Name: Een systeem voor Ex vivo Kweken van embryonale Pancreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer een ex vivo-kweekmethode voor embryonale alvleesklierknoppen van muizen om pancreasontwikkeling, morfogenese en differentiatie te bestuderen. Deze techniek maakt gedetailleerde analyse van celbiologische processen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Research in de Spagnoli lab. wordt gefinancierd door de Helmholtz Association, FP7-IRG-2008-ENDOPANC subsidie ​​en ERC-2009-Starten HEPATOPANCREATIC Grant.

De hier beschreven protocol werd aangepast van de techniek oorspronkelijk beschreven in Percival en Slack 9 en geoptimaliseerd voor confocale microscopie. 1. Coating van Glass Bottom Cultuur Gerechten De volgende stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. <ol><li> Pancreas explantaten worden gekweekt in 35-mm petrischalen met 20-mm glas microwell bodem (bijv. MatTek Corporation). Gebruik een glazen bodem schaal per explantaatkweek en voor de gehele duur van de cultuur. Op de dag voor de dissectie en isolatie van de alvleesklier knoppen, de vacht van de glazen bodem microwells met fibronectine. </li><li> Verdunde steriele fibronectine in celkweek-grade water een 50 ug / ml eindconcentratie en voeg een minimaal volume van het (150 ul) in de 20 mm microwell van MatTek platen die het volledige glasoppervlak (figuur 1E). Plaats de gerechtenin een 4 ° C koelkast overnacht incubatie. </li><li> Op de dag van de dissectie, zuigen de fibronectine, spoel de microwell met celkweek-grade water en voeg een minimaal volume van 150 ul van BME (Basal Medium Eagle) medium aangevuld met Pen / Strep (1%), glutamine (1% ) en 50 ug / ml gentamicine [Dissection Medium]. Laat de gecoate gerechten in de laminaire stroming kap totdat u ze gaat het bord van de explantaten. </li></ol> Indien niet alle fibronectine beklede schalen worden gebruikt, kunnen zij worden bewaard tot 1 week bij 4 ° C. Laat je niet opdrogen van de vaat, vul ze met Dissection Medium en plaats ze in de koelkast. Naast fibronectine zijn pancreas explantaten succes gekweekt op verschillende substraten, zoals laminine 9 matrigel 10,11 of microporeuze membranen 12. Vanwege de effecten op de vertakking, gebruiken we fibronectine 9 als substraat. 2. Dissectie van Dorsal Pancreatic Bud E11.5 - E12.5 muis embryo&#39;s <ol><li> Timed-zwangere vrouwelijke muizen op embryonale dag (E) 11,5 of 12,5 worden opgeofferd en embryo&#39;s worden verzameld met behulp van het ontleden van instrumenten vooraf gereinigd met 70% ethanol. Plaats de uterus ontleed in 10-cm platen met ijskoude PBS aangevuld met 50 ug / ml gentamicine. </li><li> Onder een stereomicroscoop met verlichting van bovenaf, scheiden de baarmoeder in afzonderlijke embryo segmenten met behulp van een klein schaartje of Dumont tang voorzichtig afpellen van de spieren van de baarmoeder en verwijder de individuele embryo&#39;s, die worden omgeven door de decidua. Gebruik standaard embryo dissectie technieken 13 tot en met de embryo&#39;s bloot te leggen en de dooierzak en amnion te verwijderen. Verwijder vervolgens het bovenlichaam van de embryo (de lever) en het staartgebied. Hierdoor kan blootstelling van inwendige organen (Figuur 1B). Breng het midden van de body van de embryo&#39;s in 10-cm platen met ijskoude BME dissectie medium. </li><li> NuGebruik alleen transilluminatie van onderen te visualiseren en aan de dorsale pancreas knop ontleden onder de stereomicroscoop. Voorzichtig, opent u het midden van het lichaam van het embryo door het maken van een laterale incisie met een pincet. Zoek de maag en de milt. De dorsale pancreas knop zijdelings aan het achterste gedeelte van de maag (figuur 1C). Dumont met forceps, ontleden weg dorsale pancreas knop van aangrenzende structuren, zoals de maag en de milt, maar waarbij sommige mesenchym in het epitheel (figuur 1D). Een glazen Pasteur pipet de geïsoleerde knop in een 35 mm petrischaal met koude BME dissectie medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum [Culture Medium]. Herhaal deze stappen totdat alle pancreata zijn geïsoleerd. Als pancreata van verschillende genotypen zijn geïsoleerd, houden afzonderlijke gebruik Nunc 4-well platen. </li></ol> 3. Plating en Cultuur van Pancreatic Explantaten Final plating van de explantaten wordt uitgevoerd in weefselkweek ruimte en / of in de nabijheid van de weefselcultuurincubator een fysieke beweging van de kweken te minimaliseren. <ol><li> Onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap vervangen BME Dissection Medium in fibronectine gecoate schalen met MatTek ~ 150 pi kweekmedium BME voorverwarmd bij 37 ° C. </li><li> Voorzichtig, de overdracht van de pancreas explantaten in gecoat MatTek gerechten (een explantatie per gerecht) voor de lange termijn culture met behulp van een glazen Pasteur pipet. Om ervoor te zorgen verspreiden tijdens de cultuur, kan het mesenchym rond de explantaten iets geript worden, indien nodig, met een fijne naald. </li><li> Voorzichtig Plaats de kweken in een weefselcultuurincubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende enkele uren te laten hechten aan de explantaten de glazen bodem microwells. Zodra ze gehecht zijn, vullen de MatTek schotels met 1,5 ml tot 2 ml van BME kweekmedium voorverwarmd bij 37 ° C. De dag van dissectie wordt aangeduid als dag 0. </li><li> Manipulation van de pancreas explantaat kweken wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming kap. De BME kweekmedium wordt om de andere dag, tenzij experimentele eisen dicteren verschillende timing (bijv. incubatie van explantaten met chemische middelen). De explantaten gekweekt kunnen worden in deze toestand gedurende 5 dagen tot een week. </li></ol> 4. Whole-mount immunofluorescentiekleuring Protocol voor Pancreatic Explantaten Alle stappen van de immunofluorescentie protocol (van bevestiging aan imaging) uitgevoerd in dezelfde MatTek schaaltje dat betere beelden levert dan een plastic bodem schotel. Na fixatie, hoeft de alvleesklier explantatie culturen niet te worden bewaard onder steriele omstandigheden. <ol><li> Zuig BME kweekmedium en een keer was de explantatie met 2 ml 1X PBS. </li><li> Voor explantaat fixatie vervangen PBS met 2 ml ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) en plaats de schaal op ijs gedurende 20 minuten. Swirl de plaat voorzichtig van tijd tottijd, maar vermijd schudapparaten, zoals de explantatie zou kunnen losmaken. </li><li> Verwijder PFA en was het explantaat driemaal met 2 ml 1X PBS gedurende 10 min. elk bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Blok met 2 ml blokkeeroplossing (1X PBS + 0,1% Triton-X + 3% Donkey Serum) gedurende ten minste 30 minuten bij RT. </li><li> Primair antilichaam verdund in blokkeeroplossing en direct toevoegen ~ 150 ul van de verdunning in de 20-mm microwell van MatTek platen, die het gehele oppervlak explant incubatie overnacht bij 4 ° C. Fysieke bewegingen te minimaliseren, primair antilichaam toe aan de explantaten direct in de koude kamer (4 ° C). Om verdamping te voorkomen, vóór toevoeging van de antilichaam, plaats de MatTek platen in een vochtige kamer. </li><li> De volgende dag verwijderd de antilichaamoplossing en driemaal met 2 ml 1X PBS wassen + 0,1% Tween-20 (PBT) gedurende 30 min elk bij kamertemperatuur. </li><li> Verdun secundair antilichaam in het blokkeren van oplossing [volgens de aanbevelingen van de fabrikant, we gebruiken ezel Alexa Fluor kleurstoffen secundaire antiorganen op 1:750 verdunning] en rechtstreeks toe te voegen ~ 150 pi van de verdunning in de 20-mm microwell van de MatTek platen, die het hele explantaat oppervlak, gedurende 1-2 uur incubatie bij kamertemperatuur in het donker. Voor nucleaire tegenkleuring omvatten, tezamen Hoechst met secundair antilichaam verdunning. Om verdamping te voorkomen, vóór toevoeging van de antilichaam, plaats de MatTek platen in een vochtige kamer. </li><li> Was driemaal met 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) gedurende 30 min elk bij kamertemperatuur. </li><li> Voor de montage, een keer wassen met 1X PBS aan Tween-20 te verwijderen. Monteren door toevoeging van een druppel waterig fixeermiddel (met anti-fading) in de 20 mm microwell van MatTek platen. Voorzichtig, bedek de explantatie met een glazen dekglaasje aan. Vermijd luchtbellen. </li><li> Explantaten op MatTek platen kunnen worden bekeken onder standaard fasecontrastmicroscopie of confocale microscopie, afhankelijk van de doelen van het experiment. Voor confocale microscopie analyse gebruiken we een Zeiss LSM 700 omgekeerde setting. Heeft ons aan juiste lasers voor fluoroforened.. Selecteer een doelstelling die zal het imago van de gewenste oppervlakte van de alvleesklier explantatie. Een 10X water immersie objectief is geschikt om de gehele explantaat houden het gezichtsveld. Een 40X water-of olie-immersie doelstellingen zijn geschikt om zich te concentreren op specifieke gebieden van de pancreas explantaat met een hogere resolutie. De explantaten kan optisch secties verdeeld en vervolgens de verkregen Z-stacks gereconstrueerd in 3D, met behulp van de juiste software. </li></ol> 5. Live-cell imaging protocol van Pancreatic Explantaten <ol><li> Klimaatkamer setup: gebruik een milieu-behuizing en een kleine incubatiekamer [met de temperatuur en CO 2-regelaar] die zit op de microscoop podium. Goede kweken van embryonale pancreas vereist een constante temperatuur van 37 ° C en een gecontroleerde atmosfeer van bevochtigde 5% CO2. Geschikte kamers zijn verkrijgbaar bij verschillende leveranciers (Bijvoorbeeld, Zeiss, Nikon, Olympus). Monteer de verwarming doos en zet hem op eent minste 1 uur vóór beeldvorming begint zijn om de apparatuur op te warmen en CO 2-gehalte evenwicht tot 5%. </li><li> Voor time-lapse beeldvorming van de pancreas explantatie culturen, gebruiken we een Zeiss LSM 700 omgekeerde microscoop. Voor lasers en objectieve selectieprocedure zie punt 4.10. </li><li> Laat de pancreas explantaat goed op de glazen bodem schaal bevestigen voordat de live beeldvorming. [We meestal live beeldvorming te beginnen op dag 1]. In een laminaire stroming kap, zuigen en vervangen met vers medium explant BME kweekmedium beginnen met optimale voedingsstoffen voorwaarden. </li><li> Voorzichtig de overdracht van de explantaten om de microscoop kamer en plaats de MatTek schotel in de incubatiekamer in de preparaathouder van de confocale microscoop. </li><li> Bereid de doelstelling (bijvoorbeeld olie of water-medium toe te voegen op basis van de keuze van immersie objectief) en richten zich op het gebied van belang in de explantatie. Sluit de klimaatkamer goed. Om verdamping te voorkomen tijdens een time-lapseovername met water-onderdompeling doelstellingen, in plaats van water wordt aanbevolen om viskeuze vloeistoffen onderdompeling die in de handel verkrijgbaar (bv. Zeiss Immersol W) te gebruiken. </li><li> Stel laser intensiteit, Z-stack overname parameters en tijdsinterval (zie ook Overleg voor het oplossen van problemen). Start het experiment. </li><li> Na beeldvorming, export Z stapels en alle tijdstippen en te analyseren met behulp van geschikte software (bijv. ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens). </li></ol> 6. Representatieve resultaten Dorsale alvleesklier knoppen (samen met de omringende mesenchym) werden geprepareerd uit muisembryo&#39;s van E11.5 en E12.5 en geplateerd direct op glas bodem kweekschalen (figuur 1). Bloedvaten in de omringende mesenchym het epitheel en kunnen worden gevisualiseerd door immuunkleuring voor de endotheliale marker PECAM 12 (data niet getoond). Na twee dagen van cultuur, pancreas explantaten underwent aanzienlijke groei en begon om zich in epitheliale vertakte structuren, waarvan de kernen positief voor de pancreatische transcriptiefactor Pdx1 (Figuur 2A-C). De gemiddelde dikte van z-pancreatische explantaten op dag 3 van de cultuur 60-80 urn. Het oppervlak en volume van de explantaten kan worden gemeten met geschikte software (bijv. Huygens). Morfologie en immunofluorescentie analyses toonden pancreatische explantaten gekweekt met dit protocol samengevat in vivo vroege pancreatische differentiatie en morfogenetische events 5,10,11,14 (figuur 2). Pancreas explantaten op dag 4 van de cultuur onderging typische &quot;tip en stam&quot; scheiding van het epitheel 8, het weergeven van CPA1 + progenitorcellen op de uiteinden van de epitheliale takken (figuur 2C) en gedifferentieerde insuline + en glucagon + cellen georganiseerd als clusters in de kofferbak (Figuur 2D ). Bovendien de pancreatic epitheel in het ex vivo kweken vertoonde goede cytoskelet organisatie celpolariteit met apicale lokalisatie van F-actine (figuur 2E, in groen) en b1-integrine aan het basale membranen (figuur 2E, in rood). De alvleesklier vertakking in realtime bestuderen, werden embryonale pancreas explantaten geïsoleerd uit de tweekleurige fluorescerende reporter muizenstam membrane-Tomato/membrane-Green 15 (mT / mG; muizenstam beschikbaar bij het ​​Jackson Laboratory) (Figuur 3). Stilstaande beelden uit een time-lapse film mT / mG pancreatische explantaten in kweek worden getoond in Figuur 3. De lokalisatie van het mT fluorescerend eiwit aan membraanstructuren schetst celmorfologie en maakt het mogelijk resolutie van fijne cellulaire processen, zodat naar cel remodeling en migratie te volgen in de tijd. Na een 12-uurs time-lapse experiment de mT fluorescentiesignaal blijft levensvatbaar en verslechteringCTabel, hoewel de intensiteit verlaagd, waarschijnlijk door zonbeschadigde (figuur 3). Technische oplossingen om te voorkomen of te verminderen zonbeschadigde en fototoxiciteit worden besproken in de discussie sectie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van de dorsale alvleesklier bud dissectie van E12.5 muis embryo. (A) Helderveld beeld van E12.5 muis embryo. Het bovenlichaam van de embryo (de lever) en het staartgebied verwijderd van het midden lichaam (B) isoleren. Incisies worden weergegeven door rood stippellijnen. (C) resulteert in verdere dissectie blootstelling van de maag en de omgeving (aangegeven door het gestippelde vak). De dorsale pancreas knop (zie rode gestippelde cirkel) ligt aan de basis van de maag en naast de milt primordium. De ontlede dorsale pancreas knop (D) wordt overgedragen met een Pasteur pipet in de microwell van een glazen onderste schaal met BME kweekmedium (E, F). Afkortingen: sto (maag), sp (milt), dp (dorsale alvleesklier knop), duo (twaalfvingerige darm). Schaalbalken, 1000 um (A, C). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> Figuur 2. Whole-mount confocale immunofluorescentie analyse van de pancreas explantatie culturen. (A) Helderveld beelden van pancreatische explantaten op dag 1 en dag 2 van ex vivo cultuur. Rode stippellijn inleiding van vertakking van het epitheel. (B) 3D-reconstructie van de hele-mount immunokleuring voor Pdx1 op dag 3 pancreas cultuur. Pancreas explantaten toonde buisjes van Pdx1 + cellen ondergaan een uitgebreide vertakking met 48 uur van culturen. (C) Whole-mount immunokleuring van de dag 3 pancreas explantatie met antilichamen tegen de basolaterale membraan marker E-cadherine (ECAD), tip stamvader marker, Carboxypeptidase 1 (CPA1) en fosfo-histon H3 (pHH3). De meeste actieve mitotische pHH3 + cellen colocaliseren aan de perifere uiteinden met CPA1 + cellen. Onderbroken lines geven tip van de takken. (D) Whole-mount immunokleuring voor endocriene lineage markers, insuline (Ins) en glucagon (Gluca) op dag 3. Gele pijlen geven clusters van Ins + en Gluca + cellen. Inzet (D), hogere vergroting van een van de endocrine cel cluster. (E) Whole-mount immunokleuring van de dag 3 pancreas explantatie voor Pdx1, β1 integrine (β1int) en F-actine (Fact). Mesenchymale cellen (sterretjes) afgewisseld tussen Pdx1-positieve epitheelcellen. Afbeeldingen in C, D en E zijn enkele confocale optische secties van Z-series. Schaalbalken 100 urn (A, B) 50 urn (CE). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> Figuur 3. Vertegenwoordiger live-cell imaging van ex vivo gekweekte pancreas explantatie. (AD) Frames van een time-lapse film van een pancreas explantatie van een mT / mG muis transgene embryo. Tijd van beeldvorming wordt weergegeven in uren: minuten. Het explantaat wordt belicht vanaf dag 1. Z-stack afbeeldingenopgenomen met een 40x olie-immersie objectief elke 12 min in totaal 15 hr. Onderbroken lijnen duiden tip van de takken en grens tussen epitheel en mesenchym. Schaal bar, 50 um.

<ol><li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li>
<li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li>
<li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+endoderm+to+pancreas%3A+a+multistep+journey%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li>
<li>Hick, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands%3A+a+role+for+SDF-1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li>
<li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li>
<li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li>
<li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li>
<li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li>
<li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li>
<li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+restrain+pancreas+branching%2C+differentiation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li>
<li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Zodra pancreatic lot is aangegeven, pancreatische progenitorcellen ondergaan uitgebreide proliferatie, differentiatie en morfogenese om uiteindelijk een rijpe en functionele orgaan 2,4. Momenteel hoe vertakking plaatsvindt in de pancreas en hoe het is aangesloten progenitor proliferatie en differentiatie is grotendeels onbekend. Pancreas explantatie culturen vormen een ideaal systeem om op te helderen deze processen ex vivo 5,9,11. Door de combinatie van live-cell imaging met ex vivo</...

<table border="1"><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherine F-actine Glucagon Insuline β1-integrine Pdx1 Pdx1 Fosfo-histon H3 </td><td> Abd Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling </td><td> 1810-0006 13-1.900 A-12373 20076 4011 tot 01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basale Medium Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Bewaard in steriele omstandigheden </td></tr><tr><td> Celcultuur kwaliteit water </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Bewaard in steriele omstandigheden </td></tr><tr><td> Cultuur gerechten (glazen bodem), 35-mm </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td> Donkey Serum </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal kalfsserum Gold </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td> Bewaard in steriele omstandigheden </td></tr><tr><td> Fibronectine </td><td> Invitrogen </td><td> 330.100-8 </td><td> De sol. 1 mg / ml in celkweek waterbehandeling </td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Bewaard in steriele omstandigheden </td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Bewaard in steriele omstandigheden </td></tr><tr><td> 4-goed Multidishes </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopen: Omgekeerde confocale microscoop (LSM 700) Stereomicroscoop (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Doelstellingen: C-Apochromat 10x / 0,45 W M27 (werk. dist 1,8 mm;. Beeldvorming diepte ~ 100 mm), C-Apochromat 40x / 1,2 W Corr M27 (werk. dist 0,28 mm;. ~ Imaging diepte 50 pm) Transilluminatie van onderen en glasvezel-verlichting van bovenaf </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Roth </td><td> 0335,3 </td><td> Voorraadoplossing 20% </td></tr><tr><td> Pasteurpipet (Glass), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td> Gehouden in steriele cOORWAARDEN </td></tr><tr><td> Petrischalen, 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen, 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Bewaard in steriele omstandigheden </td></tr><tr><td> Spring Schaar 8 mm zaagblad gebogen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> Horlogemaker&#39;s foreceps Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

een systeem voor<em&gt; ex vivo</em&gt; kweken van embryonale pancreas

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

De alvleesklier controleert vitale functies van ons lichaam, met inbegrip van de productie van spijsverteringsenzymen en de regulering van de bloedsuikerspiegel 1. Hoewel in de afgelopen tien jaar veel studies hebben bijgedragen aan een solide basis voor het begrijpen van de pancreas organogenese, belangrijke lacunes bestaan ​​in de kennis van de vroege pancreas vorming 2. Een volledig begrip van deze vroege gebeurtenissen zal inzicht geven in de ontwikkeling van dit orgaan, maar ook in ongeneeslijke ziekten die de alvleesklier te richten, zoals diabetes of alvleesklierkanker. Tenslotte zal deze informatie genereert een blauwdruk voor de ontwikkeling cel-vervangende therapieën in het kader van diabetes. Tijdens de embryogenese, de alvleesklier is afkomstig van verschillende embryonale uitwassen van de dorsale en ventrale voordarm endoderm op embryonale dag (E) 9,5 in de muis embryo 3,4. Beide uitwassen evaginate in het omringende mesenchym als vaste epitheell knoppen, die proliferatie ondergaan, vertakking en differentiatie tot een volledig volwassen orgel 2,5,6 genereren. Recent bewijs heeft gesuggereerd dat de groei en differentiatie van pancreatische cellijnen, zoals de insuline producerende β-cellen, afhankelijk juiste weefsel-architectuur, epitheliale cellen remodellering en positionering binnen de vertakking pancreas epitheel 7,8. Maar hoe vertakking morfogenese optreedt en gecoördineerd met proliferatie en differentiatie in de pancreas is grotendeels onbekend. Dit is gedeeltelijk te wijten aan het feit dat de huidige kennis over deze processen is bijna uitsluitend op de analyse van vaste monsters, terwijl morfogenetische gebeurtenissen zijn zeer dynamisch. Hier beschrijven we een werkwijze voor het ontleden en kweken muis embryonale alvleesklier knoppen ex vivo op glazen schalen, die directe visualisatie van de ontwikkeling pancreas (figuur 1) te maken. Deze cultusure systeem is ideaal ontworpen voor confocale laser scanning microscopie en in het bijzonder levende cellen imaging. Pancreas explantaten kan worden bereid niet alleen uit wildtype muis embryo, maar ook uit genetisch gemanipuleerde muizenstammen (zoals transgene of knock-out), waardoor real-time onderzoek mutant fenotype. Bovendien is deze ex vivo teeltsysteem is waardevol om de effecten van chemische verbindingen op pancreas ontwikkeling te bestuderen, waardoor kwantitatieve gegevens over de proliferatie en groei, rek, vertakking, tubulogenesis en differentiatie te verkrijgen. Kortom, de ontwikkeling van een ex vivo pancreas explantaatkweek methode in combinatie met hoge-resolutie beeldvorming biedt een sterk platform voor het observeren van morfogenetische en differentiatie gebeurtenissen die zich voordoen binnen de zich ontwikkelende muis embryo.

We beschrijven een werkwijze voor isolatie, cultuur en manipulatie van muis embryonale pancreas. Dit is een uitgelezen<em&gt; Ex vivo</em&gt; Systeem voor het bestuderen van verschillende aspecten van de pancreas ontwikkeling, met inbegrip van morfogenese, differentiatie en groei. Pancreas knop explantaten worden enkele dagen gekweekt en gebruikt in een aantal verschillende toepassingen, waaronder geheel gemonteerde immunofluorescentie en live beeldvorming.

Een systeem voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kweken van embryonale Pancreas

De pancreas reguleert vitale functies van ons lichaam, waaronder de productie van spijsverteringsenzymen en de regulatie van de bloedsuikerspiegel1. Hoewel in de ...

Het algemene doel van deze procedure is om embryonale pancreasknoppen van muizen ex vivo te dissekeren en te kweken, zodat de ontwikkeling van de pancreas direct gevisualiseerd kan worden. Dit wordt bereikt door eerst muizenembryo's van embryonale dag 11,5 of 12,5 te dissekeren en het bovenlichaam en de staartregio te verwijderen om het middenlichaam van het embryo te isoleren. De tweede stap bestaat uit het blootleggen van de regio van het duodenum en de maag voor lokalisatie, gevolgd door de dissectie van de dorsale pancreasknop.Vervolgens wordt de knop overgebracht naar de microwel van een MacTech-schaal en tot een week gekweekt. Ten slotte kan het explantaat worden geanalyseerd via live-cell imaging, of kan het explantaat worden gefixeerd, via whole mount staining worden gekleurd en geanalyseerd met immunofluorescentie-imaging. Uiteindelijk kunnen de differentiatie van pancreascellen, de organisatie van het cytoskelet, de celpolariteit en de vertakkende morfogenese worden geëvalueerd.Ex vivo kweek van pancreasexplantaten kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de pancreasorganogenese, zoals vertakkende morfogenese. Hoe vindt dit proces plaats in de ontwikkelende pan

a-system-for-ex-vivo-culturing-of-embryonic-pancreas

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De huidige studie beschrijft een gerichte aanpak van differentiatie in het induceren van de alvleesklier differentiatie van humane embryonale stamcellen. Van grote betekenis is de bevinding dat endotheelcel co-cultuur bemiddelt rijping van menselijke embryonale stamcellen afkomstig van de pancreas voorlopercellen in insuline tot expressie brengen.

Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak

In deze publicatie beschrijven we een snelle en gemakkelijke werkwijze voor het isoleren en kweken van primaire acinaire cellen van de pancreas muizen. Deze methode vormt een waardevolle benadering van de fysiologie van verse primaire normale / getransformeerde exocriene pancreas cellen te bestuderen.

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

Een protocol te isoleren, cultuur en imago eilandje cel clusters (ICC), afkomstig van menselijke foetale pancreas cellen wordt beschreven. De methode beschrijft de stappen die nodig zijn om ICC te genereren uit weefsel, cultuur als monolagen of in suspensie als aggregaten, en voor markers van proliferatie en alvleesklier cel beslissingen over het lot.

Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

De driedimensionale cultuur methode beschreven in dit protocol recapituleert pancreas ontwikkeling van verspreide embryonale muis alvleesklier progenitoren, waaronder hun grote expansie, differentiatie en morfogenese in een vertakte orgaan. Deze methode is vatbaar voor beeldvorming, functiestoringen en manipulatie van de niche.

In Vitro Pancreas Organogenese van Dispersed muis embryonale Progenitors

In vitro testen van kolonies op zelfvernieuwing en differentiatie van progenitorcellen geïsoleerd uit volwassen muizen pancreas gedetecteerd worden gepland. In deze testen pancreatische voorlopercellen leiden tot cel kolonies in 3-dimensionale ruimte-methylcellulose bevattende halfvaste medium. Protocollen voor het manipuleren van enkelvoudige cellen en karakterisering van individuele kolonies worden beschreven.

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van insuline 3D lymfkliertest pancreatoids uit de alvleesklier progenitoren vrij zwevende e10.5 losgekoppeld en de bijbehorende mesenchym uitdrukken.

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) cellen voor de generatie van de alvleesklier lineages op basis van de niet-kolonie type enkelgelaagde groei van afzonderlijke cellen los. Deze methode is geschikt voor het produceren van homogene hPSC-afgeleide cellen, genetische manipulatie en screening.

Efficiënte generatie van alvleesklier/twaalfvingerige darm Homeobox eiwit 1+ Posterior voordarm/Pancreatic voorlopercellen van hPSCs in hechting culturen

Beschrijven we een methode voor de isolatie van de endocriene cellen uit embryonale, Neonatale en postnatale pancreases gevolgd door eencellige RNA sequencing. Met deze methode kunt analyses van de ontwikkeling van de alvleesklier endocriene bloedlijn, cel heterogeniteit en transcriptomic dynamiek.

Eencellige Transcriptomic Analyses van muis alvleesklier endocriene cellen

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Leer een ex vivo-kweekmethode voor embryonale alvleesklierknoppen van muizen om pancreasontwikkeling, morfogenese en differentiatie te bestuderen. Deze techniek maakt gedetailleerde analyse van celbiologische processen mogelijk.

Een systeem voor

Meer video's verkennen