In vitro Elektroporatie van de Tweede Rhombic Lip van Midgestation muizenembryo's
3 augustus 2012
Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een In vitro Electroporatie techniek die het mogelijk maakt voor de manipulatie van genexpressie in de onderste lip van ruitvormige midgestation embryo's.
Het algemene doel van deze procedure is om de genexpressie in embryonale progenitoren van de achterhersenen te manipuleren door de introductie van plasmide-DNA via electroporatie op vroege gestationele tijdstippen. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te isoleren bij 11,5 dagen gestatie en deze met de dorsale zijde naar boven te oriënteren in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing. De tweede stap is het injecteren van ongeveer 50 µL van het expressieplasmide in 0,01% fast green.
Bij een succesvolle injectie zal het gehele ventriculaire systeem gevuld zijn met het mengsel van DNA en fast green. Vervolgens wordt het embryo onderworpen aan een elektrische puls. De zijde van het embryo die zich het dichtst bij de positief geladen elektrode bevindt, zal het plasmid DNA opnemen.
De andere zijde dient als interne negatieve controle. De laatste stap is het plaatsen van de embryo's in weefselkweek voor ten minste 24 uur. Uiteindelijk zal het geëlektroporeerde gen na 24 uur kweek tot expressie komen en kan dit worden beoordeeld via immunohistochemie.
Het voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat manipulatie van embryonale hind brainin-progenitoren mogelijk is opvroegere gestationele tijdstippen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied, zoals de wijze waarop verschillende neurale genen het lot van embryonale progenitorcellen kunnen beïnvloeden. Begin deze procedure door de dissectie-instrumenten en de laminaire flowkast te steriliseren volgens het bijbehorende manuscript.
Om de embryo's te oogsten, plaats een geëuthanaseerde vrouwelijke muis die zwanger is van pups op embryonale dag E 11.5 op de dissectieschaal in de zuigkast. Spuit vervolgens de buik van de muis in met 70% ethanol. Open de peritoneumholte en zet de wanden met spelden vast aan de dissectieschaal.
Trek vervolgens de uterinehoorns naar buiten zodat deze in de peritoneale holte rusten. Open met een pincet voorzichtig de wand van de uterinehoorn. Gebruik een lepel van 20 millimeter om de embryo's in de dooierzak voorzichtig van de placenta te verwijderen.
Plaats de embryo's daarna in een weefkweekschaal van 100 millimeter. Deze is vooraf gevuld met 10 milliliters steriele, voorverwarmde 1× PBS. Breng in deze stap het eerste embryo over naar een nieuwe schaal van 100 millimeter, vooraf gevuld met 10 milliliters steriele 1× PBS die was voorverwarmd tot 37 °C.
Verwijder vervolgens voorzichtig de dooierzak en gooi deze weg. Positioneer daarna het embryo zodanig dat de dorsale zijde naar boven is gericht. Houd het embryo voorzichtig vast met de elektrodeplaatjes van zeven millimeter onder een dissectiemicroscoop.
Plaats de elektroden aan weerszijden van de neurale buis op het niveau van het vierde ventrikel van de rhombencephalon. Gebruik daarna een spuit van 1 cc om het mengsel van plasmide-DNA en 0,01% Fast screen op te zuigen; in het algemeen zouden 500 µL van het mengsel voldoende zijn voor de electroporatie van ten minste acht tot 10 embryo's. Doorboor vervolgens voorzichtig de dakplaat boven het vierde ventrikel met een tuberculinspuitnaald van 25 gauge en vijf achtste inch, bevestigd aan de spuit van 1 cc.
Inject vervolgens ongeveer 50 µL van het DNA DI-mengsel in het ventrikel. Succesvolle injecties worden gekenmerkt door het vullen van het gehele ventriculaire systeem met het DNA DI-mengsel. Een alternatieve methode om het DNA DI-mengsel toe te dienen, is door het ventriculaire systeem te bereiken via punctie van het vellum boven het middenbrein; schakel daarna de pulsgenerator in en dien vijf vierkantgolven toe met behulp van een elektrode-pulsgenerator en de zeven millimeter elektrodeplaatjes aan het weefsel dat zich het dichtst bij de positief geladen elektrode bevindt.
Terwijl het plasmide wordt voorbereid in een laminaire flowkast, vult u de putjes van een 12-wells kweekschaal met twee milliliters DME MF 12-medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 5% paardenserum, 1% glutamine en 1% penicilline-streptomycine, dat vooraf is voorverwarmd tot 37 °C. Knijp vervolgens met een pincet in het midden van het embryo. Verwijder daarna het posterieure deel van het embryo en plaats het anterieure deel in een van de gevulde putjes van de kweekschaal.
Herhaal de procedure voor alle embryo's en vul alleen de buitenste putjes van de 12-wells plaat. Om contaminatie van de culturen te voorkomen, worden de embryo's 24 uur lang gekweekt in een incubator van 37 °C met 5% carbon dioxide om het geelectroporeerde plasmide te laten tot expressie komen. Indien een langere kweekduur gewenst is, vul dan de putjes van een nieuwe 12-wells plaat met twee milliliters D-M-E-M-F 12 medium.
Verplaats de embryo's met een gesteriliseerde lepel naar de putjes van een nieuwe plaat. Plaats ze vervolgens terug in de incubator bij 37 °C en kweek ze tot 48 uur om de embryo's te fixeren voor analyse. Vul een 12-wells plaat met 1× PBS, verplaats daarna de embryo's en spoel ze vijf minuten bij 4 °C.
Fixeer vervolgens de embryo's gedurende twee uur bij vier graden Celsius in 2%paraldehyde in één keer PBS. Spoel ze daarna drie keer vijf minuten in één keer PBS bij vier graden Celsius. Vul vervolgens een nieuwe 12-wells plaat met 30%sucrose in één keer PBS.
Breng de embryo's over naar deze wells en laat ze een nacht equilibreren bij vier graden Celsius. Bed het vervolgens de embryo's in het optimale cutting temperature compound met behulp van een bad van droogijs en ethanol, of bewaar ze bij min 20 graden Celsius. Snijd tot slot de embryo's in secties van 30 micron met een cryostaat.
Monteer ze op objectglazen en bewaar ze bij -20 °C van uni Histochemical. De hier getoonde studie laat de representatieve resultaten zien van de immunohistochemie voor GFP op dwarsdoorsneden van een geëlektroporeerd E 11.5 embryo na 24 uur cultuur. De pijlen geven hier het dakplaatje aan dat het secundaire antilichaam vasthoudt.
De resultaten laten zien dat het geëlectroporeerde gebied van de onderste lip van de ROIC beperkt was en zich niet uitstrekte over de gehele anterieur-posterieure as van de neurale buis. Hier worden de resultaten getoond van twee van de geanalyseerde eiwitten, MASH one en math one. We observeerden dat de meerderheid van de embryo's normale expressieniveaus behield na electroporatie en cultuur vergeleken met de controle-embryo's op 11.5. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één tot twee uur worden voltooid indien correct uitgevoerd.
Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het gebruik van de in vitro elektroporatie-assay om de genexpressie in de progenitorcellen van het embryonale membraan van de muis te manipuleren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een in vitro electroporatietechniek waarmee de genexpressie in embryonale voorlopercellen van de achterhersenen kan worden gemanipuleerd. De procedure richt zich op het introduceren van plasmid-DNA in de onderste rhombische lip van embryo's in de midgestatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Manipulatie van genexpressie
Achtergrond
- Elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt om DNA in cellen te introduceren.
- Embryonale progenitoren van de achterhersenen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van de hersenen.
- Het manipuleren van genexpressie tijdens vroege gestatiefasen kan inzicht bieden in ontwikkelingsprocessen.
- Voorgaande methoden waren mogelijk niet effectief in het gericht targeten van specifieke regio's in embryo's.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor de manipulatie van genexpressie in embryo's.
- Het verbeteren van het begrip van genfuncties tijdens de vroege hersenontwikkeling.
- Het leveren van een protocol dat kan worden gebruikt door onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Isolatie van embryo's op 11,5 dagen van de dracht.
- Oriëntatie van embryo's in steriele fosfaatgebufferde saline.
- Injectie van expressieplasmid gemengd met fast green-kleurstof.
- Toepassing van een elektrische puls om de DNA-opname te vergemakkelijken.
Belangrijkste resultaten
- Het gehele ventriculaire systeem van het embryo kan worden gevuld met het plasmid DNA-mengsel.
- Een succesvolle elektroporatie maakt gerichte veranderingen in de genexpressie mogelijk.
- Deze methode kan worden toegepast op vroegere tijdstippen tijdens de gestatie.
- Demonstreert de haalbaarheid van het manipuleren van de genexpressie in specifieke hersenregio's.
Conclusies
- De ontwikkelde elektroporatietechniek is effectief voor genmanipulatie in embryo's.
- Deze aanpak kan het onderzoek in de ontwikkelingsneurowetenschappen bevorderen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om genfuncties in de hersenontwikkeling te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze in vitro electroporatiemethode maakt gerichte manipulatie van genexpressie mogelijk in vroege embryonale progenitors van de rhombencephalon, waarmee een belangrijk hiaat in het neurowetenschappelijk onderzoek naar ontwikkeling wordt opgevuld. Door de lethaliteit te omzeilen die geassocieerd wordt met in utero benaderingen vóór E12.5, ondersteunt deze techniek mechanistische studies naar de specificatie van neurale lineages vanuit de lower rhombic lip. Deze mogelijkheid verbetert de validatie van targets en het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen van neuro-ontwikkelingsstoornissen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door de genexpressie in LRL-progenitoren te wijzigen om de functionele impact op het neuronale lot te beoordelen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem voor het valideren van targets die betrokken zijn bij de vroege ontwikkeling van de hersenstamlijnen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het verminderen van risico's bij targets door genetische perturbatie te koppelen aan gedefinieerde neurodevelopmentale uitkomsten in een ziekte-relevant systeem.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, geëlektroporeerde embryonale culturen die geschikt zijn voor downstream fenotypische analyse en compound-screening.
- Kwantitatieve output: Maakt meting van veranderingen in genexpressie mogelijk via immunohistochemie, wat read-outs ondersteunt die zijn afgestemd op biomarkers.
- Schaalbaarheid: Maakt de verwerking van meerdere embryo's per sessie mogelijk, wat evaluatie van targets met een middelmatige doorvoer faciliteert.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert humane neuro-ontwikkelingsstoornissen door de studie mogelijk te maken van LRL-afgeleide precerebellaire kernen die betrokken zijn bij motorische en sensorische integratie.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie door consistente manipulatie van genexpressie in embryonale precursoren.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt effecten op pathway-niveau van targetmodulatie voordat er wordt overgegaan naar in vivo-modellen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen het vroegste stadium van het ontdekkingsproces en ondersteunt de fasen van targetvalidatie en assayontwikkeling door een genetisch hanteerbaar systeem te bieden voor het onderzoeken van de biologie van progenitorcellen in de ruitvormige hersenen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing naar genfuncties in de embryonale neuro-ontwikkeling, waardoor mechanistische ambiguïteit bij de selectie van targets wordt verminderd.
- Screening: Levert gestandaardiseerde embryonale culturen met kwantificeerbare transfectie-efficiëntie, wat betrouwbare screening van verbindingen of genetische perturbaties mogelijk maakt.
- Analytics: Levert ruimtelijk opgeloste genexpressiegegevens via immunohistochemie, wat vergelijkende analyses tussen verschillende condities ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit naar preklinisch werk door vroege neuro-ontwikkelingsprocessen te modelleren die relevant zijn voor menselijke hersenstamstoornissen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor iteratieve target-interrogatie van meerdere genen en tijdstippen in de embryonale ontwikkeling.
Operationele & zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door nauwkeurige spatiotemporele genmanipulatie in embryonale systemen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde embryo-handling, elektroporatieparameters en kweekcondities.
- Strategische waarde: Verhoogt de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door biologische onzekerheid bij vroege doelwitbeoordeling te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van functionele validatie in een fysiologisch relevante ontwikkelingscontext.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in embryonale dissectie, microchirurgie en elektrofysiologische technieken.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder elektrodepaddles, pulsgeneratoren en microchirurgische instrumenten onder een dissectiemicroscoop.
- Vereist een aseptische weefselkweekinfrastructuur en gecontroleerde incubatieomgevingen (37°C, 5% CO2).
- Houdt rekening met aanpassingen voor verschillende plasmideconstructen, waaronder overexpressie en RNAi-gebaseerde knockdown-instrumenten.
- Beperkt tot embryonale stadia vóór E12.5 vanwege technische beperkingen van in utero-benaderingen, waarbij de kweekduur de timing van downstream-assays beïnvloedt.
