Rat mesenterium uittreding: een model voor het onderzoeken van de Cellular Dynamics betrokken bij het Angiogenese

Het doel van het volgende experiment is om de ruimtelijke en temporele cellulaire dynamiek te identificeren die betrokken is bij angiogenese, gedefinieerd als de groei van nieuwe bloedvaten vanuit bestaande vaten. Gebruik een eenvoudig reproduceerbaar model om eerst angiogenese te stimuleren door het mesenterium van de rat kortstondig naar buiten te brengen en oogst mesenteriumweefsels op verschillende tijdstippen na stimulatie. Label vervolgens de weefselcoupes via immunolabeling.

Gebruik bijvoorbeeld een endotheelcelmarker om de volledige remodellerende vasculatuur binnen een weefsel te visualiseren en creëer een essentiële tweedimensionale weergave van groeiende microvasculaire netwerken. Dit model is aantrekkelijk omdat het in een relatief kort tijdsbestek een dramatische toename in meerdere angiogene metrieken teweegbrengt. Het visualiseren van netwerken op enkelcelniveau en de correlatie van deze metrieken met multicellular labeling is uiterst nuttig gebleken bij het identificeren van nieuwe celtypen die betrokken zijn bij capillaire uitlopers.

Deze methode zou kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de cellulaire dynamiek die betrokken is bij de groei van het microvasculaire netwerk. Hiertoe behoort wanneer en waar specifieke cellen aanwezig zijn tijdens het proces van capillaire uitloop. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat deze eenvoudig is, minimale chirurgische interventie vereist en een robuuste angiogene respons produceert over een relatief korte periode.

Bovendien wordt er gebruikgemaakt van het rap-mesenterium, een weefsel dat observatie van een intact netwerk tot op het niveau van individuele cellen mogelijk maakt. Uit onze ervaring blijkt dat deze methode zeer eenvoudig aan te leren en daardoor reproduceerbaar is tussen verschillende onderzoekers bij het demonstreren van de procedure. Vandaag zal Peter Stapler, een promovendus in ons laboratorium, de operatie voorbereiden zoals gedetailleerd in de bijbehorende tekst.

Na het scheren van de buikregio van de rat wordt de geanestheseerde rat op de rug op een warmtemat geplaatst om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Reinig de buikregio door afwisselend te vegen met steriele gazen gedrenkt in 70% isopropylalcohol en jodium. Maak ongeveer 2,5 cm onder het borstbeen een kleine longitudinale incisie langs de huid en vervolgens de linea alba. Plaats het vooraf uitgesneden afdekdoek over het buikgedeelte, zodat de opening is uitgelijnd met de incisie. Oefen voorzichtig druk uit rond de incisie om de dunne darm bloot te leggen. Trek met wattenstaafjes voorzichtig een sectie van de dunne darm naar buiten, waarbij het mesenterium op het plastic plateau met steriele zoutoplossing wordt gelegd, en lokaliseer het ileum.

Identificeer zes tot acht gevasculariseerde mesenteriale vensters, het dunne doorschijnende membraan tussen de arterie-vene-paren die de dunne darm voeden. Noteer het starttijdstip van de exteriorisatie en stel een timer in voor 20 minuten. Markeer de twee centraal gelegen mesenteriale vensters met een steriele 7-0 hechtdraad in het vetweefsel nabij de darm.

Vul de zoutoplossing in de Petrischaal met tussenpozen bij met een steriele spuit van vijf milliliter om ervoor te zorgen dat het weefsel ondergedompeld en vochtig blijft. Plaats het mesenterium na de periode van exteriorisatie terug in de buikholte. Sluit de buikspieren met een onderbroken hechting met behulp van 5-0 monofilament hechtdraad.

Sluit vervolgens de huid met 4-0 monofilaat hechtmateriaal in een onderbroken hechtpatroon, veeg het hechtgebied schoon met afwisselende vegen met steriel gaas gedrenkt in 70% isopropylalcohol en jodium om te verspreiden, breng smeergel aan op beide ogen van de rat en plaats deze terug in de kooi voor herstel. Anestheseer en euthanaseer de rat op de gewenste dag, na de stimulatie, volgens de institutionele richtlijnen. Open vervolgens de buikholte opnieuw en bedek het buikgebied met een stuk vershoudfolie. Trek nu voorzichtig de dunne darm naar buiten en lokaliseer de twee gemerkte vensters met behulp van een pincet en microschaar.

Snijd elk van de geëxterioriseerde mesenteriale vensters uit, inclusief een rand van vet. Probeer te voorkomen dat er door arterie-vene-paren binnen de vetrand van de vensters wordt gesneden om een mogelijke bloedvulling van de vensters te minimaliseren. Minimaliseer daarnaast het doorsnijden van de darm om het vrijkomen van darmflora te voorkomen.

Dompel elk venster onmiddellijk in PBS na het contact. Gebruik vervolgens een pincet om de weefsels te spreiden op positief geladen microscoopglas. Monteer twee weefsels per objectglas. Nadat de weefsels gedeeltelijk zijn opgedroogd, wordt het overtollige vet met een scalpelblad verwijderd.

Fixeer de monsters gedurende 30 minuten in methanol bij -20 °C door ze in de vriezer te plaatsen. Droog de objectglazen in vacuüm om overtollige bufferoplossing te verwijderen. Omtrek daarnaast de weefsels met een waspen om te voorkomen dat antilichaamoplossingen ongecontroleerd wegvloeien van het weefsel.

Druppel nu ongeveer 200 µL van de verdunde primaire antilichaamoplossing over het weefsel om het geheel te bedekken. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur en was de weefsels met PBS plus 0,1% sapin met drie bufferwisselingen. Voeg vervolgens de strep avidin peroxidase secundaire antilichaamoplossing toe en incubeer één uur bij kamertemperatuur; na drie wasbeurten worden de monsters 15 minuten geïncubeerd in Vector Nova Red.

Spoel met water om de coupes op de objectglazen te monteren. Dompel de glazen 10 keer in 95% ethanol, gevolgd door opeenvolgende dehydratiestappen. Laat de objectglazen drogen, bedek de weefsels met een dunne laag medium en breng na vacuümdrogen en markeren de dekglasjes aan.

De coupes. Bedek de weefselmonsters met de verdunde primaire antilichaamoplossing. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Was drie keer met PBS plus 0,1% saponine gedurende 10 minuten per wasbeurt. Voeg vervolgens het secundaire antilichaam toe en incubeer dit gedurende één uur. Voer wasbeurten uit in PBS plus 0,1% saponine, monteer de preparaten in PBS met glycerol en seal deze met nagellak.

Hier beschrijven we in detail de aanpassing van een gangbare Petrischaal voor gebruik als chirurgische ondergrond. Gele boetseerklei werd gebruikt om een glad oppervlak te creëren zodat het mesenterium door het voorgeborene gat getrokken kon worden. Opnieuw worden de mesenteriale vensters, hier getoond op de ondergrond tijdens de periode van externalisatie, gedefinieerd als de dunne doorschijnende membranen tussen de arterie-vene-paren die de darm hier van voeding voorzien.

PCAM-labeling identificeert alle vaattypen langs de hiërarchie van remodellerende microvasculaire netwerken op specifieke tijdstippen na externalisatie. Deze beelden kunnen worden gebruikt om angiogene metrieken te kwantificeren op specifieke tijdstippen na stimulatie.

PCAM-labeling maakt het mogelijk om arteriën te onderscheiden van venen. Let op dat de toevoerende arteriën doorgaans kleinere diameters en een langgerekte morfologie van de endotheelcellen vertonen in vergelijking met de gepaarde venen. Typische kenmerken van remodelleringsnetwerken zijn het gevasculariseerde oppervlak, capillaire uitlopers en de vaatdichtheid.

Kwantificering van deze verschillende angiogene parameters kenmerkt het verloop van de netwerkgroei. Capillaire uitloop uit bestaande vaten bereikt een piek tussen dag drie en dag vijf en keert tegen dag 10 terug naar het ongestimuleerde niveau. Deze voorbijgaande toename van de uitloop wordt in ons laboratorium gevolgd door een toename van het gevasculariseerde oppervlak en de vasculaire dichtheid.

Dit modelsysteem is gebruikt om nieuwe cellulaire fenotypische veranderingen te identificeren op specifieke tijdspunten tijdens dit remodelleringsproces. De immunofluorescente PCA-labeling kleurt endotheelcellen rood, terwijl labeling voor klasse drie bèta-tubuline zenuwen en parasieten langs angiogene vaten groen kleurt. Opmerkelijk is dat de expressie van klasse drie bèta-tubuline in ongestimuleerde weefsels zenuwspecifiek is.

In tegenstelling hiermee wordt tijdens de piek van de capillaire uitlopers class three bèta-tubuline tot expressie gebracht door perivasculaire cellen. Dit type resultaat benadrukt het nut van dit eenvoudige en robuuste angiogene model voor het identificeren van nieuwe celtypen die betrokken zijn bij het angiogene proces. Tegen dag 10 begint het expressiepatroon van class three bèta-tubuline terug te keren naar het ongestimuleerde scenario.

Dit model zou potentieel ook gebruikt kunnen worden voor studies naar cellijnen. De haalbaarheid van celincorporatie in remodellerend mesenteriaal weefsel wordt ondersteund door deze preliminaire studies, waarin vooraf gelabelde beenmergcellen of mesenchymale stamcellen via superfusie over mesenteriale vensters werden aangebracht tijdens de 20 minuten durende exteriorisatieperiode. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe ons rat mesenterium-interiorisatiemodel kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de cellulaire dynamiek die betrokken is bij de groei van microvasculaire netwerken.

Deze eenvoudige techniek kan in ongeveer 45 minuten tot één uur worden uitgevoerd. Onthoud dat het cruciaal is om het mesenteriëum voorzichtig te behandelen en te voorkomen dat er vaten worden doorprikt na een chirurgische ingreep. Immunolabeling kan worden uitgevoerd om meerdere celtypen langs de bloedvaten te identificeren.

U kunt ook labelen voor lymfevaten en zenuwen. Hierdoor kunnen we niet alleen de cellulaire fenotypische veranderingen onderzoeken die betrokken zijn bij angiogenese, maar ook de coördinatie tussen angiogenese, neurogenese en lymfangiogenese.