Name: Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Leer een snelle aspiratiemethode om menselijke embryonale stamcelkolonies te isoleren uit dichte co-culturen met muizenembryofibroblasten. Deze techniek behoudt de pluripotentie en integriteit van de kolonies voor verdere experimenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door een New Faculty Award II van het California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), en een NIH-gefinancierde National Research Award (F32-HL104924)

1. Voorbereiding van muis embryonale Feeders <ol><li> De MEF&#39;s die in de co-cultuur van hESC &#39;vooraf worden behandeld door bestraling of mitomycine-C om de cellen beletten ondergaan splitsing. </li><li> Twee uur voor MEF zaaien, vacht elke 60 mm plasma behandeld kweekschaal met 2 ml van 0,05% gelatine. </li><li> Ontdooien een flesje behandeld MEF en plaat bij ~ 20.000 cellen / cm 2. </li><li> Laat de cellen een nacht hechten. </li></ol> 2. Co-zaaien hESC &#39;s op MEF <ol><li> Nieuwe kolonies kan worden gestart vanaf gecryopreserveerd culturen of passage huidige culturen op nieuwe MEF-gecoate gerechten, zoals hieronder. </li><li> Was de plaat met de grote hESC kolonies worden gepasseerd 1 keer met 3 ml van verwarmde 1x PBS. </li><li> 3 ml collagenase IV / PBS oplossing (1 mg / ml) en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. (Opmerking: De cellen zullen niet worden onderscheiden of bal gezien met trypsine). </li><li> Terwijl de cellen nog in decollagenase, gebruik maken van een rand van een 5 ml pipet tip, maak een rasterpatroon op de koloniën, breken ze in kleine cel klonten. </li><li> Met de voorzijde van de pipet (gehouden in een loodrechte wijze in de petrischaal) aan de onderzijde van de petrischaal schrapen, loskomen alle cellen van het oppervlak. </li><li> Verzamel de cellen in een Falcon buis en draaien op (1000 rpm) gedurende 5 minuten. </li><li> Na centrifugatie zuigen het medium, waardoor de celpellet in het Falcon buis. </li><li> Zuig het MEF medium van de MEF geplateerde de dag ervoor. </li><li> Re-plate de cellen in een 1:3 verhouding van de oorspronkelijke plaat en feed met 3 ml van medium hESC </li></ol> 3. Afbrekende MEFs van de Co-cultuur Opmerking: Human ESC, mogen er bij hoge dichtheid gewoonlijk tussen 10 en 14 dagen kweken. <ol><li> Plaats de punt van een aspiratie pipet aan de rand van de plaat en laat de zuigkracht om voorzichtig omhoog te trekken aan de rand van de MEF vel. </li><li> Rerwijder de media van de schotel, en laat de tip om de cellaag te vangen en langzaam de punt te verplaatsen in een boog wijze boven de plaat. Opmerking: Het vel kan verstoppen in de punt van de pipet, maar dit is niet problematisch, aangezien het dient de gebruiker niet verhinderen handmatig trekken het vel van het oppervlak van de petrischaal. Als de cellen zitten vast aan het einde van de aspirator, kunt u gebruik maken van de top van de cultuur schotel te breken van de cellaag voor volledige aspiratie. </li><li> Onmiddellijk te vervangen hESC medium, en zet de plaat in de incubator. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Het eindresultaat van de MEF verwijderingsproces produceert kleine ongestoord hESC kolonies (figuur 1D) in staat om aanzienlijke uitbreiding ondergaan in zeer grote kolonies (figuur 2) met behoud van de expressie van pluripotentie makers SSEA-4, Oct ¾ en Tra 1 tot 81 (figuur 3). Figuur 1. ESC Colony Morfologie Before and After MEF verwijderen. Menselijke embryonale stamcellen Kolonies op A) dag 1 en B) dag 2 na het zaaien op cultuur gerechten. C) met hoge dichtheid Menselijke embryonale stamcellen Koloniën (H7), omringd door MEFs. De twee hESC kolonies worden geschetst in het rood streepjes. D) Na het MEF verwijderen met behulp van de beschreven aspiratie techniek, zijn we vertrokken met een geïsoleerde hESC kolonie met zeer weinig MEFs rond de intacte kolonie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig2.jpg" /> Figuur 2. ESC Colony Uitbreiding 10 dagen na MEF verwijderen. De oorspronkelijke hESC kolonie onmiddellijk na MEF uitputting (links) is toegestaan ​​om uit te breiden in een zeer grote kolonie (rechts) gebatterijvak ongeveer 800 urn, 10x. Merk op dat de oorspronkelijke kolonie wordt afgebeeld bij dezelfde vergroting (10x) als de samengestelde kolonie. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig3.jpg" /> Figuur 3. Immunokleuring van MEF-verarmde hESC kolonies. Immunofluorescente identificatie van de kolonies tot 10 dagen na de uitputting MEF blijkt dat kolonies hun expressie van pluripotentie markers zoals duidelijk door oktober ¾, SSEA-4, en Tra-1-81 kleuring behouden. Bovendien zijn deze hESC kolonies vertonen geen differentiatie naar een mesodermale lot, aangegeven door de afwezigheid van Flk-1. A, E, I en M) zijn doorgelaten licht beelden van de immunoflouscently gekleurde kolonies, 20, 10, 10 en 2x, . respectievelijk B, F, J, N en) laten nuclei -. DAPI gekleurde cellen van de immunofluorescently gekleurde kolonies, 20, 10, 10 en 2x respectievelijk CD) tonen de expressie vanmenselijke stamcellen marker SSEA-4 alleen, en samengesteld beeld, 20x. GH) tonen de uitdrukking van menselijke stamcellen marker oktober ¾ alleen, en samengesteld beeld, 10x. KL) tonen de uitdrukking van menselijke stamcellen marker Tra een-eenentachtig alleen , en samengesteld beeld, 10x. MP) De laatste rij als afbeeldingen tonen een kolonie uitbeelden van de typische gladde grenzen zien op deze vergroting, 2x, en deze kolonies niet express O) Flk-1, een vroege marker van mesoderm differentiatie, noch zij P) bevatten fibroblasten zoals blijkt uit afwezigheid van DDR2 kleuring. Aanvullende Video. Verwijderen Fibroblasten door Gezinsblad Aspiration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3951/3951movie1.mp4" target="_blank">Klik hier om naar de film te bekijken</a> .

<ol><li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li>
<li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li>
<li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li>
<li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc%2FhiPSc%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStein%2C+GS+%22Thawing%2C+Seeding%2C+and+Changing+Medium+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%22">Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells</a>. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De methode die in dit manuscript biedt een snelle en minder kostbaar alternatief voor het elimineren van fibroblast feeder-cellen uit menselijke embryonale cel culturen. De succesvolle verwijdering van fibroblasten is afhankelijk van het bestaan ​​van een strak confluente monolaag van deze cellen dat zich ontwikkelt in meer stamcelculturen. Na 7-10 dagen, zal de groeiende hESC kolonies druk op de feeder fibroblasten in buitenwaartse richting, het genereren van een steeds dichter wordende fibroblast monolaag tussen kolon...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> DDR2 </td><td> Santa Cruz </td><td> 7555 </td><td> Fibroblast Marker </td></tr><tr><td> Dapi </td><td> Calbiochem </td><td> 268298 </td><td> Celkern Marker </td></tr><tr><td> SSEA-4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td><td> Human ESC Marker </td></tr><tr><td> Oct 3/4 </td><td> Santa Cruz </td><td> 9081 </td><td> Human ESC Marker </td></tr><tr><td> Flk-1 </td><td> BD Pharma </td><td> 555307 </td><td> Vroege Differentiatie Marker </td></tr><tr><td> Tra-1-81 </td><td> Acris </td><td> AM20377AF4-S </td><td> Human ESC Marker </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Tabel van specifieke reaheren voor immunokleuring de hESC.

snelle fibroblast verwijdering uit high density menselijke embryonale stamcellen culturen

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Muis embryonale fibroblasten (MEF) werden gebruikt om menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;) culturen vastgesteld na blastocyst isolatie 1. Deze feeder systeem houdt hESC &#39;s uit die een spontane differentiatie tijdens celexpansie. Echter, deze co-cultuur methode is arbeidsintensief, vereist hoog opgeleid personeel, en de opbrengst lage hESC zuiverheid 4. Vele laboratoria hebben getracht het aantal voedercellen in hESC culturen (dwz waarin matrix beklede schalen of feeder cell types 5-8) te minimaliseren. Deze gemodificeerde kweeksystemen is enige belofte, maar nog niet verdrongen de standaard methode voor het kweken van hESC &#39;s met mitomycine C behandelde muizen embyronic fibroblasten om ongewenste spontane differentiatie van de hESC culturen vertragen. Daarom moet de voedingscellen in hESC expansie worden verwijderd tijdens differentiatie experimenten. Hoewel verschillende technieken beschikbaar voor het zuiveren van hESC colonies (FACS, MACS, of het gebruik van resistente vectoren) van feeders, deze technieken zijn arbeidsintensief, duur en / of destructief voor de hESC. Het doel van dit project was om een ​​methode van zuivering dat de oogst van een zuiverder bevolking van hESC &#39;s maakt uitvinden. We hebben gezien dat in een confluente hESC cultuur, de MEF bevolking kan worden verwijderd met behulp van een eenvoudige en snelle aspiratie van de MEF vel. Deze verwijdering is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder laterale cell-to-cell binding van MEFs dat een lagere bindingsaffiniteit voor de styreen kweekschaal hebben en het vermogen van de stamcellen koloniën fibroblasten buiten drukken tijdens de generatie van hun eigen &quot; niche &quot;. De hESC werden daarna onderzocht SSEA-4, Oct3 / 4 en Tra 1-81 tot expressie 10 dagen na verwijdering MEF onderhoud van pluripotentie waarborgen. Bovendien hESC kolonies in staat waren om te blijven groeien uit tot grotere formaties na MEF verwijdering, het verstrekken van een extra niveau van hESC expansie.

Ondanks aanhoudende inspanningen om de overgang culturen aan feeder-vrije omstandigheden, de afleiding en de cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijven grotendeels afhangen van co-culturen met muis embryonale feeders (MEF). Hier laten we zien een nieuwe methodologie voor het snel verwijderen van feeders van hESC culturen voorafgaand aan de experimenten.

Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen

Muizenembryonale fibroblasten (MEFs) werden gebruikt om culturen van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) te vestigen na isolatie van de blastocyste1. Dit feeder-systeem ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om menselijke stamcelkolonies op een snelle en efficiënte manier te isoleren. Dit wordt bereikt door menselijke embryonale cellen te kweken in een dichte laag van muizen embryonale fibroblasten. Na verloop van tijd vergroot de expansie van de stamcelpopulatie het aantal menselijke stamcellen, maar stelt hen ook in staat om eilandachtige kolonies te vormen in de massa.Vervolgens wordt de meth-laag via aspiratie verwijderd, waarbij de individuele kolonies van menselijke embryonale stamcellen achterblijven. De resultaten van immunohistochemische kleuring voor stamcelmarkers tonen aan dat dit een effectieve isolatiemethode is om feeder-cellen te elimineren en de integriteit van de kolonies te behouden. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode tijdens het co-cultiveren van cellen in ons laboratorium; ik wilde de stamcelculturen redden van de overconfluente cultuursystemen.Het probleem waar de meeste mensen met dit systeem mee zullen kampen, is een gebrek aan ervaring met het kweken van menselijke stamcellen. We vonden deze techniek bijzonder nuttig wanneer we grote aantallen menselijke embryonale stamcellen voor experimenten moe

rapid-fibroblast-removal-from-high-density-human-embryonic-stem-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de isolatie en het onderhoud van de primaire fibroblast culturen van de huid en longweefsel van wilde knaagdieren.

Tot vaststelling van primaire Adult Fibroblast Culturen van knaagdieren

Fibroblastgedrag ligt ten grondslag aan een spectrum van klinische entiteiten, maar ze blijven slecht gekarakteriseerd, grotendeels vanwege hun inherente heterogeniteit. Traditioneel fibroblastenonderzoek is afhankelijk van in vitro manipulatie, waardoor in vivo fibroblastgedrag wordt gemaskeerd. We beschrijven een FACS-gebaseerd protocol voor de isolatie van muishuidfisbroblasten dat geen celcultuur vereist.

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

We beschrijven een eenvoudige en snelle experimentele procedure voor het genereren van primaire fibroblasten uit de oren en staarten van muizen. De werkwijze vereist geen speciale dierendressuur en kan worden gebruikt voor het genereren van fibroblast cultures van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen.

Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues

Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Hier beschrijven we een klinisch relevante, hoog rendement, feeder-vrije methode om te herprogrammeren menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering factoren en volwassen microRNA-367/302 nabootst. Ook inbegrepen zijn methoden om herprogrammering efficiëntie, te beoordelen vouw klonale iPSC kolonies en bevestigen van de expressie van de pluripotent markering TRA-1-60.

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dit manuscript beschrijft een FACS-gebaseerd protocol voor isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid. Het omzeilt in vitro cultuur die onvermijdelijk was met de algemeen gebruikte isolatie protocol via explant culturen. De afkomstige fibroblast subsets zijn functioneel onderscheiden en display differentieel genexpressie en lokalisatie binnen de dermis.

Isolatie van papillaire en reticulaire fibroblasten van menselijke huid door fluorescentie-geactiveerde cel het sorteren

Dit protocol schetst een snelle methode voor het gelijktijdig genereren van melanocyt en fibroblast culturen uit de huid van 0-4 dag oude muizen. Deze primaire culturen kunnen in vitro worden gehandhaafd en gemanipuleerd om een verscheidenheid aan fysiologisch relevante processen te bestuderen, waaronder huidcelbiologie, pigmentatie, wondgenezing en melanoom.

Snelle aanmaak van primaire Murine melanocyten en fibroblast-culturen

We presenteren een protocol om primaire volwassen fibroblasten op een eenvoudige, snelle en betrouwbare manier te isoleren, die door beginners kunnen worden perforeerbaar (bijv. studenten). De procedure combineert enzymatische weefsel spijsvertering en mechanische opwinding met ultrasone golven om primaire fibroblasten te verkrijgen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke experimentele eisen (bijv. menselijk weefsel).

Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

We presenteren hier een methode die het gebruik van chemische epigenetische wissing combineert met mechanosensing-gerelateerde signalen om efficiënt pluripotente cellen van zoogdieren te genereren, zonder de noodzaak van gentransfectie of retrovirale vectoren. Deze strategie is daarom veelbelovend voor translationele geneeskunde en vertegenwoordigt een opmerkelijke vooruitgang in stamcelorganoïde technologie.

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

Hier wordt een protocol gepresenteerd om gemanipuleerde bindweefsels te genereren voor een parallelle kweek van 48 weefsels in een multi-well plaat met dubbele polen, geschikt voor mechanistische studies, ziektemodellering en screeningstoepassingen. Het protocol is compatibel met fibroblasten van verschillende organen en soorten en wordt hier geïllustreerd met menselijke primaire cardiale fibroblasten.

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Leer een snelle aspiratiemethode om menselijke embryonale stamcelkolonies te isoleren uit dichte co-culturen met muizenembryofibroblasten. Deze techniek behoudt de pluripotentie en integriteit van de kolonies voor verdere experimenten.

Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen

Meer video's verkennen