Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen

Het algemene doel van het volgende experiment is om menselijke stamcelkolonies op een snelle en efficiënte manier te isoleren. Dit wordt bereikt door menselijke embryonale cellen te kweken in een dichte laag van muizen embryonale fibroblasten. Na verloop van tijd vergroot de expansie van de stamcelpopulatie het aantal menselijke stamcellen, maar stelt hen ook in staat om eilandachtige kolonies te vormen in de massa.

Vervolgens wordt de meth-laag via aspiratie verwijderd, waarbij de individuele kolonies van menselijke embryonale stamcellen achterblijven. De resultaten van immunohistochemische kleuring voor stamcelmarkers tonen aan dat dit een effectieve isolatiemethode is om feeder-cellen te elimineren en de integriteit van de kolonies te behouden. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode tijdens het co-cultiveren van cellen in ons laboratorium; ik wilde de stamcelculturen redden van de overconfluente cultuursystemen.

Het probleem waar de meeste mensen met dit systeem mee zullen kampen, is een gebrek aan ervaring met het kweken van menselijke stamcellen. We vonden deze techniek bijzonder nuttig wanneer we grote aantallen menselijke embryonale stamcellen voor experimenten moesten isoleren. Vergeleken met andere methoden, zoals sorteren of het handmatig selecteren van stamcelkolonies, is deze methode sneller en efficiënter voor het isoleren van kolonies uit hoogdichte culturen.

De muis-embryonale fibroblasten moeten vóór het co-cultiveren met embryonale stamcellen worden behandeld met mitomycine C of worden bestraald om te voorkomen dat ze delen. Twee uur vóór het zaaien van de MEF's moet elke plasma-behandelde kweekschaal van 60 millimeter worden gecoat met twee milliliter 0,05% gelatine. Ontdooi een vial met behandelde MEF's, centrifugeer vijf minuten bij 1.500 RPM en zaai een cultuur van ongeveer 20.000 cellen per vierkante centimeter op de gelatine-gecoate schaal. Incubeer de cultuur overnight voor celladherentie. Nieuwe culturen kunnen worden gestart vanuit cryopreservaten of door het overplaatsen van bestaande culturen naar MEF-gecoate schalen. Wanneer er wordt gestart met een plaat die grote humane embryonale stamcelkolonies bevat, was deze dan één keer met drie milliliter opgewarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Voeg drie milliliters van een één milligram per milliliter collagenase vier-oplossing toe en incubeer gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 °C. De cellen zullen niet individueel gescheiden worden of samenklonteren zoals bij trypsin gebeurt. Maak met de rand van een vijf milliliter pipetpunt een ruitpatroon in de kolonies en breek deze op in kleine celklonters.

Houd nu het uiteinde van de pipetpunt loodrecht op de kweekplaat, schraap de bodem van de kweekplaat en laat alle cellen van het oppervlak los. Breng de cellen over in een Falcon-buis om de cellen te oogsten, centrifugeer 5 minuten bij 1000 RPM en aspireer het medium weg. Aspireer vervolgens het medium van de muizen-embryonale fibroblasten die de vorige dag zijn uitgeplaat.

Zaai vervolgens de humane embryonale stamcellen uit in een verhouding van één op drie vanuit de oorspronkelijke plaat en voed deze met drie milliliters humaan embryonaal stamcelmedium. De humane HECS worden gedurende 10 tot 14 dagen op hoge dichtheid gekweekt. Plaats de punt van een aspiratiepipet aan de rand van de plaat en gebruik zuigkracht om de rand van het meth-vel voorzichtig op te tillen.

Verwijder het medium uit de schaal. Laat de tip het cellaam vastpakken en beweeg de tip vervolgens langzaam in een boogvormige beweging boven de plaat. Als het laken de pipet grotendeels verstopt, verwijder het laken dan uit de cultuur.

Tik met een aspirator tegen de bovenkant van de kweekschaal om de cellen volledig te dissociëren en verwijder de cellen door middel van volledige aspiratie. Vervang onmiddellijk het medium voor menselijke embryonale stamcellen en plaats de kweek na het uitplaten op kweekschalen terug in een celkweekincubator. Dit co-kweeksystem resulteert in menselijke embryonale stamcelkolonies met een hoge dichtheid, omringd door embryonale fibroblasten van muizen.

De aspiratietechniek verwijdert het MES en produceert kleine, ongestoorde kolonies van menselijke embryonale stamcellen. Omdat er zeer weinig MES rondom de intacte kolonie overblijft, kunnen de embryonale stamcelkolonies een aanzienlijke expansie ondergaan tot zeer grote kolonies. Zo is deze kolonie van menselijke embryonale stamcellen, getoond direct na meth-depletie, uitgegroeid tot een zeer grote kolonie bij immunofluorescente identificatie van kolonies tot 10 dagen na de meth.

Depletie laat zien dat kolonies hun expressie van pluripotentiemarkers behouden en geen differentiatie vertonen richting het mesodermale lot. Deze transmissielichtbeelden tonen de morfologie van immunofluorescent gekleurde kolonies bij verschillende vergrotingen. DAPI kleurt de kernen van de cellen.

Belangrijk is dat de menselijke embryonale stamcellen de menselijke stamcelmarkers SS EEA four T drie vier en TRA 180 1 tot expressie brengen. Merk op dat de afbeeldingen een kolonie tonen met de typische gladde randen. Ze brengen FLK one, een vroege marker voor mesodermdifferentiatie, niet tot expressie, noch bevatten ze fibroblasten, zoals blijkt uit de afwezigheid van DDR twee-kleuring.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe menselijke stamcelkoloniën kunnen worden geïsoleerd met behulp van kweektechnieken om natuurlijke omgevingen te manipuleren. Zodra u dit beheerst, kan dit in enkele seconden worden gedaan. Vergeet bovendien niet om te voorkomen dat uw kweken uitdrogen bij het verwijderen van het medium en de lagen vuil.