Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

Het algemene doel van deze procedure is om DNA te bestuderen. Methylering en veranderingen in genexpressie bij stress in het vroege leven. Dit wordt bereikt door eerst pasgeboren muispups te onderwerpen aan maternale scheiding om stress in het vroege leven te induceren, als tweede stap worden hersengebieden van belang, de PVN, verkregen door in loco microdissectie en DNA en RNA worden gelijktijdig geïsoleerd uit een enkele weefsel punch.

Vervolgens wordt het verkregen DNA behandeld met sulfiet, en wordt de regio van belang versterkt door bi sulfiet PCR. Dit wordt vervolgens geligateerd in een vector en getransformeerd in bacteriën. Succesvolle transformaties worden geïdentificeerd door middel van marker expressie en PCR fragmentgrootte.

En ten slotte wordt bi sulfide sequentiebepaling gebruikt om de methyleringsstatus te beoordelen. Het grote voordeel van deze workflow is dat het een gemakkelijke analyse van epigenetische programmering in reactie op omgevingsstimuli mogelijk maakt. Deze methode kan inzicht geven in epigenetische programmering door stress in het vroege leven.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen. Overal waar methylering en genexpressie worden geanalyseerd in een zeer weefselspecifiek milieu en waar de beschikbaarheid van weefsel beperkt is Om stress in het vroege leven te induceren. Maternale scheiding wordt uitgevoerd op pups van getimede zwangere C 57 zwarte zes N dammen om maternale scheiding te beïnvloeden.

Breng elke worp over naar een verwarmde schone kooi gedurende drie uur per dag van postnatale dagen één tot 10. Laat ongestresste controlepups ongestoord. Afgezien van de drie uur scheiding, worden alle worpen bij hun moeders gelaten tot het spenen op postnatale dag 21. Vervolgens worden de pups gehuisvest in geslachtsgematchte groepen, drie tot vijf muizen per kooi onder standaard huisvestingsomstandigheden om de verzameling van hersenweefsel te starten, worden de muizenhersenen uit de schedels verwijderd en onmiddellijk bevroren in isoprop dry ice en opgeslagen bij min 80 graden Celsius.

Wanneer u klaar bent om de weefselpunches te verzamelen, haalt u de hersenen uit de min 80 graden vriezer en plaatst u ze op droog ijs. Begin met cryosectie van de hersenen in 10 micron coronale secties van rostrale tot coddle. Monteer de secties op superfrostglasglazen en droog ze voor cresylviolet kleuring.

Aanvullende slides kunnen worden genomen en opgeslagen bij min 20 graden voor verdere analyses, zoals in situ hybridisatie. Wanneer u klaar bent om punches te nemen, kleurt u de slides met cresylviolet om hersenstructuren van belang te identificeren. Gebruik vervolgens een punchnaald om 0,8 millimeter punches van de regio's van belang te nemen met in loco microdissectie.

De punches moeten worden bewaard bij min 80 graden Celsius. Het is van cruciaal belang dat micro punchen op een gestandaardiseerde manier wordt uitgevoerd, aangezien genexpressie en methylering zeer weefselspecifiek zijn. Homogeniseer de punches in 400 microliters qadiumthiocyanaat buffer met behulp van een pipet en vervolgens voortdurend mengen bij kamertemperatuur.

Breng het resulterende lysate vervolgens door een 29 gauge naald. Meerdere keren mag de punch niet meer zichtbaar zijn. Verdeel het lysate in gelijke delen.

Eén om RNA te verwerken, wat als eerste dient te worden gedaan en de andere om DNA te verwerken, dat op kamertemperatuur kan worden bewaard totdat het RNA is verwerkt voor RNA zuivering bij een tiende volume natriumacetaat, een volume aqua fenol en een halve volume 24 tot één chloroform tot isoamyl AML voortdurend mengen. Na elke toevoeging de mengsel krachtig voortdurend mengen en de uiteindelijke samenstelling 10 minuten op ijs incuberen. Centrifugeer vervolgens het mengsel.

Verzamel de waterige fase en voeg er een gelijk volume van 70%ethanol aan toe. Gebruik een RNA spinkolom kit. Voer een on-kolom DNA's vertering uit en elueer het RNA in 25 microliters water.

Zuiver nu het DNA met behulp van een kitprotocol dat is aangepast om de toevoeging van een RN a's vertering en om de elucian buffer en elucian kolom op te warmen tot 70 graden Celsius voordat ze worden gebruikt. 10 minuten bij 70 graden Celsius is voldoende voor de kolommen. Gebruik tenslotte een spectrofotometer om de DNA- en RNA-concentraties te bepalen.

Een typische PVN punch levert ongeveer 600 nanogram DNA en ongeveer 400 nanogram RA op. Zet ongeveer 100 nanogram RNA opzij voor genexpressieanalyse door kwantitatieve PCR vóór amplificatie door sulfiet. Behandel 200 nanogram van het geïsoleerde DNA met een commercieel verkrijgbaar kit om DNA uit de gemetyleerde regio's te versterken. Bestel primers die specifiek zijn ontworpen voor bi sulfiet geconverteerd DNA Optimale primer ontwerp in bi PCR is essentieel, aangezien de kwaliteit en specificiteit van de PCR amplicon de succesvolheid van de volgende stappen bepaalt.

Wanneer de primers aankomen, bepaal dan hun optimale en knietemperatuur met pilotexperimenten. Gebruik twee microliters bi sulfiet behandeld DNA als template voor elke 25 microliter PCR mixtuur.

Versterk het mixtuur beginnend met een zes minuten denaturering bij 95 graden Celsius, gevolgd door 45 tot 50 versterkingscycli voor een laatste vijf minuten verlenging bij 72 graden Celsius. Analyseer zeven microliters van het PCR product door middel van Agros gel elektroforese om de grootte van het amplicon te verifiëren. Zuiver het resterende PCR product voor vervolgens ligatie met behulp van een commercieel verkrijgbaar PCR opruimingskit.

Indien ongewenste PCR producten worden verkregen, gebruik dan gel zuivering om het product van belang voor dit protocol te isoleren. Een commercieel kloningskit wordt gebruikt. De kloningsefficiëntie hangt kritisch af van de insert.

Dus als herhaaldelijk lage aantallen recombinante klonen worden verkregen, probeer dan een andere kloningsvector. Stel een 10 microliter ligatie reactie op met één microliter vector en drie microliters opgeruimd PCR product. Meng de reactie door middel van pipetting en incubeer deze een nacht bij vier graden Celsius de volgende dag.

Ruimen de ligatie reactie op door middel van klassieke ethanol precipitatie en transformeer de bacteriën met het product. Voeg één milliliter voorverwarmd SOB medium toe direct na de pulse levering en breng de getransformeerde