Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

Het algemene doel van deze procedure is het genereren en karakteriseren van T-lymfocyten uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPS-cellen). De IPS-cellen kunnen vervolgens in vitro worden gedifferentieerd op een OP9-DL1-cultuursysteem en daarna in vivo worden gerijpt in een Rag-deficiënte muis. Alternatief kunnen de cellen genetisch worden gemodificeerd om OT-1 TCR overexpressie te induceren en vervolgens adoptief worden overgedragen voor in vivo ontwikkeling.

Na zes weken in vivo differentiatie kunnen de muizen worden uitgedaagd door intraperitoneale injectie met EEG seven tumorcellen, waarna de antigeenspecificiteit van de uit iPS afgeleide T-cellen kan worden geëvalueerd. Uiteindelijk kunnen de iPS-cellen differentiëren tot zowel conventionele als antigeenspecifieke T-cellen, waarbij deze laatste in staat zijn om dieren te beschermen tegen tumoruitdaging. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot geïndividualiseerde kankerimmunotherapie.

De methode maakt de generatie van grote aantallen tumorreactieve T-cellen mogelijk, afgeleid van een minimale hoeveelheid bloed of huidweefsel van de patiënt. Overdraag op dag nul 5×10⁴ iPS-cellen naar een 100 mm kweekschaal met een confluente laag OP9-DL1-cellen in alpha-MEM-medium met 20% FBS. Trypsiniseer de cellen op dag vijf. Centrifugeer de cellen na incubatie gedurende 30 minuten in een incubator bij 37 °C op een nieuwe 100 mm kweekschaal; plaatс 5×10⁵ van de zwevende cellen in alpha-MEM-medium met 20% FBS en mouse Notch ligand op een nieuwe 100 mm schaal met een monolaag OP9-DL1-cellen. Pipetteer op dag acht voorzichtig de losjes gehechte cellen naar beneden, centrifugeer de cellen en overdraag deze vervolgens naar één putje van een 6-wells kweekplaat die is gecoat met confluente OP9-DL1-cellen. Incubeer de cellen nog twee weken bij 37 °C en 5% CO2. Op dag 22.

Incubeer de losgekoppelde IPS-cellen in vers medium op een nieuwe kweekschaal bij 37 °C gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens ongeveer de helft van de zwevende cellen en leid deze door een nylon zeef van 70 µm om celklonters uit te sluiten, en was de resulterende enkelcel-suspensie drie keer met koud PBS. Resuspendeer de cellen na de derde wasbeurt in PBS op een concentratie van 1,5 × 10⁷ cellen per milliliter en bewaar de cellen op ijs tot aan de IV-injectie.

Plaats een vier weken oude rag-deficiënte muis onder een infraroodlamp om de staartvene te dilateren. Vul vervolgens een spuit van één milliliter, uitgerust met een naald van 26,5 gauge, met 200 µL van de cel-suspensie en voer de adoptieve transfer van de cellen uit via de gedilateerde staartvene. Drie weken later, na bevestiging van de euthanasie van de adoptief getransfereerde muis, worden de lymfeklieren en de milt verwijderd na mechanische dissociatie van de weefsels.

Lyseer de enkelcel-suspensie met een CK-lysisbuffer en was de resulterende mononucleaire cellen vervolgens tweemaal in koude PBS. Evalueer de cellen na kleuring voor celoppervlaktemarkers op dag nul via flowcytometrische analyse. Gebruik op dag één het JAMA-transfectiereagens om geplaatste plat E-verpakkingscellen gedurende de nacht te transfecteren met een OT one MIDR. Zaai op dag twee 1×10⁶ iPS-cellen in één putje van een 24-wells plaat die is voorbehandeld met 0,1% gelatine. Verzamel het pseudovirus met S-natine van de plat E-cellen en breng dit na centrifugatie door een 0,4 micron filter om potentiële contaminanten uit te sluiten. Transduceer de cellen in aanwezigheid van polybrene gedurende één uur bij 330×g bij 32 °C.

Incubeer ze na herhaling van de transductieprocedure een nacht bij dezelfde temperatuur. Trypsiniseer de getransduceerde iPS-cellen op dag vier en resuspendeer de cellen na het centrifugeren in vers medium; zaai deze vervolgens uit op vooraf gecodeerde, bestraalde snl 7 6 7-feedercellen. Zodra de getransduceerde cellen confluentie hebben bereikt, worden de GFP- en DSred-dubbelpositieve cellen gesorteerd via flowcytometrie.

Zes weken na de adoptieve overdracht van de IPS-cellen injecteert u op dag 50 van de tumorchallenge 50 µL EEG seven thoma-cellen in de peritoneumholte van dezelfde muis. Gebruik een mil E biotech CD8-positieve T-cel isolatiekit om CD8-positieve T-cellen te sorteren uit de milt en lymfeklieren van het adoptief overgedragen dier. Meng de geïsoleerde CD8-positieve T-cellen met bestraalde SPOC-cellen van een naïeve C 57 black six J-muis in een verhouding van 1:10 en pulseer de co-cultuur gedurende 40 uur met 0,5 µM ova.

Voeg daarna felden A toe aan de cellen voor nog eens vier uur. Evalueer tot slot de celpopulaties via flowcytometrische analyse. Nadat de SP-cellen uit een naïeve C 57 black six J-muis zijn geïsoleerd, wordt de celsuspensie in twee groepen gesplitst.

Label de CFSE-hoog groep met vijf µmol/ml CFSE en pulseer de cellen gedurende één uur met 10 µg/ml ova-peptide; label de CFSE-laag groep met 0,5 µmol/ml CFSE en pulseer deze niet. Meng 2,5 × 10⁶ CFSE-hoge cellen met 2,5 × 10⁶ CFSE-lage cellen in PBS. Analyseer vervolgens de cellen via flowcytometrie op CFSE-expressie.

16 uur na adoptieve transfer in de betreffende muis. Om op dag 20 van de tumorchallenge de intraperitoneale tumorcellen te tellen, wordt een spuit van 10 milliliter voorzien van een naald met een diameter van 18,5 gauge en koude PBS gebruikt om de peritoneale holte te spoelen. Tel de teruggewonnen tumorcellen om tumorinfiltrerende cellen te identificeren.

Verwijder de tumor in een laat stadium van de tumoruitdaging en snijd de tumor vervolgens in drie stukken. Plaats het eerste tumorstuk in een cryovial en zet de vial op droogijs. Fixeer het tweede stuk onmiddellijk in formaldehyde.

Bewaar het derde deel in geconditioneerd RPMI 1640-medium nadat de cryopreserveerde weefselcoupes aan de lucht zijn gedroogd. Fixeer deze gedurende 15 minuten in koud aceton nadat de gefixeerde coupes nogmaals 15 minuten aan de lucht zijn gedroogd. Was de objectglazen na de fixatie vijf minuten in PBS.

Plaats de objectglazen in een vochtige kamer en bedek de weefselcoupes gedurende 30 minuten met 30 µL 3%B, SA en PBS om aspecifieke binding te blokkeren. Blot vervolgens de blokkeringsbuffer weg en incubeer de weefselcoupes in de vochtige kamer gedurende twee uur met een mengsel van 50 µL pe anti TCR RV alpha two antilichaam en fitzy anti ova antilichaam, verdund in 3%PSA in PBS. Was de objectglazen drie keer met koude PBS en monteer de coupes tot slot met een op water gebaseerd monteermedium voorafgaand aan fluorescentiemicroscopisch onderzoek voor flowcytometrische analyse van tumor-infiltrerende T-cellen.

Maak van de tumor een suspensie van enkelvoudige cellen. Analyseer vervolgens de cellen op specifieke oppervlaktemarkers. CD3 en TCR bèta worden gebruikt als markers voor T-cellen om te bepalen of stimulatie van IPS-cellen met het notch-ligand DL1 kon bijdragen aan T-celdifferentiatie. De expressie van CD4 en CD8 op het celoppervlak van CD3-positieve TCR bèta-positieve cellen afgeleid van IPS-cellen werd beoordeeld.

Let op de dotplot aan de rechterkant, die op dag 22 CD3-positieve, TCR$\beta$-positieve, CD4-negatieve, CD8-positieve enkel-positieve T-cellen laat zien die in vitro uit iPS-cellen zijn gegenereerd. Daarnaast produceerden de uit iPS-cellen afgeleide enkel-positieve cellen uit de vorige figuur interleukine 2 en interferon gamma wanneer ze in vitro werden gestimuleerd met plaatgecoate anti-CD3- en oplosbare anti-CD28-antilichamen, wat bevestigt dat de uit iPS-cellen afgeleide T-cellen functioneel zijn na adoptieve transfer in recipientenmuizen. De meerderheid van de TCR-gen-getransduceerde iPS-cellen onderging differentiatie tot CD8-positieve CTL's, die in vitro reageerden op peptidestimulatie door interleukine 2 en interferon gamma uit te scheiden in deze dotplots van samengevoegde lymfeknoop- en miltcellen.

CD8+ Vβ5+ T-cellen werden gegenereerd in muizen die adoptief waren overgezet met TCR-getransduceerde, maar niet met controle-getransduceerde IPS-cellen. De CD8+ Vβ5+ populaties waren positief voor intracellulaire cytokinestaining voor de productie van interleukine 2 en interferon gamma, in deze histogrammen weergegeven door de donkere lijnen vergeleken met de gearceerde isotype-controlehistogrammen, wat aantoont dat de uit IPS afgeleide CTL's functioneel waren. Deze gegevens tonen de CFSE-high cellen die gepulst waren met eptide, weergegeven door de pieken rechts in elke grafiek, en de CFSE-low controlecellen, weergegeven door de pieken links, die werden geïnjecteerd in muizen 10 weken na IPS-celtransfer of één dag na O OT1 CTL-transfer.

De antigeenspecifieke uit iPS-cellen afgeleide CTL's reageerden op antigeenstimulatie en vertoonden cytotoxische activiteit, zoals blijkt uit de afwezigheid van CFSE-high cellen hier. OT-I TCR-gen getransduceerde iPS-cellen werden adoptief overgebracht naar C57BL/6-muizen, waarna de muizen werden blootgesteld aan een challenge met EEG.7-tumorgestelde cellen. Op dag 20 werden de tumorcellen in de peritoneale holte geteld. Let op de significante vermindering van het aantal tumorcellen bij muizen die TCR-getransduceerde iPS-cellen ontvingen in vergelijking met de controlegroepen.

Het belangrijkste is dat de adoptieve transfer van TCR-getransduceerde iPS-cellen infiltratie van overreactieve CTL's in tumorweefsels teweegbracht en dieren beschermde tegen tumorchallenge, zoals te zien is in deze H&E-kleuring van tumorweefsels die 30 tot 35 dagen na de tumorchallenge zijn verkregen; tumoren van muizen die adoptief waren overgedragen met TCR-getransduceerde cellen of OT-1 CTL's, maar niet van die met een mock-injectie of controle. Getransduceerde cellen waren geïnfiltreerd door inflammatoire cellen, zoals aangegeven door de rode pijlen hier. Ova-specifieke Vα2-positieve CTL's in het rood infiltreerden ova-expresserende tumorweefsels in het groen.

Hoewel tumoren bij muizen uit de controlegroepen in deze figuur minder of geen tumorinfiltrerende cellen vertoonden, werden enkelcel-suspensies van tumorweefsels geanalyseerd op expressie van V alpha twee-positiviteit en V beta vijf-positiviteit via flowcytometrie, na gating op de CD eight-positieve populatie. Let op dat tumorweefsels van muizen waarin TCR-getransduceerde IPS-cellen adoptief waren overgedragen, het hoogste niveau van tumorinfiltrerende cellen vertoonden, terwijl tumoren van muizen die controle-getransduceerde IPS ontvingen, geen infiltratie door ova-specifieke CD eight-positieve T-cellen vertoonden.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u antigeenspecifieke T-cellen genereert uit IPS-cellen en hoe u de functies van de uit IPS afgeleide T-cellen evalueert.