. CpG methylering plaatsvindt in een zeer weefsel-en cel-specifieke manier waardoor het een uitdaging om discrete, kleine gebieden van de hersenen waar cellulaire heterogeniteit is hoog en de hoeveelheid weefsel beperkt te bestuderen. Bovendien banwege genexpressie en methylatie zijn nauw met elkaar verbonden gebeurtenissen, kan meer waarde worden verkregen door het vergelijken van beide parameters in hetzelfde monster. Hier wordt een stap-voor-stap protocol (figuur 1) voor het onderzoek van epigenetische programmering in de hersenen gepresenteerd met behulp van de &#39;scheiding van de moeder&#39; paradigma van het vroege leven tegenslag voor illustratieve doeleinden. Het protocol beschrijft de bereiding van micropunches van verschillend leeftijd muis hersenen van waaruit DNA en RNA tegelijk kunnen worden geïsoleerd, waardoor DNA-methylatie en genexpressie analyses in hetzelfde monster.

Een gestroomlijnde workflow om DNA-methylatie en expressie van genen veranderingen te bestuderen op de jeugd stress wordt weergegeven. Vanaf moeder scheiding van pasgeboren muizen en isolatie van discrete hersenweefsel vertegenwoordigen wij een protocol van DNA en RNA tegelijk isoleren van hersenweefsel ponsen voor latere bisulfiet sequencing en RT-PCR analyse.

Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

Blootstelling aan dieet, medicijnen en vroege levensstress tijdens gevoelige perioden in het leven 1,2 kan leiden tot blijvende veranderingen in de genexpressie die bijdragen aan ...

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van DNA-methylatie en veranderingen in genexpressie na stress op vroege leeftijd. Dit wordt bereikt door pasgeboren muizenpups eerst bloot te stellen aan moederlijke scheiding om stress op vroege leeftijd op te wekken, waarna in een tweede stap de relevante hersengebieden, in dit geval de PVN, worden verkregen door microdissectie in loco en DNA en RNA gelijktijdig worden geïsoleerd uit één enkel weefselstempel.Vervolgens wordt het verkregen DNA behandeld met sulfiet en wordt het gebied van belang geamplificeerd via bisulfiet-PCR. Dit wordt daarna geligeerd in een vector en getransformeerd in bacteriën. Succesvolle transformaties worden geïdentificeerd aan de hand van marker-expressie en de grootte van het PCR-fragment.En ten slotte wordt bisulfietsequencing gebruikt om de methyleringsstatus te beoordelen. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is dat het een handige analyse mogelijk maakt van epigenetische programmering als reactie op omgevingsprikkels. Deze methode kan inzicht bieden in epigenetische programmering door tegenspoed in de vroege levensfase.Het kan ook worden toegepast op andere systemen. Overal waar methylering en genexpressie worden geanalyseerd in een zeer weefselspecifieke omgeving en waar de beschikbaarheid van weefsel beperkt is. Om vroege levensstress op te wekken, wordt moederlijke scheiding uitgevoerd bij pups van gedateerde drachtige C 57 black six N moederdieren om moederlijke scheiding te bewerkstelligen.Verplaats elk nest gedurende drie uur per dag van postnatale dag 1 tot 10 naar een verwarmde, schone kooi; laat de ongestreste controlepups ongestoord. Afgezien van de scheiding van drie uur blijven alle nesten bij hun moeders tot het spenen op postnatale dag 21. Vervolgens worden de pups gehuisvest in groepen van hetzelfde geslacht, drie tot vijf muizen per kooi onder standaard huisvestingscondities. Om de verzameling van hersenweefsel te starten, worden de muizenhersenen uit de schedels verwijderd, onmiddellijk ingevroren in isop droogijs en bewaard bij -80 °C.Wanneer u klaar bent om de weefselponsen te verzamelen, haalt u de hersenen uit de vriezer van -80 °C en plaatst u deze op droogijs. Begin met het cryosectioneren van de hersenen in coronale secties van 10 micron, van rostraal naar caudaal. Monteer de secties op super frost glasplaatjes en laat ze drogen voor kleuring met kristalviolet.Extra coupes kunnen worden gemaakt en bewaard bij -20 °C voor verdere analyses, zoals in situ hybridisatie. Wanneer de coupes klaar zijn voor het nemen van stansen, kleur de coupes dan met kristalviolet om de relevante hersenstructuren te identificeren. Neem vervolgens met een ponsnaald stansen van 0,8 mm uit de regio's van belang middels in loco microdissectie.De biopten moeten worden bewaard bij minus 80 °C. Het is van cruciaal belang dat het micro-ponsen op een gestandaardiseerde manier wordt uitgevoerd, aangezien genexpressie en methylering zeer weefselspecifiek zijn. Homogeniseer de biopten in 400 µL guanidiniumthiocyanaatbuffer met behulp van een pipet en vortex vervolgens bij kamertemperatuur.Breng vervolgens het resulterende lysaat door een spuit met een 29 gauge naald. Herhaal dit meerdere malen totdat de punch niet meer zichtbaar is. Verdeel het lysaat in gelijke delen.De ene is voor het verwerken van RNA, wat eerst moet gebeuren, en de andere voor het verwerken van DNA, dat op kamertemperatuur bewaard kan worden totdat het RNA is verwerkt voor RNA-purificatie met een volume van 1/10 natriumacetaat, één volume aqua fenol en een half volume chloroform-isoamylalcohol (24:1). Vortex het mengsel krachtig na elke toevoeging en incubeer het uiteindelijke mengsel 10 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens het mengsel.Verzamel de waterige fase en voeg hier een gelijk volume 70% ethanol aan toe. Gebruik een RNA spin-column kit. Voer een on-column DNA-digestie uit, was de kolom en elueer het RNA in 25 µL water.Zuiver nu het DNA met een kit-protocol dat is aangepast om de toevoeging van een RNase-digestie op te nemen, en waarbij de elutiebuffer en de elutiekolom voor gebruik worden verwarmd tot 70 °C. Voor de kolommen is 10 minuten bij 70 °C voldoende. Gebruik tot slot een spectrofotometer om de DNA- en RNA-concentraties te bepalen.Een typische PVN-punch levert ongeveer 600 nanogram DNA en ongeveer 400 nanogram RNA op; reserveer hiervan ongeveer 100 nanogram RNA voor genexpressieanalyse via kwantitatieve PCR voorafgaand aan amplificatie door bisulfit. Behandel 200 nanogram van het geïsoleerde DNA met een commercieel verkrijgbare kit om DNA uit de gemethyleerde regio's te amplificeren. Bestel primers die specifiek zijn ontworpen voor bisulfit-geconverteerd DNA. Optimaal primerontwerp bij bisulfit-PCR is essentieel, aangezien de kwaliteit en specificiteit van het PCR-amplicon het succes van de volgende stappen bepalen.Bepaal bij ontvangst van de primers hun optimale annealingtemperatuur met behulp van pilotexperimenten. Gebruik twee µL bisulfietbehandeld DNA als template voor elk PCR-mengsel van 25 µL.Amplificeer het mengsel, beginnend met zes minuten denaturatie bij 95 °C, gevolgd door 45 tot 50 amplificatiecycli, afsluitend met een finale elongatie van vijf minuten bij 72 °C. Analyseer zeven µL van het PCR-product via agarosegelelektroforese om de grootte van het amplicon te verifiëren. Purificeer het resterende PCR-product voor daaropvolgende ligatie met behulp van een commercieel beschikbare PCR-opreinigingskit.Indien er ongewenste PCR-producten worden verkregen, gebruik dan gelzuivering om het gewenste product voor dit protocol te isoleren. Er wordt gebruikgemaakt van een commerciële kloneringskit. De kloneringsefficiëntie is sterk afhankelijk van het insert.Wanneer er herhaaldelijk lage aantallen recombinante klonen worden verkregen, dient een andere kloningsvector te worden geprobeerd. Stel een ligatiereactie van 10 µL op met 1 µL vector en 3 µL gezuiverd PCR-product. Meng de reactie door te pipetteren en incubeer deze overnacht bij 4 °C tot de volgende dag.Zuiver de ligatiereactie via klassieke ethanolprecipitatie en transformeer de bacteriën met het product. Voeg direct na de pulsafgifte één milliliter voorverwarmd SOB-medium toe en breng de getransformeerde bacteriën over naar een reactiebuisje. Laat de bacteriën één uur herstellen bij 37 °C en verspreid vervolgens 100 µL van elke suspensie op een LB-ampicillineplaat gecoat met IPTG.Incubeer de platen overnacht totdat de kolonies kunnen worden geplukt. Stel colony PCR-reacties van 25 µL op in een 96-wells plaat, waarbij in elke reactie drie µL van 2,5 mM magnesiumchloride wordt gebruikt. Pluk positieve witte klonen met een pipetpunt en breng deze door middel van een eenvoudige dip over naar een PCR-mix.Begin de PCR met een smeltcyclus van vier minuten. Volg dit met 10 amplificatiecycli met een annealingtemperatuur van 56 °C. Elke stap van deze cycli duurt 30 seconden.Verlaag vervolgens de annealingtemperatuur naar 48 °C voor nog eens 30 amplificatiecycli. Sluit af met een elongatiecyclus van vijf minuten. Laad nu 5 µL van elk product op een agarosegel en identificeer de reacties die een insert van de juiste grootte bevatten.Gebruik een commercieel verkrijgbare kit om de PCR-producten van belang te zuiveren, zodat deze gesequenced kunnen worden middels big dye terminator cycling sequencing. Vul de putjes van een 96-well plaat met drie µL big DI reactiemastermix, gevolgd door twee µL van het gezuiverde kolonie-PCR-product. Voer de reactie uit op een thermocycler, beginnend met één minuut bij 96 °C, gevolgd door 35 cycli van 10 seconden bij 96 °C, vijf seconden bij 50 °C en vier minuten bij 60 °C.Nadat de bisulfitreactie is voltooid, wordt de reactie opgezuiverd met een bisulfit-zuiveringsplaat. Na het verkrijgen van de sequenties worden deze geanalyseerd met de online bisulfit-analyzer of de B-I-S-M-A-tool om het methyleringspatroon van het onderzochte DNA-gebied af te leiden, om zo inzicht te krijgen in de invloed van vroege stress (early life stress of ELS) op de expressie en methyleringsstatus van avp. C 57 black/6-muizen werden verwerkt volgens het beschreven protocol; de paraventriculaire kern en de supraoptische kern werden uitgestanst om DNA en RNA te isoleren. Het DNA werd behandeld met bisulfit en geamplificeerd met primers die specifiek zijn voor de avp-enhancer, waarna de PCR-producten werden gekloond en gesequenced, waarbij ten minste 20 recombinante klonen per muis werden geanalyseerd.De PCR-producten werden geanalyseerd om de methyleringsfrequenties te bepalen voor de CpG's in het PCR-amplicon in weefsel van de P-V-N-E-L-S, wat een significante hypomethylering veroorzaakte op vier locaties op de A VP-enhancer, wat wijst op epigenetische markering van deze regulatoire regio door ervaringen in de vroege levensfase. In tegenstelling tot de PVN werd de methylering van de A VP-enhancer in de SON niet beïnvloed door ELS, wat de weefselspecificiteit van het epigenetische effect illustreert. Bij controle-dieren correleerde de DNA-methyleringsstatus op CpG 10 negatief met de VP-genexpressie, wat wijst op een rol van DNA-methylering bij het fijnstellen van de VP-genexpressie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals UPCR, eenvoudig worden uitgevoerd op het geïsoleerde RNA om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals veranderingen in de genexpressie in het geanalyseerde weefsel.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe DNA-methyleringsveranderingen als reactie op omgevings- of ervaringsafhankelijke stimuli kunnen worden bestudeerd.

optimized-analysis-dna-methylation-gene-expression-from-small

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Tot voor kort werden expressie studies over menselijke hersenen beperkt tot de kwantificering van RNA of eiwit. Met de chromatine immunoprecipitatie technieken beschreven in dit document, zal het mogelijk zijn om histon-methylatie en andere epigenetische regulatoren van genexpressie in postmortem hersenen kaart.

Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Dit manuscript beschrijft een protocol dat een uitgebreid profiel toepast voor de analyse van transcriptionele programma's die worden geïnduceerd in specifieke hersenkernen van knaagdieren na gedragsparadigma's. Hierin wordt deze aanpak geïllustreerd in de context van het profileren van genen die worden geïnduceerd in de nucleus accumbens (NAc) van muizen na acute cocaïne-blootstelling, met behulp van microfluïdische qPCR-arrays.

Uitgebreide analyse van de transcriptie van Brain Dynamics Monsters Na Behavioral Experience

DNA-methylatie is in staat om stabiele niveaus van genregulatie te handhaven, evenals dynamische veranderingen in genregulatie mogelijk te maken als reactie op verschillende stimuli. We beschrijven technieken die het mogelijk maken om gen-specifieke veranderingen in DNA-methylatie en de invloed van deze veranderingen op genregulatie te bestuderen.

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Bisulfiet amplicon sequentiebepaling (BSAS) is een methode voor het kwantificeren van cytosinemethylatie in gerichte genomische regio's van belang. Deze methode maakt gebruik van bisulfietconversie in combinatie met PCR-amplificatie van doelregio's vóór next-generation sequencing om absolute kwantificering van DNA-methylatie op een basisspecifiek niveau te produceren.

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd methyl-CpG-bindingsdomein (MBD) sequentieringsprotocol en een berekeningspijpleiding om differentieel gemethyleerde CpG-rijke regio's bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie (CLL) te identificeren.

Omvattende DNA-methyleringsanalyse met gebruikmaking van een methyle-CpG-bindende domein-opnamebaseerde methode bij patiënten met chronische lymfocytische leukemie

Onlangs ontdekte geoxideerde vormen van 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) kan verschillende DNA wijzigingen met unieke functionele rollen. Hier wordt een semi-kwantitatieve workflow voor visualisatie van oxi-mCs ruimtelijke verdeling, signaal intensiteit profilering en colocalization omschreven.

Immunokleuring voor DNA wijzigingen: computationele analyse van Confocal beelden

Hierin beschrijven we een procedure voor genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag-darmkanker. De procedure is van belang voor studies die onderzoeken relaties tussen methylatiepatronen van genen en factoren die bijdragen aan carcinogenese bij maag-darmkanker.

Genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag- en darmkanker

We presenteren een hands-on, stap-voor-stap, snel protocol voor het verwijderen en ontleden van discrete gebieden van vers hersenweefsel bij muizen. Het verkrijgen van hersengebieden voor moleculaire analyse is routine geworden in veel neurowetenschappelijke laboratoria. Deze hersengebieden worden onmiddellijk bevroren om transcriptomische gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen voor analyse op systeemniveau.

Microdissectie van muizenhersenen in functioneel en anatomisch verschillende regio's

De huidige studie beschrijft de workflow om DNA-methylatiegegevens te beheren die zijn verkregen door microarray-technologieën. Het protocol demonstreert stappen van monstervoorbereiding tot data-analyse. Alle procedures worden in detail beschreven en de video toont de belangrijke stappen.

Monstervoorbereiding tot bio-informatica analyse van DNA-methylatie: associatiestrategie voor obesitas en gerelateerde eigenschappenstudies

Deze studie presenteert een ruimtelijk Trekker–CUT&amp;Tag multioomprotocol dat directe ruimtelijke streepjescoding van een weefselsectie combineert met enkelcel-multioomanalyse. Deze aanpak maakt ruimtelijk opgeloste enkelcelprofilering van genexpressie en de histon H3K27ac-modificatie mogelijk gelijktijdig, wat mechanistische inzichten biedt in genregulatie in de context van weefselmicroanatomie.

Ruimtelijk opgeloste, geïntegreerde single-cell multiomic profilering van het transcriptoom en epigenomische doelen in bevroren weefselsecties

Leer een geoptimaliseerde workflow voor DNA-methylatie- en genexpressieanalyse uit specifieke hersengebieden bij muizen. Deze methode maakt gelijktijdige isolatie van DNA en RNA mogelijk voor epigenetisch onderzoek naar vroeg-levenstress.

Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

Meer video's verkennen