Het vervaardigen van een dubbellagige Hydrogel om ASC differentiatie Controle

Het algemene doel van deze procedure is om een samengestelde matrix te maken die is gemaakt van natuurlijke biomaterialen en die kan worden gebruikt om stamcellen te leveren en te differentiëren om wondgenezing te bevorderen. Dit wordt bereikt door eerst adipogene afgeleide stamcellen of een SC van een proefdier te isoleren. Vervolgens worden de A SC geladen op vooraf gemaakte chitosan-microsferen.

Vervolgens wordt FIBRILLEERDE collageengel gegoten, en worden de A-S-C-C-S-M-kralen over de collageengel gelaagd. Ten slotte wordt PEG-fibrinegel over de A-S-C-C-S-M-collageengel gegoten en wordt medium toegevoegd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de bidirectionele gelijktijdige migratie van A SC van de CSM-kraal in zowel collageen- als PEG-fibrinematrices laten zien.

Door deze procedure kan een enkele stamcelbron differentiële signalen opnemen van de collageen- en PEG-fibrine-micro-omgevingen, en differentieel worden gestimuleerd om pleiotrope factoren te produceren en een netwerk van pre-vasculaire structuren te vormen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals composieten van één materiaal of gedecellulariseerde huidsubstituten, is dat deze andere producten niet actief de hervascularisatie van het product door de gastheer aanpakken. We kregen het idee voor deze methode toen we opmerkten dat geïsoleerde RAD A SE de neiging heeft om te differentiëren naar een vasculair fenotype wanneer het wordt gekweekt in een varkensfibrinematrix.

Deze observatie leidde tot de gedachte dat een enkele stamcelbron gelijktijdig zou kunnen worden gebruikt in een systeem dat uit verschillende biomaterialen bestond. Na het isoleren en kweken van adipogene afgeleide stamcellen of ASC's, het bereiden van chitosan-microsferen of CSM's en het laden van de ASC's in de CSM's, bereid polyethyleenglycol, fibrinehydrogel door succinyl glut derate gemodificeerd peg op te lossen in vier milliliter tris-gebufferd zoutoplossing. Gebruik vlak voor het experiment een 0,22 micron filter om de oplossing te steriliseren.

In een kweekputje van een zes-putjesplaat, meng 500 microliter fibrinogeen stock en 250 microliter PEG stock gedurende 20 minuten in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius. Meng vervolgens 250 microliter van eerder bereid A-S-C-C-S-M met de gepegyleerde fibrinogeenoplossing, voeg onmiddellijk een milliliter thrombin stockoplossing toe en gebruik een pipetteerder om snel één of twee keer te tri rateer, plaats het cellengelmengsel onmiddellijk in een 12-putjesplaat en incubeer in een 5% koolstofdioxide bevochtigde kamer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Was vervolgens de resulterende peg fibrine twee keer met HBSS en incubeer met alfa minimaal essentieel medium gesupplementeerd met 10% FBS in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met behulp van standaard lichtmicroscopietechnieken gedurende een periode van 11 dagen.

Observeer de migratie van cellen van de CSM naar het gelmengsel, A-S-C-C-S-M met type één collageen geëxtraheerd uit rattenstaarten met behulp van twee normale natriumhydroxide. Pas de pH aan op 6,8 en fibrilleer. Voeg het fibrilleerde collageen, A-S-C-C-S-M mengsel toe aan een 12-putjesplaat en incubeer in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Na controle of de fibrillatie voltooid is, incubeer de collageen A-S-C-C-S-M gels maximaal 11 dagen in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius. Observeer de migratie van cellen uit CSM in het gel gedurende een periode van 11 dagen met behulp van standaard microscopietechnieken om de bilagconstructie te ontwikkelen om de migratie- en co-inductie-eigenschappen van een enkele stamcelbron te bestuderen. Met behulp van twee bioscaffolds.

Bereid zowel het collageen als het PEG-fibrinegel met de volgende lichte wijzigingen, bereid een milliliter van 7,5 milligram per milliliter collageen. Breng vervolgens het mengsel over in een zes-putjes weefselcultuurinzetstuk en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na volledige fibrillatie, leg 200 microliter van vijf milligram A-S-C-C-S-M in kweekmedium over het collageenoppervlak.

Nadat de microsferen zich over het gel hebben gezet, bereid het PEG-fibrinegel met behulp van 250 microliter kweekmedium. Breng vervolgens de gepegyleerde fibrinogeen-thrombineoplossing aan over de A-S-C-C-S-M collageenlagen. Eenmaal voltooid, incubeer de constructies gedurende 30 minuten in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator om volledige atie te bereiken.

Plaats ten slotte een milliliter medium in de bovenste kamer over het construct en drie milliliter medium in de onderste kamer. Karakterisering van een SC ingebed in dit scaffold onthulde dat een SC geladen CSM's tussen een laag collageen en peg fibrine tegelijkertijd en differentieel signalen kan opnemen uit beide extracellulaire omgevingen om onder hun nieuwe omstandigheden te gedijen. Zoals hier getoond, ondersteunde collageen het vermogen van ASC's om stamcellen te blijven, zoals werd aangetoond door hun expressie van stro een in groen, evenals hun fibroblast-achtige morfologie.

In tegenstelling hiermee, induceerde PEG-fibrine de ASC's om zich te differentiëren naar een avasculair fenotype, zoals wordt aangetoond door hun buisvormige morfologie hier getoond, compleet met lumen en hun endotheelcelspecifieke expressie van von Willow brandand factor hier getoond in rood. Bovendien, zoals hier wordt aangetoond, leken deze waargenomen fenotypen vroeg in cultuur op te treden en werden ze gedurende 11 dagen gehandhaafd. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u rat-adipogene afgeleide stamcellen kunt isoleren, ze op chito en microsferen kunt laden en ze kunt incorporeren in een bilaghydrogel met behulp van door de FDA goedgekeurde biomaterialen.

Vergeet niet dat de biomaterialen en cellen die in dit protocol worden gebruikt, afkomstig zijn van dieren