Solubilisatie en Bio-vervoeging van Quantum Dots en bacteriële toxiciteit Testen door de groeicurve en Kiemgetal

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van high-throughput screening van de antibacteriële effecten van nanodeeltjes met of zonder conjugatie aan antibiotica. Hier worden de antibacteriële effecten van poly mix en B, geconjugeerde cadmiumtelluride quantum dots getest om dit te bereiken. De quantum dots worden eerst gesolubiliseerd in me, capto proprionzuur.

Vervolgens worden de quantum dots geconjugeerd aan poly mix en B; de op platen aangebrachte bacteriën met antibiotica worden daarna behandeld met zowel geconjugeerde als niet-geconjugeerde antibioticum-quantum dots. De helft van de monsters wordt gedurende 30 minuten blootgesteld aan bestraling met blauw licht van 440 nanometer, waardoor de quantum dots excitonen en reactieve zuurstofspecies genereren om het effect van de quantum dot-behandelingen op de bacteriële groei en overleving te beoordelen. Er worden optische dichtheidsmetingen verricht en kolonietellingen uitgevoerd. De resulterende gegevens geven aan dat de toepassing van antibioticum-geconjugeerde cadmiumtelluride-quantum dots, gevolgd door bestraling, de grootste dodelijke effecten oplevert van alle geteste condities.

Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in het effect van cadmiumtelluride-quantumdots en hun conjugatie met polyx in B op de groei van E coli, kan deze ook worden toegepast op andere typen nanodeeltjes en antibiotica bij diverse bacteriestammen. Over het algemeen zullen personen die onbekend zijn met deze methode moeite hebben, omdat elk overschot aan MPA zal leiden tot aggregatie van de quantumdots, en als er zelfs een kleine hoeveelheid toline wordt gepipetteerd, zal het filter worden vernietigd.

Hoewel we vandaag een methode zullen demonstreren voor het beoordelen van de antibacteriële effecten van antibioticaconjugaten van KE IDE quantum dots, zou een soortgelijke methode kunnen worden gebruikt met andere typen quantum dots, zoals indiumfosfaat, zinksulfaat en cadmiumiodide zinksulfaat. Begin deze procedure door in een glazen vial een oplossing van cadmiumtelluride of CDTE quantum dots in tolueen te bereiden met een concentratie van 15 µM; meet de optische dichtheid of OD via absorptiespectroscopie en breng met een pipet 200 µL van deze voorraadoplossing over in een glazen vial.

Gebruik geen plastic. Voeg vervolgens 800 µL tolueen, 1 mL 200 mM boraatbuffer en 2 µL 11,5 M 2-mercapto-propioonzuur of MPA toe; sluit het vial af en schud dit krachtig gedurende 30 tot 60 seconden. Na het schudden zullen de waterige en organische oplosmiddelfasen spontaan scheiden.

De waterfase krijgt de kleur van de quantum dots. Om de tilingslaag te vermijden, dient deze te worden verwijderd, waarna de fase met de quantum dots wordt verwijderd en overgebracht naar een schoon vial. Om de gesolubiliseerde quantum dots te zuiveren, brengt u deze over naar een 500 µL centrifugefilter.

Voeg 100 µL 50 mM boraatbuffer toe en centrifugeer bij 3000 ×g gedurende 13 minuten. Voer deze wasstap vier keer uit. Suspendeer de gewassen quantum dots in 500 µL boraatbuffer en bewaar deze bij 4 °C.

Deze zullen één tot twee weken stabiel blijven. Om de concentratie van de quantum dots te schatten, worden de absorptie- en emissiespectra gemeten. Deze figuur toont CDTE quantum dots onder UV-lampverlichting en emissiespectra voor en na wateroplosbaarheid, waarbij een verwaarloosbare verandering in optische eigenschappen door de liganduitwisseling zichtbaar is.

Dit deel van het protocol is van toepassing op elke negatief geladen water-gesolariseerde nanodeeltje, waaronder mos, commerciële quantum dots, metaaldeeltjes en meer. In dit voorbeeld zal het antibioticum polymyxine B of PMB worden geconjugeerd aan de quantum dots in een molaire ratio van 30 op één. PMB is positief geladen en assembleert spontaan zonder dat conjugatie nodig is. Reagentia: los PMB op in water.

Bij 60 micromolair. Voor een 96-wellplaat met 0,3 milliliter bacteriën per well in viervoudige duplicaten. 0,5 milliliter van een 200 nanomolair conjugaat is voldoende om dit voor te bereiden door 100 microliter van één micromolaire quantum dots in 50 millimolaire borebuffer aan een microcentrifugebuis toe te voegen.

Voeg vervolgens 50 µL van de 10 x of 60 µM PMB-antibioticumoplossing in water toe aan de conjugaatbuis. Voeg 50 µL water toe aan de controlebuis. Vul het volume aan tot 0,5 mL met 50 mM ate-buffer. Scherm de buizen af van het licht met aluminiumfolie en plaats ze gedurende één uur op een rotator.

Indien er aggregatie optreedt, herhaal de conjugatie dan met lagere concentraties antibiotica. Titreer de concentratie naar boven tot de particles niet meer aggregeren om de conjugaten te wassen. Giet de oplossingen door een filter met een molecular weight cutoff van 10.000, wat werkt voor de meeste antibiotica, maar niet voor proteïnen of antilichamen.

Schat ten slotte het aantal antibioticamoleculen per quantumdot in door middel van absorptie- of fluorescentiespectroscopie, gelelektroforese of Fourier-transform infraroodspectroscopie. Deze figuur toont de typische absorptie- en emissiespectra van de quantumdots vóór conjugatie van PMB en de emissie na toevoeging van 160 molaire equivalenten PMB.

De relatie tussen de verhouding PMB en de emissie-intensiteit van de quantum dots, aangegeven door de vierkantjes, en de locatie van de piekgolflengte, aangegeven door de driehoekjes, wordt hier getoond. Naarmate de PMB-concentratie toeneemt, neemt de QD-emissie-intensiteit af, wat resulteert in een verschuiving van de piek emissiegolflengte. Het volgende deel van het protocol wordt uitgevoerd om de halfmaximale inhiberende concentratie of IC 50 van het antibioticum en de quantumtoxiciteit te bepalen, in de avond twee dagen vóór het conjugatie-experiment.

Ent 10 milliliters LB-medium met een verse colony van e coli. Vul de volgende dag, één tot twee uur voor het experiment, elke well van een transparante 96-wellplaat. Met het groeimedium moet de assayplaat worden ingericht zoals hier getoond.

Monsters moeten in triplo worden geplaatst en de antibioticaconcentraties moeten over een breed genoeg bereik verspreid zijn om één concentratie te bevatten die de bacteriën nauwelijks remt en één die ze volledig doodt. Putjes die quantum dots bevatten in de concentraties die in de conjugaatexperimenten worden gebruikt, moeten eveneens in triplo worden opgenomen. Vul met een multichannelpipet de betreffende putjes met 1 tot 50 µL bacteriële cultuur.

De concentratie zal afhangen van de groeisnelheid van de specifieke stam en moet dienovereenkomstig worden gekalibreerd. Om de groei te monitoren, plaatst u de plaat in een plaatlezer en stelt u deze in om elke 10 minuten gedurende twee uur te lezen bij 600 nanometer. Wanneer alle cellen een OD van 0,1 tot 0,15 bereiken, haalt u de plaat uit de plaatlezer en stopt u de registratie.

Voeg vervolgens de PMB in quantum dots toe aan de juiste wells en scherm de helft van de plaat in triplo af met aluminiumfolie. Plaats de plaat vervolgens gedurende 30 minuten onder een aangepaste 440 nanometer lamp, bestaande uit 2,4 milliwatt LED's, om de verlichte zijde van de plaat bloot te stellen. Plaats de plaat na de lichtblootstelling in de plaatlezer en registreer de OD 600 elke 10 minuten gedurende vijf tot 12 uur, afhankelijk van de groeisnelheid. Houd de temperatuur indien mogelijk via de software onder de 32 graden Celsius om uitdroging van de culturen te voorkomen.

Zet de groeicurves op een geselecteerd tijdstip uit tegen de log-concentratie en bepaal de IC 50 van het antibioticum met behulp van de op het scherm getoonde Hill-vergelijking, waarbij H de Hill-coëfficiënt is. Y max is het hoogste groeipunt en Y min is een nulpuntswaarde, idealiter ook op een plateau. Aan het einde van de registratieperiode duiden heldere wells op volledige celdood, waarbij een gradiënt van celdichtheid zichtbaar zou moeten zijn bij toenemende concentraties van het geneesmiddel.

De bacteriën moeten S-vormige groeicurves vertonen zoals hier getoond. De locatie van het maximale plateau zal sterk variëren per stam en is tevens afhankelijk van de temperatuur. Een bepaald tijdstip kan als representatief worden gekozen, waarna de waarden worden uitgezet tegen de log antibioticum om de IC 50 te bepalen voor de evaluatie van quantum dots.

De overleving bij toxiciteit tegenover de logaritme van de concentratie van de quantum dots kan ook worden uitgezet, maar het is zeldzaam om een significante bacteriedodende werking te bereiken met enkel quantum dots bij de gebruikte concentratie. Zodra de toxiciteit van de quantum dots en antibiotica afzonderlijk is bepaald, kan hetzelfde protocol worden toegepast om de toxiciteit van het antibioticum vast te stellen. Geconjugeerde quantum dots worden getoond.

Hier is een voorbeeldindeling voor de assay. Let erop dat de conjugaten in toenemende concentraties in quadruplaat worden getest; een controlestrip met alleen bacteriën, een strip met alleen het geneesmiddel en monsterputjes voor alleen quantum dots moeten worden opgenomen. OD 600-metingen kunnen vervolgens worden gebruikt om groeicurves te genereren, en ik zie 50 waarden zoals hiervoor.

Deze figuur toont een voorbeeld van conjugaten die even toxisch zijn als het antibioticum alleen en een voorbeeld van conjugaten die toxischer zijn. Om het aantal colony forming units of CFU voor elke conditie te bepalen, kiest u één of meer wells van de behandelde 96-wells plaat om plaatmetingen uit te voeren. Maak van elk van de geselecteerde bacteriële monsters een seriële verdunning met een zoutoplossing.

Pipetteer hiervoor 180 µL zoutoplossing in de juiste kolommen. Draag 20 µL van de bacteriële oplossing over en verdun deze met 180 µL zoutoplossing. Vervang de pipetpunt, meng en draag 20 µL van de verdunde bacteriële oplossing over naar 180 µL zoutoplossing.

Herhaal dit proces zes keer. Neem vervolgens telkens 10 µL van de laatste zes verdunningen en breng deze aan op een rechthoekige augerplaat. Er kunnen 36 spots op een rechthoekige plaat worden aangebracht.

Laat de plaat 15 minuten aan de lucht drogen op de werkbank; incubeer de plaat vervolgens 16 uur bij 37 °C. Tel de kolonies om het aantal colony forming units per milliliter te bepalen. Vermenigvuldig het aantal kolonies met de verdunningsfactor en deel dit door het geplaatste volume om het effect van de behandelingen op de bacteriële groei te bepalen.

De celdichtheid van e. coli werd gemeten bij OD 600. Hier worden representatieve bacteriële groeicurves getoond met verschillende drugconcentraties, variërend van nul tot volledige celdood. De open symbolen geven uitsluitend PMB aan, met de bijbehorende concentraties.

De gesloten symbolen zijn C-D-T-E-P-M-B zonder bestraling en de halfgevulde symbolen zijn C-D-T-E-P-M-B met bestraling. Bestraling had geen effect op de monsters met alleen PMB, dus deze curven zijn weggelaten voor de duidelijkheid. Hier zijn grafieken van de groeicurve-waarden op 200 minuten tegenover de log PMB en fits aan deze vergelijking om de IC 50-waarden te bepalen om te controleren voor de effecten van licht.

Er is een curve gemaakt met alleen antibiotica en een lichtblootstelling van 30 minuten. Deze figuur geeft de bacteriële overleving na 200 minuten weer ten opzichte van de QD-concentratie met behulp van CDTE qds. Er is enige toxiciteit waarneembaar bij lichtblootstelling, maar te weinig om een IC 50-waarde te bepalen.

Dit geeft aan dat de toxiciteit van CDTE alleen, bij de concentraties die in het conjugatie-experiment zijn gebruikt, verwaarloosbaar is om de effecten van verschillende behandelingen op de celgroei te vergelijken; de waarden van de groeicurve bij 200 minuten werden uitgezet en gefit volgens de eerder getoonde vergelijking, zoals hier weergegeven. C-D-T-E-P-M-B-conjugaten waren toxischer dan PMB alleen. In vergelijking hiermee vertonen gouden nanodeeltje A-U-P-M-B-conjugaten geen verhoogde toxiciteit ten opzichte van PMB alleen om het effect van behandelingen op de bacteriële overleving te bepalen.

Het aantal colony forming units werd bepaald voor E. coli in een 96-wellplaat behandeld met P-M-B-Q-D-P-M-B of alleen QD, met of zonder I-bestraling gedurende 30 minuten, en vervolgens geïncubeerd bij 32 °C gedurende vier uur. Seriële verdunningen van elk bacterieel monster werden gemaakt met een zoutoplossing en 10 µL van 100 x tot 10⁷ X oplossingen werden op agarplaten geplaatst. De platen werden geïncubeerd bij 37 °C en de koloniën werden na 16 uur geteld.

In dit voorbeeld zijn de plaatkolommen A tot en met C bacteriën behandeld met toenemende concentraties CDTE. Conjugaten zonder bestraling en D tot en met F zijn bacteriën behandeld met toenemende concentraties conjugaten. Samen met 30 minuten bestraling worden de verdunningen langs de rijen weergegeven.

De gegevens geven aan dat de conjugaten na bestraling een sterkere remming van de bacteriële groei vertonen in vergelijking met de conjugaten zonder bestraling. Vergeet niet dat ca-reagentia extreem toxisch zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen, laboratoriumjassen en veiligheidsbrillen, tijdens het uitvoeren van deze procedure. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u high-throughput screening uitvoert op het antibacteriële effect van nanodeeltjes met of zonder conjugatie aan antibiotica.