Name: Solubilisatie en Bio-vervoeging van Quantum Dots en bacteriële toxiciteit Testen door de groeicurve en Kiemgetal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Leer de solubilisatie en bioconjugatie van CdTe quantum dots met antibiotica voor antibacteriële toepassingen. Deze methode helpt onderzoekers nieuwe antimicrobiële agentia te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de NSERC Individuele Discovery-programma, de NSERC / CIHR Collaborative Health Research Program (CHRP), en de NSERC CREATE Canadese Astrobiologie Training Program (CATP).

1. QD solubilisatie Dit is een methode geschikt voor CdTe. Dergelijke werkwijzen kunnen worden gebruikt met andere soorten QD zoals InP / ZnS 20 en CdSe / ZnS 21. <ol><li> Een oplossing van CdTe QD in tolueen bij 15 uM (optische dichtheid = 2,5 de eerste exciton piek). </li><li> Overdracht 200 pi van dit bestand in een glazen flacon. Gebruik geen plastic! </li><li> Voeg 800 ul tolueen, 1 ml 200 mM boraatbuffer (pH 9) en 2 pi van 11,5 M mercaptopropionzuur (MPA). </li><li> Cap de flacon en schud krachtig het voor 30-60 seconden. </li><li> De waterige en organische-solvent fasen spontaan te scheiden. De waterige fase wordt de kleur van de QD worden. Om de tolueen laag te voorkomen, verwijdert u deze en gooi hem weg. Breng het waterfase in een schone flacon. </li><li> Zuiver de opgeloste QDs door wassen / filtreren viermaal met 500 ul, 10000 molecuulgewicht cutoff centrifuge filter. De filters dienengesponnen bij 3000 g gedurende 13 minuten. Voor ten minste de laatste twee wasbeurten, wassen met de gewenste uiteindelijke buffer. </li><li> Na de laatste wassing, schorsen gewassen QD in 50 mM boraatbuffer op de gewenste pH en bewaren bij 4 ° C. Zij stabiel gedurende 1-2 weken. </li><li> Meet de absorptie en emissie spectra om de concentratie op basis van gepubliceerde formules 22 schatten. </li></ol> Representatieve resultaten: Figuur 1 een afbeelding van CdTe QD onder UV lamp belichting en emissiespectra voor en na water oplosbaar, met verwaarloosbare verandering van de dop uitwisseling. De grootte waarden de kerndiameter gemeten door elektronenmicroscopie. 2. QD Conjugatie met antibiotica Dit deel van het protocol is van toepassing op alle negatief geladen water opgeloste nanodeeltjes, waaronder de meeste commerciële QDs, metaal deeltjes, en nog veel meer 19. <ol><li> Elke molecuul werkt dat eithre zelf monteert het negatief geladen opgelost QDs, of een reactieve groep kan worden geconjugeerd, zoals een primair amine. In dit voorbeeld gebruiken we polymyxine B (PMB), die positief geladen is en zelf-assembleert, zonder noodzaak voor conjugatie reagentia. Los het PMB in H2O bij 60 pM. (Als gekozen antibiotica niet oplosbaar is in H2O, opgelost in DMSO of ethanol bij een concentratie van 0,1-1 mM). Dit 10x oplossing (H 2 O) of een 100x oplossing (oplosmiddel) zijn. </li><li> Bereken hoeveel QD oplossing die u nodig heeft voor de bacteriële toxiciteit experimenten. Voor een 96-wells plaat met 0,3 ml per putje in quadruplicates wordt 0,5 ml van 200 nM conjugaat nodig. Bereid twee buizen die 100 ul 1 uM quantum dots in 50 mM boraatbuffer. </li><li> Indien koppeling met een primair amine, stelt een 19 mg / ml (100 mM) oplossing van 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) in H2O EDC in oplossing is niet stabiel, Het gebruik ervan en gooi de rest weg. </li><li> Voeg 50 pi van de 10x antibioticum oplossing (H 2 O) of 5 pi van de 100x oplossing (oplosmiddel) naar de buis conjugaat. Voor PMB: CdTe conjugatie aan mol-verhouding van 30:1, voeg 50 ul van 60 uM PMB. Voeg H 2 O of oplosmiddel om de QD enige controle buis. </li><li> Indien nodig voeg 1 pi van de EDC stockoplossing het conjugaat buis. </li><li> Breng het conjugaat volume tot 0,5 ml met de geschikte buffer (boraatbuffer of PBS, geen amine bevattende buffers zoals Tris, omdat zij EDC remmen). </li><li> Shield buizen tegen licht af met aluminiumfolie en plaats op een nutator of rocker gedurende 1 uur. Als aggregatie optreedt, herhaalt u de vervoeging met lagere concentraties van antibiotica. Titreer de concentratie naar boven totdat de deeltjes niet aggregaat. </li><li> Was de conjugaten door het passeren door middel van een geschikt filter. 10000 moleculair gewicht cutoff werkt voor de meeste antibiotica, maar niet voor eiwitten of antilichamen. </li&gt; <li> Afhankelijk van de molecule, kunnen verschillende methoden worden toegepast om het aantal moleculen per antibioticum QD schatten: absorptie of fluorescentiespectroscopie, gelelektroforese of Fourier transform infraroodspectroscopie (FTIR). </li></ol> Representatieve resultaten. In dit voorbeeld is PMB conjugatie gekenmerkt door veranderingen in QD emissiespektrum. Figuur 2 toont het spectrum van CdTe QD met PMB toevoeging. 3. Voorbereiding van bacteriën voor 96-wells Screen; Bepaling van de antibiotica IC 50 Dit geldt voor bijna elke bacteriële stam gekweekt in het geschikte medium 18. De exacte duur van de opnames moet blijven hangt af van de bacteriële groei. In ons voorbeeld gebruiken we Escherichia coli gekweekt in lysogeny bouillon (LB) medium. <ol><li> Om te kiezen passende QD conjugaat concentraties is het belangrijk om de kennisIC50 van het antibioticum om geconjugeerd en als de QD alleen toxisch. Dit moet begonnen 2 dagen voor de conjugatie experiment. &#39;S Avonds zaad 10 ml bacteriële groei medium uit een nieuw kolonie, met behulp van de juiste steriele en bioveiligheid techniek. </li><li> De volgende dag 1-2 uur voor het experiment vullen ieder van de putten van een duidelijke bottom-96-wells plaat met een bijna maximale hoeveelheid groeimedium. Met behulp van een multichannel pipet, zaad elke well met 1-50 ul van bacteriële cultuur (de concentratie zal afhangen van hoe snel de specifieke stam groeit en zal moeten worden gekalibreerd door het laboratorium). </li><li> Zet de plaat op de plaat lezer en zet deze op elke 10 minuten gedurende 2 uur te lezen op een bepaalde golflengte (meestal 600 nm). Monitor de plaat, zodat de bacteriën groeien niet te dicht te snel. </li><li> Wanneer de cellen alle OD = 0.1-0.15 bereiken, verwijder de plaat van de plaat lezer en stop de opname. </li><li> Alone Toevoegen drugs-en QD&#39;s alleen opverschillende concentraties ten minste triplo. Gebruik een zijde van de plaat als &quot;donker&quot; control en een half te verlichten. Een voorgestelde inrichting wordt gegeven in Figuur 3. De concentraties moeten bestrijken een grote scala genoeg is om een ​​concentratie die de bacteriën remt heel weinig, en een die ze allemaal doodt op te nemen. </li><li> Bescherm de &quot;donkere&quot; kant van de plaat af met aluminiumfolie. Ver andere zijde van een lamp op de gewenste golflengte. We maken gebruik van een aangepaste 96-well, 440-nm lamp gemaakt van 2,4 mW LED&#39;s (figuur 4) en stralen gedurende 30-60 minuten. De zwarte platen met heldere bodem te helpen beschermen de niet-blootgestelde bacteriën van strooilicht. Een lege kolom kan ook gebruikt worden tussen de belichte en niet-blootgestelde zijde. </li><li> Na blootstelling aan licht, zet de plaat in de plaat lezer en opnemen van OD 600 elke 10 minuten voor 5-12 uur, afhankelijk van de groeisnelheid. Zodat de temperatuur &lt;32 ° C indien mogelijk vermeden drogen van de culturen. </li><li> Zet de groeicurvenop een gewenst tijdstip tegen log [concentratie] en stelt de IC50 van het antibioticum met de Hill vergelijking: </li></ol><img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> waar H is de Hill-coëfficiënt, y max is het hoogste punt van de groei (bij voorkeur op een plateau), en y min is de nul-punt, ook bij voorkeur op een plateau. Het is onwaarschijnlijk dat QD alleen zal veel toxiciteit de cellen bij de toegepaste concentraties dus een waarde niet bepaald. Representatieve resultaten. Aan het einde van de opname periode zal duidelijk putjes geeft volledig celdood en een helling van celdichtheid moet verschijnen aan toenemende concentraties van het geneesmiddel. De bacteriën te laten S-vormige groeicurves (figuur 5 A), de ligging van het maximum plateau zal sterk afhankelijk van stam tot stam en ook afhankelijk van de temperatuur. Een bepaald tijdstip kangekozen als vertegenwoordiger en de waarden die zijn uitgezet tegen log [antibiotica] om de IC 50 (Figuur 5 B). Om QD toxiciteit te evalueren, te overleven tegen log [QD] kan ook worden uitgezet, maar het bereiken van belangrijke bacteriën doden met QD&#39;s alleen is zeldzaam (Figuur 5 C). 4. Voorbereiding van bacteriën voor 96-wells-scherm met antibiotica / QDs <ol><li> De dag voor het experiment, zaad 10 ml van de cultuur van een verse kolonie in de juiste rijk medium, met behulp van de juiste steriele en bioveiligheid techniek. De QD-antibiotica conjugaat moet worden voorbereid op deze dag, tenzij het zeer instabiel. </li><li> 1-2 uur voor het experiment vullen ieder van de putten van een duidelijke bottom-96-wells plaat met een bijna maximale hoeveelheid groeimedium. Een meerkanaalspipet zaad elk putje met 1-50 ul van bacteriële kweek. </li><li> Zet de plaat op de plaat lezer en zet deze op elke 10 minuten gedurende 2 uur te lezen op dezelfde golflengte als in deel 3.</li><li> Wanneer de cellen alle OD = 0.1-0.15 bereiken, verwijder de plaat van de plaat lezer en stop de opname. </li><li> Voeg QD conjugaten bij verschillende concentraties ten minste viervoud. Gebruik een zijde van de plaat als &quot;donker&quot; control en een half te verlichten. Een suggestie voor een lay-out wordt gegeven in figuur 6. Een bacterie-only control strip moeten altijd worden opgenomen in geval problemen met de cultuur, temperatuur, enz. van invloed op de groei omstandigheden. Een strook van het geneesmiddel slechts en QD alleen moeten eveneens worden opgenomen om ervoor te zorgen dat zij de controle plaat eerder heeft gedaan evenaren. De rest van de putten zijn gewijd aan conjugaten zodat goede statistische. </li><li> Bescherm de &quot;donkere&quot; kant van de plaat af met aluminiumfolie. Ver andere zijde van een lamp op de gewenste golflengte. </li><li> Na blootstelling aan licht, zet de plaat in de plaat lezer en opnemen van OD 600 elke 10 minuten voor 5-12 uur. Houd de temperatuur &lt;32 ° C indien het mogelijk om dr te voorkomenying van de culturen. </li></ol> Representatieve resultaten. De combinatie van QD&#39;s en antibiotica kan alleen zijn minder giftig dan antibiotica, even toxisch, of meer toxisch. Dit kan worden gekwantificeerd met de groeicurven en IC50 metingen. Figuur 7 toont een voorbeeld van conjugaten die even toxisch als antimicrobiële alleen, en een voorbeeld van conjugaten die nog giftiger. 5. Plate Count <ol><li> Kies een of meer bronnen van de behandelde plaat met 96 putjes die worden gebruikt voor seriële verdunningen en kolonie tellen. </li><li> Een verdunning van elk van de geselecteerde bacteriële monsters met PBS en zoutoplossing (0,9% NaCl). Breng 20 pl van de bacteriële en vul het met 180 ul zoutoplossing, wijzigt u de pipetpunt, mix en over te dragen 20 ul van de verdunde bacteriële oplossing voor 180 ul zoutoplossing. Herhaal 6 keer. </li><li> Neem 10 pi van elke verdunning en de plaat op een passende<html> vaste media plaat. Alle 8 concentraties van een monster kan worden uitgeplaat op een 10 cm ronde petrischaaltje maar rechthoekige schotels voorkeur omdat het gemakkelijker is om dingen uitgelijnd. </li><li> Laat het drogen op de bank gedurende 15 minuten. dan incuberen bij de juiste temperatuur voor uw bacteriën gedurende 16 uur. </li><li> Tel kolonies en bereken kolonievormende eenheden (CFU) volgens (# kolonies x verdunningsfactor) / volume-plated = CFU / ml. </li></ol> Figuur 8 toont een voorbeeld CFU plaat. 6. Representatieve resultaten <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> Figuur 1. CdTe QD&#39;s. (A) Acht preparaten CdTe QD belicht met UV wand (365 nm). (B) Absorptie en emissiespectra van vijf geselecteerde grootte voor en na water-oplosbaar. De onderbroken lijnen spectra in tolueen, de getrokken lijnen in water. files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. Spectrale en gel analyse van de QD-PMB conjugaten. Oranje-emitterende CdTe QD werden in dit voorbeeld, het effect van andere soorten QD moet worden geëvalueerd voor elk experiment. (A) Typische absorptie (grijze lijn) en emissie spectra (zwarte lijn) van de QD&#39;s voor vervoeging van PMB en de uitstoot (stippellijn) na de toevoeging van 160 molaire equivalenten van PMB. (B) Verband tussen de verhouding van PMB en de QD emissie-intensiteit (vierkantjes) en piek golflengte locatie (driehoeken). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> Figuur 3. Aanbevolen plaat lay-out voor controle groeischijf. Een breed scala van PMB en QD concentraties is vertegenwoordigd. De ene helft van de plaat wordt bestraald (blauw gemarkeerd), en een identieke helft is beschermd tegen licht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier</a>voor grotere afbeelding te bekijken. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> Figuur 4. Custom 96-LED-lamp voor een gelijkmatige plaat bestraling, met uitstraling en uit te schakelen. Een typische draagbare UV licht kan ook worden gebruikt, maar niet uniform de gehele plaat. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> Figuur 5. Voorbeeld resultaten voor controle groeischijf. (A) vertegenwoordiger van de groei van bacteriën bochten met verschillende concentraties van het geneesmiddel, om van 0 te voltooien celdood. De open symbolen zijn PMB alleen met concentraties gegeven, de vaste symbolen zijn CdTe-PMB zonder bestraling, en de half-gevulde symbolen zijn CdTe-PMB met bestraling. Bestraling had geen effect op de PMB-only monsters, zodat deze bochten werden weggelaten voor de duidelijkheid. Alle PMB-CdTe conjugaten zijn 30:1 PMB: QD ratio&#39;s. (B) Standplaatsen van groeicurve waarden bij 200 min vs Inloggen [PMB] en past op Eq. (1). Om control voor de effecten van licht, wordt een curve gedaan met antibiotica alleen met 30 min van de blootstelling aan licht. (C) Bacteriële overleven op 200 min vs QD concentratie, met behulp van CdTe QD&#39;s. Sommige toxiciteit wordt gezien met blootstelling aan licht, maar te weinig om een IC50 waarde te bepalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> Figuur 6. Aanbevolen lay-out voor conjugaat testplaat. De blauw-aandacht helft van de plaat mag worden blootgesteld aan licht, en de ongeaccentueerde helft is beschermd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> Figuur 7. Voorbeeld resultaten voor conjugaat testplaat. Groeicurve waarden 200 min werden plotted en fit te Eq. (1). (A) CdTe-PMB conjugaten vertonen verhoogde toxiciteit meer dan PMB alleen. (B) gouden nanodeeltjes Au-PMB conjugaten tonen geen verhoogde toxiciteit meer dan PMB alleen. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> Figuur 8. Voorbeeld van een CFU plaat. E. coli geënt in een 96-wells plaat werd behandeld met QD-PMB met of zonder bestraling gedurende 30 minuten. vervolgens geïncubeerd bij 32 ° C gedurende 4 uur. Seriële verdunningen van elke bacteriële monster gemaakt met zoutoplossing en 10 pi van 100 X 10 7 X verdunningen uitgeplaat op agarplaten. De platen werden geïncubeerd bij 37 ° C en kolonies werden geteld na 16 uur. De plaat toont de verdunningen langs de rijen aangegeven, de kolommen: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe (B) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe (C) 0,2 pM PMB + 6,7 nM CdTe (D) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe bestraald, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe bestraald, (F) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe bestradiated.

<ol><li>Michalet, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+for+live+cells%2C+in+vivo+imaging%2C+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 307, 538-544 (2005).</li>
<li>Jamieson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological applications of quantum dots.</a> Biomaterials. 28, 4717-4732 (2007).</li>
<li>Asokan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heat+transfer+fluids+in+the+synthesis+of+high-quality+CdSe+quantum+dots%2C+core%2Fshell+quantum+dots%2C+and+quantum+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of heat transfer fluids in the synthesis of high-quality CdSe quantum dots, core/shell quantum dots, and quantum rods.</a> Nanotechnology. 16, 2000-2011 (2005).</li>
<li>Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+quantum+dots+for+multiplexed+biological+detection+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13, 40-46 (2002).</li>
<li>Chan, W. C. W., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+ultrasensitive+nonisotopic+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection.</a> Science. 281, 2016-2018 (1998).</li>
<li>Biju, V., Itoh, T., Ishikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+quantum+dots+to+cells%3A+bioconjugated+quantum+dots+for+targeted+and+nonspecific+extracellular+and+intracellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 3031-3056 (2010).</li>
<li>Boucher, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bad++bugs%2C+no+drugs%3A+no+ESKAPE%21+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clin. Infect. Dis. 48, 1-12 (2009).</li>
<li>Morones, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bactericidal+effect+of+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The bactericidal effect of silver nanoparticles.</a> Nanotechnology. 16, 2346-2353 (2005).</li>
<li>Mitoraj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light+inactivation+of+bacteria+and+fungi+by+modified+titanium+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visible light inactivation of bacteria and fungi by modified titanium dioxide.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 6, 642-648 (2007).</li>
<li>Fu, G., Vary, P. S., Lin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatase+TiO2+nanocomposites+for+antimicrobial+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Anatase TiO2 nanocomposites for antimicrobial coatings.</a> J. Phys. Chem. B. 109, 8889-8898 (2005).</li>
<li>Chung, C. J., Lin, H. I., Tsou, H. K., Shi, Z. Y., He, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+TiO2+coating+for+reducing+hospital-acquired+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B.+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial TiO2 coating for reducing hospital-acquired infection.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 85, 220-224 (2008).</li>
<li>Nair, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+size+scale+of+ZnO+nanoparticles+and+microparticles+on+toxicity+toward+bacteria+and+osteoblast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of size scale of ZnO nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, Suppl . 1. S235-S241 (2009).</li>
<li>Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. C., Kahru, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+nanosized+and+bulk+ZnO%2C+CuO+and+TiO2+to+bacteria+Vibrio+fischeri+and+crustaceans+Daphnia+magna+and+Thamnocephalus+platyurus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus.</a> Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).</li>
<li>Rincon, A. G., Pulgarin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+coaxial+photocatalytic+reactor+%28CAPHORE%29+in+the+TiO2+photo-assisted+treatment+of+mixed+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+and+the+bacterial+community+present+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Catal.+Today%22%5BJournal%5D)">Use of coaxial photocatalytic reactor (CAPHORE) in the TiO2 photo-assisted treatment of mixed Escherichia coli and Bacillus subtilis and the bacterial community present in wastewater.</a> Catal. Today. 101, 331-344 (2005).</li>
<li>Neal, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+be+inferred+from+bacterium-nanoparticle+interactions+about+the+potential+consequences+of+environmental+exposure+to+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">What can be inferred from bacterium-nanoparticle interactions about the potential consequences of environmental exposure to nanoparticles.</a> Ecotoxicology. 17, 362-371 (2008).</li>
<li>Kovochich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+C60+aggregates+toward+mammalian+cells%3A+role+of+tetrahydrofuran+%28THF%29+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of C60 aggregates toward mammalian cells: role of tetrahydrofuran (THF) decomposition.</a> Environ. Sci. Technol. 43, 6378-6384 (2009).</li>
<li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+and+cellular+toxicity+of+nanocrystal+quantum+dots+depend+on+their+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification.</a> Nano Letters. 4, 2163-2169 (2004).</li>
<li>Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+CdTe+Quantum+Dots+in+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+NanoBiosci%22%5BJournal%5D)">Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains.</a> IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).</li>
<li>Park, S., Chibli, H., Wong, J., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+and+cellular+toxicity+of+nanoparticle-polymyxin+B+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity and cellular toxicity of nanoparticle-polymyxin B conjugates.</a> Nanotechnology. 22, 185101(2011).</li>
<li>Cooper, D. R., Dimitrijevic, N. M., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitization+of+CdSe%2FZnS+QDs+and+reliability+of+assays+for+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Photosensitization of CdSe/ZnS QDs and reliability of assays for reactive oxygen species production.</a> Nanoscale. 2, 114-121 (2010).</li>
<li>Pong, B. K., Trout, B. L., Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+ligand-exchange+for+efficient+solubilization+of+CdSe%2FZnS+quantum+dots+in+water%3A+A+procedure+guided+by+computational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Modified ligand-exchange for efficient solubilization of CdSe/ZnS quantum dots in water: A procedure guided by computational studies.</a> Langmuir. 24, 5270-5276 (2008).</li>
<li>Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+and+dot+size+on+the+spectral+properties+of+colloidal+InP%2FZnS+core-shell+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots.</a> Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Nanodeeltjes vertegenwoordigen een veelbelovende benadering om de schepping van nieuwe antimicrobiële middelen. Groeicurve-analyse is een manier om de bacteriële cel dichtheid die actief-groeiende cellen van de groei-geremd cellen onderscheidt te controleren. In combinatie met plaat telt, het zorgt voor een grondige analyse van het antibioticum potentieel van een conjugaat. De 96-well formaat maakt relatief high-throughput variaties van concentratie en andere aandoeningen, zoals blootstelling aan licht, de laatste is cr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Boraatbuffer Component # 1 </td><td> Visser </td><td> Boorzuur A-74-1 </td><td></td></tr><tr><td> Boraatbuffer Component # 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Natriumtetraboraat B9876 </td><td></td></tr><tr><td> MPA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9322 </td><td> Diverse MWCO beschikbaar </td></tr><tr><td> Glazen flacons </td><td> Visser </td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxine B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td> Bacteriële growth medium (LB) Component # 1 </td><td> Visser </td><td> NaCl S271 </td><td></td></tr><tr><td> Bacteriële groei medium (LB) Component # 2 </td><td> BD </td><td> Trypton 211705 </td><td></td></tr><tr><td> Bacteriële groei medium (LB) Component # 3 </td><td> BD </td><td> Gist Extract 211929 </td><td></td></tr><tr><td> Lamp voor blootstelling aan licht </td><td> Gewoonte </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clear-bottom 96-well platen </td><td> Visser </td><td> 07-200-567 of 07-200-730 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescentie spectrometer </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Absorptie plaat reader </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BactoAgar voor vaste media </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischaaltjes rond </td><td> Visser </td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen rechthoekige </td><td> Visser </td><td> 08 tot 757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

solubilisatie en bio-vervoeging van quantum dots en bacteriële toxiciteit testen door de groeicurve en kiemgetal

Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

Quantum dots (QD&#39;s) zijn fluorescerende halfgeleider nanodeeltjes met de grootte-afhankelijke emissie spectra die kan worden opgewekt door een ruime keuze van golflengten. QD&#39;s hebben aangetrokken veel belangstelling voor de beeldvorming, diagnostiek en therapie door hun heldere, stabiele fluorescentie 1,2 3,4,5. QD kunnen worden geconjugeerd aan een verscheidenheid van biologisch actieve moleculen binden aan bacteriën en zoogdiercellen 6. QD&#39;s zijn ook op grote schaal onderzocht als cytotoxische middelen voor gerichte doden van bacteriën. De opkomst van vermenigvuldigen-resistente bacteriestammen wordt steeds meer een bedreiging van de volksgezondheid, met name in het geval van Gram-negatieve pathogenen 7. Door de bekende antimicrobiële werking van bepaalde nanomaterialen vooral Ag, zijn er honderden van studies naar de toxiciteit van nanodeeltjes bacteriën 8. Bacteriële studies werden uitgevoerd met andere halfgeleider nanodeeltjes en, especially TiO 2 9,10-11, maar ook ZnO 12 en anderen, waaronder CuO 13. Sommige vergelijkingen van bacteriële stammen zijn uitgevoerd in deze studies, meestal het vergelijken van een Gram-negatieve stam met een Gram positief. Met al deze deeltjes worden toxiciteitsmechanismen toegeschreven aan de oxidatie: ofwel photogeneration van reactieve zuurstofspecies (ROS) van de deeltjes of de directe afgifte van metaalionen dat oxidatieve toxiciteit kan veroorzaken. Zelfs met deze materialen, resultaten van verschillende studies variëren sterk. In sommige studies de Gram positieve test stam is naar verluidt gevoeliger dan de Gram-negatieve 10, in andere gevallen is het tegenovergestelde 14. Deze studies zijn goed beoordeeld 15. In alle nanodeeltje studies, kunnen deeltjes samenstelling, grootte, oppervlakte chemie, staal ouder / afbraak, en de golflengte, de kracht en de duur van de blootstelling aan het licht alle dramatische invloed op de resultaten. Bovendien synthesis bijproducten en oplosmiddelen worden beschouwd 16 17. Hoge doorvoer screen technieken nodig kunnen nieuwe effectieve nanomedicine middelen te ontwikkelen. CdTe QDs hebben anti-microbiële effecten alleen 18 of in combinatie met antibiotica. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat het koppelen van antibiotica om CdTe kan toxiciteit te vergroten om bacteriën te verminderen, maar de toxiciteit voor zoogdiercellen, als gevolg van verminderde productie van reactieve zuurstof soorten uit de conjugaten 19. Hoewel het onwaarschijnlijk dat cadmium verbindingen worden goedgekeurd voor gebruik bij mensen, kunnen dergelijke preparaten gebruikt worden voor het desinfecteren of steriliseren van oppervlakken van water. In dit protocol geven we een eenvoudige benadering van de oplosbaar CdTe QDs met mercaptopropionzuur (MPA). De QD&#39;s zijn klaar voor gebruik binnen een uur. Daarna demonstreren gekoppeld met een antimicrobieel middel. Het tweede deel van het protocolgeeft blijk van een 96-wells bacteriële remming test met behulp van de geconjugeerde en niet-geconjugeerde QD&#39;s. De optische dichtheid wordt gelezen gedurende vele uren, waardoor de gevolgen van QD toevoeging en belichting onmiddellijk en geëvalueerd na herstel. We illustreren ook een kolonie tellen voor het kwantificeren van bacteriën overleven.

Nanodeeltjes zoals halfgeleidende kwantumdots (QD) kan worden fotoactiveerbare middelen maken voor anti-microbiële of anti-kanker toepassingen. Deze techniek laat zien hoe water-oplosbaar te cadmium (CdTe) QDs, vervoegen ze een antibioticum, en het uitvoeren van een bacteriële remming test op basis van groeicurven en kiemgetal.

Solubilisatie en Bio-vervoeging van Quantum Dots en bacteriële toxiciteit Testen door de groeicurve en Kiemgetal

Quantum dots (QD's) zijn fluorescerende halfgeleider-nanodeeltjes met grootteafhankelijke emissiespectra die door een brede keuze aan golflengten kunnen worden geëxciteerd. ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van high-throughput screening van de antibacteriële effecten van nanodeeltjes met of zonder conjugatie aan antibiotica. Hier worden de antibacteriële effecten van poly mix en B, geconjugeerde cadmiumtelluride-quantumdots getest om dit te bereiken. De quantumdots worden eerst gesolubiliseerd in me, capto-propionzuur.Vervolgens worden de quantum dots geconjugeerd aan poly mix en B; de op platen uitgeplaatte antibiotica-behandelde bacteriën worden daarna behandeld met zowel geconjugeerde als niet-geconjugeerde antibioticum-quantum dots. De helft van de monsters wordt bestraald met blauw licht van 440 nanometer gedurende 30 minuten, waardoor de quantum dots excitonen en reactieve zuurstofspecies genereren om het effect van de quantum dot-behandelingen op de bacteriële groei en overleving te beoordelen. Er worden optische dichtheidsmetingen verricht en kolonietellingen uitgevoerd. De resulterende gegevens geven aan dat de toepassing van antibioticum-geconjugeerde cadmiumtelluride quantum dots, gevolgd door bestraling, de grootste biocidale effecten oplevert van alle geteste condities.Hoewel deze methode inzicht kan geven in het effec

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source:Rhea Kang1, Gabby Mora1, Sherry Dunbar11Luminex, A DiaSorin Company, Austin.This video demonstrates multiplexed quantitative bacterial detection employing carboxylated magnetic polystyrene microspheres dyed into distinct sets. The procedure encompasses the formation of bead-bacteria complexes, magnetic separation, and flow-based analysis, enabling precise and simultaneous quantification of multiple bacteria in the same reaction well.

Multiplexed Quantitative Bacterial Detection using Dye-Labeled Magnetic Microspheres

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Bacteriën kunnen tijdens hun leven schadelijke of gunstige mutaties ophopen. In een populatie van cellen kunnen individuen die gunstige mutaties hebben geaccumuleerd, snel hun medemens overtreffen. Hier presenteren we een eenvoudige procedure om intraspecies-concurrentie in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren met behulp van fluorescerend gelabelde individuen.

Monitoring intraspecies competitie in een bacteriële celpopulatie door cocultivatie van fluorescerend gelabelde stammen

We bieden gedetailleerde instructies voor de bereiding van monovalente gerichte quantum dots (mQD's) van fosforothioaat-DNA van gedefinieerde lengte. DNA-wikkeling vindt plaats met een hoge opbrengst en daarom hoeven de producten niet gezuiverd te worden. We demonstreren het gebruik van de SNAP-tag om mQD's te richten op celoppervlaktereceptoren voor live-celbeeldvormingstoepassingen.

Productie en Targeting van Monovalent Quantum Dots

Biofilm-infecties vertonen een hoge tolerantie voor chemotherapie. Geen enkele test legt de complexiteit van biofilms vast. In plaats daarvan zijn aanvullende tests nodig. We presenteren een screeningsplatform (ontwikkeld voor S. aureus) dat assays voor levensvatbaarheid, biomassa en biofilmmatrix combineert. Het maakt ontdekking van anti-biofilm medicijnen mogelijk, inclusief de beoordeling van langdurige chemotherapeutische effecten.

Een platform van de Anti-biofilm Testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding Bibliotheken

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Een eenvoudige ATP-metende assay en leven/dood kleuring methode dienden te kwantificeren en te visualiseren van Neisseria gonorrhoeae voortbestaan na de behandeling met ceftriaxone. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de antimicrobiële gevolgen van een antibioticum en kan worden gebruikt voor het definiëren van de minimale remmende concentratie van antibiotica in bacteriële biofilms.

Kwantitatieve onderzoek van antibiotische gevoeligheid van Neisseria gonorrhoeae met behulp van aggregaten ATP-gebruik commerciële testen en Live/Dead vlekken

Fluorescerende gelabelde antibiotica zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om meerdere aspecten van antimicrobiële resistentie te bestuderen. Dit artikel beschrijft de voorbereiding van fluorescerende gelabelde antibiotica en hun toepassing op het bestuderen van antibioticaresistentie bij bacteriën. Sondes kunnen worden gebruikt om mechanismen van bacteriële resistentie (bijvoorbeeld efflux) te bestuderen door spectrofotometrie, stroomcytometrie en microscopie.

Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes

Dit manuscript beschrijft een methode voor het gebruik van eencellige fluorescentiemicroscopie om bacteriële concurrentie in cocultuur te visualiseren en te kwantificeren.

Kwantificering van interbacteriële concurrentie met behulp van single-cell fluorescentiebeeldvorming

Hier presenteren we een protocol om de antibacteriële werkzaamheid van een antibioticum-eluterend polymeer te evalueren om profylactische klinische toepassing te simuleren met behulp van een commercieel beschikbare real-time ATP-gebaseerde luminescerende microbiële levensvatbaarheidstest. Deze methode maakt het mogelijk om de longitudinale activiteit van geneesmiddel-eluterende materialen te monitoren en kan op grote schaal worden aangepast om antimicrobiële toedieningsplatforms voor...

Een nieuwe methode om de longitudinale antibacteriële activiteit van geneesmiddel-eluterende materialen te bepalen

Dit protocol biedt een systematisch kader om te beoordelen hoe fytochemicaliën de bactericide effecten van traditionele biociden kunnen versterken met behulp van bactericide activiteitsmodellering en combinatorische interactie-assays, die gericht zijn op het identificeren van synergetische mengsels die de microbiële controle verbeteren en het totale biocidegebruik verminderen.

In vitro Evaluatie van de versterkende effecten van plantaardige moleculen op conventionele biociden

Leer de solubilisatie en bioconjugatie van CdTe quantum dots met antibiotica voor antibacteriële toepassingen. Deze methode helpt onderzoekers nieuwe antimicrobiële agentia te ontwikkelen.

Solubilisatie en Bio-vervoeging van Quantum Dots en bacteriële toxiciteit Testen door de groeicurve en Kiemgetal

Meer video's verkennen