Detectie van zogenaamde Rare Genomic Varianten uit gepoold Sequencing gebruiken SPLINTER

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van genen binnen een populatie individuen die een overmaat aan zeldzame functionele variatie vertoont. Dit wordt bereikt door eerst een populatie DNA-monsters te poolen. De tweede stap is het aanmaken en sequensen van een next-generation sequencing-bibliotheek.

Dit wordt gevolgd door de alignering van reads aan de referentievolgorde en het maken van een foutmodel. De laatste stap is de computationele analyse met behulp van het splinter-algoritme. Uiteindelijk wordt splinter-analyse van gepoolde Next generation sequencing gebruikt om genen binnen populaties aan te tonen die een overmaat aan zeldzame functionele variantie vertonen. Demonstratie van de procedure.

Vandaag worden we vergezeld door Francesco Vilania, een promovendus in het laboratorium van mijn mentor en onze collaborator, Rob Mitra, samen met Enrique Ramos, een promovendus in mijn laboratorium. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het genotyperen van individuen, is dat het mogelijk maakt om zeer nauwkeurig zeldzame sequentievarianten te detecteren in een gemengde populatie van DNA-moleculen zonder dat voorafgaande informatie vereist is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in de genetica en genomica, zoals het bepalen van de frequentie van nieuwe ziekteverwekkende zeldzame varianten in grootschalige cohortstudies.

Elk splinter-experiment vereist de aanwezigheid van een negatieve en positieve controle om een optimale nauwkeurigheid te verkrijgen; bereid het PCR-reactiemengsel voor met behulp van PFU ultra high fidelity DNA-polymerase. De negatieve controle is een PCR-product van een willekeurige DNA-sequentie waarvan bekend is dat deze geen genetische variatie vertoont, zoals een gekloonde vector-backbone.

Hier wordt een amplicon van 1 934 basenparen van de M 13 MP 18-vector gebruikt. De positieve controle kan elke set eerder gevalideerde sequentievarianten zijn die in de gehele populatie aanwezig zijn. Als deze gegevens niet beschikbaar zijn, heeft dit laboratorium een kunstmatige positieve controle ontworpen, bestaande uit een PCR-product van 331 basenparen uit een mengsel van gemanipuleerde sequenties die zijn gekloond in de PGMT easy-vector, zoals vermeld in deze tabel.

Deze sequenties worden gecombineerd om verschillende kleine allelfrequenties van werkelijke varianten binnen de patiëntenpopulatie na te bootsen. Na PCR-amplificatie van de monsters, zoals besproken in het schriftelijke protocol dat bij deze video is gevoegd, wordt elk PCR-product gereinigd van overtollige primers met behulp van kyogen kayak quick column purification, of 96-wells filterplaten met een vacuümm manifold voor grootschalige reiniging. Zodra ze zijn gezuiverd, wordt elk PCR-product gekwantificeerd met standaardtechnieken.

Bereid de combinatie van alle PCR-producten en controles voor in een pool die is genormaliseerd op basis van het aantal moleculen. Samenvoegen op basis van concentratie zal leiden tot een overrepresentatie van kleine ampliconen ten opzichte van grotere producten. Voeg in plaats daarvan een genormaliseerd aantal moleculen per amplicon samen.

Kies willekeurige getallen die groot genoeg zijn om de nauwkeurigheid tijdens het pipetteren te waarborgen. Neem de PCR-producten en controles. Ligatie van de PCR-producten is noodzakelijk, omdat fragmentatie van kleine PCR-applicanten waarschijnlijk zal leiden tot een vertekening van de representatie richting hun uiteinden.

Om deze reden ligeren we de pool-PCR-producten in een grote vector voordat ze worden gefragmenteerd. Bereid het mengsel voor blunt-end ligatie voor met T four Ligase, T four PNK en PEG zoals vermeld in het protocol. Incubeer de reactie bij 22 °C gedurende 17 uur.

Volg dit op met incubatie bij 65 °C gedurende 20 minuten en bewaar vervolgens bij 4 °C. Controleer daarna de ligatie door 50 ng van het monster op een agarosegel te laden. Een succesvolle ligatie zal resulteren in de aanwezigheid van een band met een hoog moleculair gewicht in de lane.

Bereid de DNA-fragmentatie voor via een willekeurige sonicatiestrategie door het monster 1 op 10 te verdunnen in Qiagen PB-buffer om de viscositeit te verlagen. Fragmenteer vervolgens de grote concentratie PCR-producten met een Diagenode BioRuptor voor 24 monsters; soniceer gedurende 25 minuten op hoog vermogen met een cyclus van 40 seconden aan en 20 seconden uit per minuut. Controleer de resultaten van de DNA-fragmentatie op een agarosegel en ga verder met Illumina-sequencing zoals beschreven in de tekst.

Om te beginnen met de sequencing-read-alignment, worden de ruwe sequencing-read-bestanden ofwel geconverteerd naar het scarf-formaat, of ze worden gecomprimeerd. Compressie is optioneel.

Het bespaart tijd en ruimte voor de daaropvolgende analysestappen zonder dat er relevante informatie verloren gaat. Gebruik de meegeleverde alignment-tool om de raw reads uit te lijnen met de geannoteerde faster-referentiesequentie. De monsters die specifiek zijn voor de targetregio's omvatten de PCR-reacties alsook de positieve en negatieve controles.

Het invoerformaat moet in scarf-formaat of gecomprimeerd zijn. Voer vervolgens de bestandstagging uit zoals beschreven in de tekst. Elke run genereert een uniek profiel van sequencingfouten dat gekarakteriseerd moet worden voor nauwkeurige variant calling, om zo de fouten voor elke run te modelleren.

Een interne controle met een bekende sequentievariatie is in elke pool-monsterbibliotheek opgenomen vanuit het uitgelijnde getagde bestand. Genereer een foutmodelbestand met de meegeleverde tool met de referentiesequentie van de negatieve controle; alle sequenties van de negatieve controle kunnen worden gebruikt, of alternatief slechts een subset wanneer deze is gespecificeerd door de 5'- en 3'-uiteinden. Unieke reads en pseudo-counts moeten altijd worden toegepast.

De tool genereert drie bestanden met de naam van de parameter voor het uitvoerbestand, eindigend op nul, één of twee. Deze bestanden komen respectievelijk overeen met een nulde, eerste en tweede orde foutmodel voor variant calling met splinter. Het tweede orde foutmodel moet altijd worden gebruikt voor de visualisatie van het foutpercentageprofiel van de run.

Het Pearl-script dat wordt gebruikt om de grafiek van het foutmodel te plotten, kan worden ingezet om een PDF-foutplot te genereren op basis van het foutmodelbestand van de nulde orde. De plot zal run-specifieke fouttrends onthullen en kan worden gebruikt om het maximale aantal leesbases voor de analyse af te leiden. De volgende sectie zal demonstreren hoe splinter op het uitgelijnde bestand kan worden uitgevoerd met behulp van het foutmodel om zeldzame sequentievarianten te detecteren.

De eerste stap in de analyse is het uitvoeren van splinter op het gealigneerde bestand met behulp van de referentiesequentie en het foutmodel. Basen van enkelvoudige reads kunnen uit de analyse worden uitgesloten als deze defect blijken te zijn. De P-waarde-cutoff bepaalt hoe streng de variant-calling analyse zal zijn.

Een minimale afkapwaarde van min 1,301 is een goed startpunt. De optie voor poolgrootte optimaliseert het signaal-ruisverhouding-onderscheid van het algoritme door potentiële variantie met minor allele frequencies te elimineren die lager zijn dan die van een enkel allel in de eigenlijke pool. De optie voor poolgrootte moet worden ingesteld op de dichtstbijzijnde waarde die groter is dan het werkelijke aantal allelen dat in het experiment is geanalyseerd.

Variantie die bij lagere frequenties wordt aangetroffen, wordt genegeerd als ruis. Nadat alle parameters en bestandsnamen zijn ingevoerd, wordt splinter uitgevoerd. Dit bestand geeft alle hits terug die statistisch significant zijn over het monster, inclusief een beschrijving van de positie en het type variant.

P-waarde per DNA-strengfrequentie van de variant en totale dekking per DNA-streng. De lijstflacon wordt door splinter gebruikt om de dekking over het monster te normaliseren. Het eerste veld geeft het amplicon van belang aan, terwijl het tweede veld de positie aangeeft waarin de mutatie aanwezig is.

N geeft aan dat de rest van de sequentie geen mutatie bevat. Na een normalisatie is de analyse van de positieve controle essentieel om de sensitiviteit en specificiteit voor een specifieke run te maximaliseren. Dit is belangrijk omdat de initiële afkapwaarde van minus 1,301 waarschijnlijk niet voldoende zal zijn om alle fout-positieven te elimineren.

Elke splinteranalyse zal de werkelijke P-waarde tonen voor elke aangeroepen variant, die vooraf niet als prioriteit kon worden voorspeld. Echter, de gehele analyse kan worden herhaald door de minst strikte P-waarde te gebruiken die op de initiële output wordt weergegeven voor de bekende waar-positieve baseposities. Dit zal dienen om alle waar-positieven te behouden terwijl de meeste, zo niet alle, fout-positieven worden uitgesloten, aangezien deze doorgaans veel minder significante P-waarden hebben in vergelijking met waar-positieven.

Om dit proces te automatiseren, kan het cutoff-tester-script worden gebruikt. Het cutoff-tester-script vereist een splinter-outputbestand en een lijst met positieve controlehits in de vorm van een tab-gescheiden bestand, zoals het bestand dat voor de normalisatie wordt gebruikt. De resulterende output is een lijst met afkapwaarden die stapsgewijs naar de optimale waarde leiden.

De laatste lijn vertegenwoordigt de meest optimale afkapwaarde voor de run en kan daarom worden gebruikt voor de data-analyse. Het optimale resultaat is het bereiken van een sensitiviteit en specificiteit van één. Indien dit niet wordt bereikt, kan de splinter-analyse worden geoptimaliseerd door het aantal geïncorporeerde read-basen te wijzigen.

De definitieve afkapwaarde kan op de gegevens worden toegepast met behulp van het cutoff cut script, waarmee het splinter-outputbestand wordt gefilterd op hits die onder de optimale afkapwaarde liggen. Deze stap genereert het definitieve splinter-outputbestand, dat de snips en indels in het monster bevat. Houd er rekening mee dat de output voor inserties enigszins verschilt van die voor substituties of deleties.

De nauwkeurigheid als functie van de dekking voor een enkel allel in een gepoolde steekproef wordt gevisualiseerd in dit type grafiek. De nauwkeurigheid wordt geschat als de oppervlakte onder de curve, afgekort als AUC, van een receiver operating characteristic-curve en varieert van een willekeurige nauwkeurigheid van 0,5 tot een perfecte nauwkeurigheid van 1,0. In dit voorbeeld wordt de AUC uitgezet als functie van de dekking per allel voor de detectie van enkelvoudige mutante allelen in pools van 200, 500 en 1.000 allelen.

Hier is een UC uitgezet als functie van het totaal voor inserties, deleties en substituties. Deze foutplot toont de waarschijnlijkheid van het inbouwen van een foutieve base op een bepaalde positie. Het foutprofiel vertoont lage foutpercentages met een stijgende trend richting het 3'-uiteinde van de sequencing-read.

Opmerkelijk is dat verschillende referentienucleotiden verschillende foutkansen vertonen. Deze grafiek toont de nauwkeurigheid van splinter bij het schatten van de allelfrequentie voor posities met een dekking van meer dan 25-voudig per allel. Een vergelijking tussen de allelfrequenties van gepoold DNA geschat door splinter met de alleltellingen gemeten door genome-wide association studies of GWAS-resultaten.

Met een zeer hoge correlatie werd een populatie van 974 individuen geselecteerd en over 20 kilobases gericht gesequenced. Splinter werd toegepast voor de detectie van zeldzame varianten. Conform het standaardprotocol was voor elk individu vooraf genotypering uitgevoerd via gwas-concordantie tussen de genotypering van getagde en nieuwe varianten.

De resultaten voor de pooled sample waren uitstekend. Drie varianten, waarvan twee zeldzaam waren in de populatie, werden de novo geïdentificeerd op basis van de sequencing-resultaten en gevalideerd door individuele pyrosequencing; de minor allele frequencies of de mathematische concordantie tussen pyrosequencing en pooled sequencing was uitstekend. Zodra u uw zeldzame variant in uw pooled sample heeft gevonden, willen veel onderzoekers weten wat de functionele gevolgen zijn van de geïdentificeerde variant.

De annotatie van uw varianten is dus de volgende stap in het proces na de ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van DNA-sequencing om zeldzame varianten op een snelle en kosteneffectieve manier te bestuderen, om zo zeldzame varianten in grootschalige populatiestudies te karakteriseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe zeldzame sequentievarianten in een pool-DNA-monster kunnen worden gedetecteerd met behulp van splinter.