Name: Oct4GiP Reporter Assay van genen die muis embryonale stamcellen Onderhoud en Zelfvernieuwing Regel Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer een fluorescentie-reporterassay om genen te identificeren die muis embryonale stamcellen onderhouden en zelfvernieuwing reguleren. Deze methode maakt snelle evaluatie van genfunctie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Brad Lackford voor het lezen en bewerken van het manuscript. Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Intramurale Research Program Z01ES102745 (naar GH).

1. Oct4GiP muis ES Cell Onderhoud Oct4GiP cellen werden vriendelijk verschaft door Dr Austin Smith. Ze werden afgeleid van de 129/Ola muizen die een Oct4-GFPiresPac transgen 4,5. Zij worden gehandhaafd gelatine beklede weefselkweek-platen op de ESGRO volledige plus klonale gehalte medium (Millipore) of in de M15 medium: DMEM (Invitrogen) aangevuld met 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore) 1x Niet essentiële aminozuren (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore) en 10 uM β-mercapto-ethanol. <ol><li> Coat platen met 0,1% gelatine (Sigma) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten (0,1 ml gelatine-oplossing / cm 2). </li><li> Plaat Oct4GiP cellen in gelatine beklede platen op ~ 2 x 10 4 / cm 2. </li><li> Splits de cellen elke twee dagen 0,05% trypsine. </li></ol> 2. siRNA Transfectie in Oct4GiP cellen De Oct4GiP reporter test is het meest convenientgevoerd uitgevoerd gelatine beklede vlakke bodem 96 - of 384-wells platen (Corning of BD) in de M15 medium. De algemene procedure geschetst in figuur 1. <ol><li> siRNA-lipide-complexen montage: <ol><li> Voor transfectie in 96-well platen, monteren siRNA-lipidecomplexen in U-bodem 96-wells platen. </li><li> In elk putje mix 10 pi Optimem (Invitrogen) en 0,3 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 5 pmol siRNA aan de lipide-Optimem mengsel en incubeer gedurende nog eens 15 minuten. De siRNA: lipide verhouding 100 pmol: 6ul. </li><li> Breng de siRNA-lipidecomplexen in Optimem van de U-bodemplaat aan de gelatine beklede vlakke bodemplaat met een multi-kanaal pipet. </li><li> Voor transfectie in 384-wells platen, de voorbereiding van de siRNA-lipide complexen met behulp van 0,1 pl Lipofectamine 2000 en 2 pmol siRNA in 10 ul Optimem. </li></ol></li></ol> Opmerking: De uiteindelijke siRNA-concentratie inde transfecties is 50 nM. Voer 3-4 biologische replica voor elke siRNA transfectie. Stel meester mengsels van de siRNA-lipidecomplexen in de U-bodemplaat en aliquot in de platte bodem gelatine beklede plaat. <ol start="2"><li> Oct4GiP cel plating en transfectie: <ol><li> Voor transfectie in 96-well platen, verzamelen Oct4GiP cellen opnieuw in suspensie in vers medium M15 9 x 10 4 cellen / ml. </li><li> Voeg 100 pi van de celsuspensie in elk putje met een multi-kanaal pipet. </li><li> Meng de celsuspensie met de vooraf gealiquoteerd siRNA-lipiden complexen in de put door het pipetteren en neer 3-5 keer. Wijzig tips voor verschillende siRNA transfecties. </li><li> Voor transfectie in 384-platen, hersuspenderen Oct4GiP cellen 6 x 10 4 cellen / ml en aliquot 30 pi celsuspensie in elk putje. </li></ol></li></ol> Opmerking: De optimale cel platen dichtheid gewoonlijk 3 x 10 5 cellen / cm 2, maar may verdere optimalisatie voor siRNA&#39;s die dramatische gevolgen hebben voor de celgroei of levensvatbaarheid. Lage plating densiteit zal leiden tot slechte overleving van de cel tijdens de transfectie. Hoge plating densiteit zal leiden tot een hoge achtergrond door hoge cel samenvloeiing geïnduceerde differentiatie. Eventueel proef plating dichtheid 2-4 x 10 5 cellen / cm 2. <ol start="3"><li> Medium wijziging: <ol><li> Verwijder oude medium met behulp van multi-channel aspirator (Corning) of vacuüm wand (VP-Scientific). Let erop dat u de cellen krassen aan de onderkant van de platen. </li><li> Voer de cellen met vers ES celmedium (100 pi van 96-well plaat en 30 ul van 384-wel plaat) met multi-kanaal pipet elke dag. </li></ol></li></ol> 3. FACS analyse <ol><li> Cel dissociatie: <ol><li> Vier dagen na transfectie, verwijder medium met behulp van multi-channel aspirator (Corning) of vacuüm wand (VP-Scientific). </li><li> Voor 96-wells platen eenmaal spoel cellen 100μl PBS. </li><li> Voeg 25 ul 0,25% trypsine aan elk putje met een multi-kanaal pipet. </li><li> Incuberen bij kamertemperatuur 5 minuten en toe roeren en visueel volledige loslaten van de cellen te waarborgen. </li><li> Voeg 90 pi PBS met 10% FBS de trypsine inactiveren en cellen dissociëren tot een enkele-celsuspensies door herhaalde pipetteren. </li><li> Voor 384 platen, scheiden cellen met 10 pi trypsine en demping van 30 pi PBS met 10% FBS. </li></ol></li><li> FACS-analyse: <ol><li> Analyseer de GFP-fluorescentie van de BD LSRII FACS analyse voorzien van de HTS-eenheid of andere vergelijkbare uitgerust FACS analyse (zoals Accuri of Intellicyt). </li><li> Met de high-throughput-modus op de HTS en analyseren van 10 ul van celsuspensie. Stel de telling drempel tot 1,0 x 10 4 cellen. </li><li> Pas PMT voltage en de drempel naar de cellen vast te leggen in de forward versus side-scatter plot. Poort voor de levende cellen bevolking in de DoorzendoptiesARD versus side-scatter plot. </li><li> Maak een histogram plot voor het GFP-kanaal. Stel de poort in de GFP kanaal zodat ~ 10% van de cellen blijken GFP-negatief zijn in de mock of controle-siRNA getransfecteerde cellen. </li><li> Bepaal% GFP-negatieve cellen van elke behandeling:% gedifferentieerde cellen =% GFP-negatieve cellen. Vergelijk de% gedifferentieerde cellen tussen de experimentele-en controle-siRNA transfecties met gebruik van 2-tailed t-test, en scoor de positieve hits met p-waarden &lt;0,01. </li></ol></li></ol> 4. Representatieve resultaten Oct4, NANOG en Sox2 zijn drie genen die kritische rol spelen in het behoud van de ES-cel zelfvernieuwing 6,7,9-11. Figuur 2 laat zien dat de Oct4GiP reporter test gemakkelijk kan het onderscheid veroorzaakt door zwijgen op te leggen deze factoren in de te detecteren Oct4GiP ES cellen. Figuur 2A toont de Oct4GiP ES cellen GFP-positieve als gehandhaafd ES<html> cellen. Figuur 2B toont het voorste zijde tegen puntenwolk Het histogram van het GFP kanaal van de Oct4GiP cellen getransfecteerd met de controle of Oct4-siRNA&#39;s. Het is noodzakelijk gate levende cellen in voorwaartse tegen elkaar scatterplot de dode cellen en resten zijn GFP-negatieve en toenemen achtergrond. Anderzijds, doublet discriminatie mogelijk cel klonten sluiten niet altijd noodzakelijk. In de controle-siRNA getransfecteerde cellen, moet de overgrote meerderheid van de cellen in GFP-positieve. Als duidelijk GFP-negatieve populaties aanwezig zijn in de controle-siRNA getransfecteerd putten kunnen de start Oct4GiP cellen of transfectie procedure zijn aangetast en het resultaat kan niet interpreteerbaar. Figuur 2C toont de staafdiagram van% gedifferentieerde cellen (% gedifferentieerde cellen =% GFP-negatieve cellen) van de controle-, Oct4-, NANOG-, en Sox2-siRNA getransfecteerde cellen. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Overzicht van de Oct4GiP reporter test. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> Figuur 2. Oct4GiP reporter test kan detecteren ES celdifferentiatie veroorzaakt door NANOG, Oct4 of Sox2 silencing. A) E14Tg2a (wild-type, zwarte lijn) en Oct4GiP (groene lijn) cellen werden geanalyseerd met behulp van FACS. Histogram van het GFP-kanaal blijkt dat Oct4GiP cellen GFP-positieve. B) Oct4GiP cellen werden in 96-wells platen met de Control of Oct4-siRNA en FACS analyse 4 dagen na transfectie. Forward tegen elkaar puntgrafieken en histogrammen van het GFP-kanaal van de getransfecteerde cellen worden getoond. C) Oct4GiP cellen werden getransfecteerd met de controle-, NANOG-, Oct4-of Sox2-siRNA. De gedifferentieerde cellen% werd bepaald uit de% GFP-negatieve cellen 4 dagen na transfectie en werd uitgezet als gemiddelde + / - standaardafwijking van het gemiddelde (n = 4).f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+potency+by+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+Oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li>
<li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+cloning+of+Nanog%2C+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li>
<li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3%2F4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li>
<li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li>
<li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li>
<li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li>
<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De Oct4GiP reporter test beschrijven we hierboven kan kwantitatief meten van de mate van zelf-vernieuwing versus differentiatie. Vergeleken met andere beschikbare methoden, zoals morfologie gebaseerde 12 en proliferatie / levensvatbaarheid gebaseerde assays, biedt een hogere gevoeligheid en doorvoersnelheid, alsmede een directe meting van de embryonale stamcellen staat. Het is daarom zeer geschikt voor grootschalige schermen en genetische epistase analyse. Inderdaad, hebben wij en anderen met succes gebruikt ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> ESGRO compleet plus kloon graad Medium </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (High glucose 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0,25% trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (te verminderen serum medium) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO mLIF (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (Niet-essentiële aminozuren) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> 100x Nucleosiden voor ES-cel </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> Sigma </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-gekwalificeerde foetaal runderserum </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> NANOG siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058489-01 </td></tr></tbody></table> Controle siRNA: siRNA duplex gericht vuurvlieg luciferase (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) gesynthetiseerd door Dharamcon.

oct4gip reporter assay van genen die muis embryonale stamcellen onderhoud en zelfvernieuwing regel studie

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotentie en zelfvernieuwing zijn twee definities van de kenmerken van embryonale stamcellen (ES cellen). Het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanisme zal aanzienlijk vergemakkelijken het gebruik van ES-cellen voor de ontwikkelingsbiologie studies, ziekte modelleren, drug discovery, en regeneratieve geneeskunde (overzicht in 1,2). Om de identificatie en karakterisering van nieuwe regulatoren van ES-cel onderhoud en zelfvernieuwing te bespoedigen, hebben we een fluorescentie-reporter-gebaseerde test om kwantitatief te meten van de zelfvernieuwing status in de muis ES-cellen met behulp van de Oct4GiP cellen 3. De Oct4GiP cellen brengen green fluorescent protein (GFP) onder controle van de Oct4 gen promotergebied 4,5. Oct4 is vereist voor ES-cel zelf-vernieuwing, en is hoog tot expressie in ES-cellen en snel down-gereguleerd tijdens de differentiatie van 6,7. Hierdoor GFP expressie en fluorescentie in de cellen reporter correleert trouwmet de ES-cel identiteit 5 en fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) analyse kan worden gebruikt om nauwlettend toezien op de zelfvernieuwing status van de cellen op de enkele cel niveau van 3,8. In combinatie met RNAi, kan de Oct4GiP reporter test gebruikt worden om snel te identificeren en te bestuderen regulatoren van ES-cel onderhoud en zelfvernieuwing 3,8. In vergelijking met andere methoden voor het bepalen zelfvernieuwing is het handig, gevoelig kwantitatieve en lagere kosten. Het kan worden uitgevoerd in 96 - of 384-platen voor grootschalige studies zoals hoge-doorvoer schermen of genetische epistase analyse. Tenslotte door andere lijn-specifieke reporterconstructieproducten ES cellijnen kan de test hier beschreven ook worden gemodificeerd lot specificatie tijdens ES celdifferentiatie bestuderen.

We beschrijven een fluorescentie reporter test om snel te identificeren en karakteriseren genen die muis embryonale stamcellen onderhoud en zelfvernieuwing te reguleren.

Oct4GiP Reporter Assay van genen die muis embryonale stamcellen Onderhoud en Zelfvernieuwing Regel Studie

Pluripotentie en zelfvernieuwing zijn twee bepalende kenmerken van embryonale stamcellen (ES-cellen). Inzicht in het onderliggende moleculaire mechanisme zal ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om snel de rol van het gen van belang te bepalen bij het behoud van de zelfvernieuwing van embryonale stamcellen van muizen of ES-cellen. Dit wordt bereikt door eerst de transfectie-mastermix samen te stellen die zal worden gebruikt om de genen van belang tot zwijgen te brengen. Als tweede stap.De transfection master mix wordt overgebracht naar een met gelatine gecoate plaat en T 4G IP-cellen worden toegevoegd. De cellen worden vervolgens gekweekt onder normale ES-celkweekcondities, zodat het effect van de gene silencing zich kan manifesteren. Na vier dagen kweek worden de cellen van de plaat losgemaakt en wordt hun zelfvernieuwingsstatus bepaald via flowcytometrie. Uiteindelijk kunnen de verschillen in het percentage GFP-negatieve cellen tussen de controle- en experimentele siRNA-getransfecteerde T 4G IP-cellen via facts worden geëvalueerd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals celmorfologie of analyse van lineage-markers, is dat deze een hogere sensitiviteit en doorvoersnelheid biedt en daarom beter geschikt is voor genetische screens op middelgrote tot grote schaal of voor genetische epistasie-analyse. Deze methode kan de studie naar de genfunctie die belangrijk is voor het behoud en de zelfvernieuwing van ESL aanzienlijk vergemakkelijken. Daarnaast kan de methode worden aangepast aan de specificatiegebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de differentiëring van ESL.T 4G IP-cellen worden gekweekt in met gelatine gecoate platen. Ze worden gezaaid met een dichtheid van ongeveer 2 × 10⁴ cm² en om de twee tot drie dagen gesubcultured voor transfectie. Begin bij 96-wells platen met een platte bodem met het coaten van de plaat met 0,1% gelatine, stel vervolgens de mastermix van Optum en Lipectomy 2000 samen en verdeel deze in aliquoten over een 96-wells plaat met een U-bodem.Incubeer de plaat vijf minuten bij kamertemperatuur en voeg vervolgens vijf picomol I a toe aan het lipid optimum-mengsel en incubeer dit nog eens 15 minuten. Verwijder daarna de gelatine uit de 96-well platbodemplaat en gebruik een meerkanaals pipet om de i a lipidcomplexen in optimum over te brengen van de U-bodemplaat naar de platbodemplaten. Verzamel nu de OC 4G IP-cellen en resuspendeer deze in vers M 15-medium tot negen maal 10⁴ cellen per milliliter.Gebruik vervolgens een multikanalspipet om 100 µL van de celsuspensie aan elke well van een 96-well plaat met vlakke bodem toe te voegen; pipetteer drie tot vijf keer op en neer om de celsuspensie te mengen met de pre-geformeerde lipidecomplexen, waarbij de tips worden gewisseld voor verschillende transfecties. Plaats de platen vervolgens in een incubator op 37 °C met 5% CO2 en kweek de cellen gedurende vier dagen. Verwijder op elke kweekdag het oude medium met een multikanal-aspirator, waarbij nauwkeurig wordt voorkomen dat de cellen op de bodem van de platen worden beschadigd.Gebruik vervolgens een meerkanaalpipet om de cellen vier dagen na transfectie te voeden met 100 µL vers ES-celmedium. Verwijder het medium met een meerkanaalaspirator en spoel de cellen eenmaal met 100 µL PBS. Gebruik daarna een meerkanaalpipet om aan elk putje 25 µL 0,25% tripsine toe te voegen.Incubeer de cellen vijf minuten bij kamertemperatuur met af en toe schudden. Inspecteer vervolgens de plaat visueel om te controleren of de cellen volledig zijn losgekomen nadat de cellen zijn losgekoppeld. Voeg 90 µL PBS met 10% FBS toe om de trypsine te inactiveren en pipetteer de celoplossing meerdere keren op en neer om de cellen te dissociëren tot een enkelcellige suspensie.Gebruik tot slot de high-throughput-modus op de HTS-unit van een FACS-analyzer om 10 µL van de cel-suspensie te analyseren. Stel de tel-drempel in op 1,0 × 10⁴ cellen en pas de PMT-spanning aan om de cellen in het forward versus side scatter-diagram vast te leggen. Stel de analyse-gate in voor de levende celpopulatie in het forward versus side scatter-diagram en maak vervolgens een histogramplot voor het GFP-kanaal.Stel de gate in het GFP-kanaal zo in dat ongeveer 10% van de cellen GFP-negatief lijkt te zijn in de mock- of controle-SINA-getransfecteerde cellen om het percentage gedifferentieerde cellen te bepalen op basis van het percentage GFP-negatieve cellen. Vergelijk voor elke behandeling het percentage gedifferentieerde cellen tussen de experimentele en de controle-irna-transfecties.Deze eerste figuur laat zien dat wildtype E 14 TG twee A-cellen, weergegeven door het zwarte histogram, GFP-negatief zijn, terwijl de T 4G IP-cellen, weergegeven door het groene histogram, GFP-positief zijn wanneer ze in deze volgende twee figuren als ES-cellen worden onderhouden. Forward scatter versus side scatter-plots en histogrammen van het GFP-kanaal van T 4G IP-cellen vier dagen na transfectie met controle- of T vier siRNA's worden in de scatterplots getoond. Levende cellen worden eerst geselecteerd (gated) in de forward versus side scatter-plot, aangezien dode cellen en debris GFP-negatief zijn en zorgen voor een verhoogde achtergrond zoals te zien is in de histogramgegevens; in de met controle-siRNA getransfecteerde cellen is de overgrote meerderheid van de cellen GFP-positief.Deze staafdiagrammen tonen het percentage gedifferentieerde cellen van controle nano OCT 4 en SOX 2, siRNA-getransfecteerde, OCT 4G IP-cellen vier dagen na transfectie. In alle gevallen vertoonden de siRNA-getransfecteerde cellen, zoals verwacht, hogere niveaus van differentiatie dan de controles. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden uitgevoerd in één uur actieve werktijd per 96-wells plaat.Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u de Oxford GIP-reporterassay kunt gebruiken om snel de rol van uw gen van belang in het onderhoud van muizen-ESL te bepalen.

oct4gip-reporter-assay-to-study-genes-that-regulate-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de procedure voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van induceerbare lentivirus die uitdrukken Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4.

Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

De Stemgent Dox Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan herprogrammeren muis embryonale fibroblasten (MEF) om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Hier hebben we het protocol voor DOX-induceerbare expressie van muis herprogrammering transcriptiefactoren Oct4 te tonen, om Sox2, Klf4 en c-Myc genereren iPS kolonies die uitdrukken gemeenschappelijke MES pluripotentie markers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

SC1 functies door dubbele remming van Ras-GAP en ERK1. We testten de functie van SC1 in de ondersteuning van muis ES-cel zelf-vernieuwing in de afwezigheid van LIF en liet zien dat SC1 in staat is om zelf-vernieuwing van de muis ES-celculturen te behouden.

Het gebruik van SC1 (Pluripotin) naar Mesc Zelfvernieuwing Ondersteuning bij de afwezigheid van LIF

This video demonstrates a technique for assessing retinoic acid activity in mouse embryos. Upon isolating cells from the mouse embryos, the cells are co-cultured with retinoic acid (RA) reporter cells. Embryonic cells produce RA, which induces beta-galactosidase expression in reporter cells, indicating RA activity in the embryonic cells.

Employing Reporter Cells in a Co-Culture to Study Retinoic Acid Production by Mouse Embryonic Cells

Enkele cel genexpressie test is noodzakelijk om inzicht stamcel heterogeniteiten.

Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

In deze studie genereren we geïnduceerde pluripotente stamcellen uit muis-vruchtwatercellen, met behulp van een niet-viraal transposonsysteem.

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Hier presenteren we een kwantitatief en schaalbaar protocol voor het uitvoeren van gerichte kleine molecuulschermen voor kinase-regulatoren van de naïeve-primed pluripotente transitie.

Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

Wij beschreven twee chemische-gebaseerde protocollen voor het kweken van muis embryonale stamcellen in detail. Deze nieuwe methode maakt gebruik van synergetische mechanismen ter bevordering van Tet-gemedieerde oxidatie (door vitamine C) en onderdrukken van DOVO synthese van 5-methylcytosine (door PD0325901) om DNA hypomethylation en pluripotent van muis embryonale stamcellen te onderhouden.

Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C

Dit protocol meet kwantitatief de stabiliteit en halveringstijd van intergene en intragenische enhancer-RNA's in muisembryonale stamcellen met behulp van Actinomycine D-behandeling, RT-qPCR en niet-lineaire regressieanalyse. Positie-specifieke normalisatiestrategieën worden geïntegreerd om eRNA-vervaldynamiek nauwkeurig te modelleren op een contextafhankelijke manier.

Geoptimaliseerde kwantitatieve beoordeling van de stabiliteit van enhancer-RNA in muisembryonale stamcellen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde computationele pijplijn voor het kwantificeren van ontluikende enhancer-transcripties. Door de toegankelijkheid van chromatine, de chromatinefunctie en transcriptiegegevens te integreren, maakt het nauwkeurige detectie en strengspecifieke analyse van de enhancer-activiteit in complexe intragene regio's mogelijk, terwijl het toegankelijk blijft voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informaticatraining.

Een computationele pijplijn voor intergene/intragene enhancer RNA-kwantificering in embryonale stamcellen van muizen

Leer een fluorescentie-reporterassay om genen te identificeren die muis embryonale stamcellen onderhouden en zelfvernieuwing reguleren. Deze methode maakt snelle evaluatie van genfunctie mogelijk.

Oct4GiP Reporter Assay van genen die muis embryonale stamcellen Onderhoud en Zelfvernieuwing Regel Studie

Meer video's verkennen