Visualisatie en analyse van de bloedstroom en zuurstofverbruik in de lever microcirculatie: Toepassing op een acute hepatitis Model

Er werd een optisch systeem ontwikkeld om de microcirculatie in de lever te visualiseren met behulp van fluorescent gelabelde erytrocyten en om de partiële zuurstofdruk in de microvaten te meten met behulp van laserondersteunde fosforbeeldvorming. Deze methode kan worden gebruikt om fysiologische en pathologische mechanismen te onderzoeken door analyse van microvasculaire structuur, diameter, bloedstroomsnelheid en zuurstofspanning. In de levermicrocirculatie stroomt het bloed van de portale ES naar de centrale ES, waardoor een zuurstofgradiënt tussen de twee ontstaat.

De zuurstofconcentratie in de lever beïnvloedt zowel enzymexpressie als pathologie, waardoor analyse van de bloedstroom en zuurstofmeting belangrijke onderzoeksonderwerpen zijn. Onze experimentele methode omvat intraveneuze toediening van rode bloedcellen gelabeld met fluorescentie.

Om de microcirculatie te visualiseren met behulp van fluorescentie voor meting van de partiële zuurstofdruk, toedienen we intraveneus palladiumporfyrine, dat fosforescent uitstraalt in de bloedbaan wanneer het wordt opgewonden door een laser, in een mate die afhankelijk is van de concentratie van zuurstof in de omgeving. Dit proces maakt kwantitatieve analyse van zuurstof, partiële druk mogelijk. Metingen in de levermicrocirculatie toonden een partiële zuurstofdruk in de portale en centrale vene van respectievelijk 59,8 en 38,9 millimeter kwik aan, wat een effectieve meting van de zuurstofconcentratie aantoont. Vervolgens pasten we deze methodologie toe op een hepatitismodel.

We vonden een verhoogde partiële zuurstofdruk in de portale ES sinusoïdale en centrale es, maar een verlaagd drukverschil tussen de portale en centrale es. Dit is waarschijnlijk te wijten aan verminderde zuurstofconsumptie in het centrale venegebied als gevolg van hepatocytennecrose. Deze resultaten tonen aan dat onze methodologie van het gebruik van een optisch systeem om leverhemodynamiek en zuurstofconsumptie te meten, in staat is om mechanismen van verschillende leverziekten in de levermicrocirculatie te verhelderen.

De zuurstofgradiënt is een essentiële parameter die betrekking heeft op expressies van enzymen in periportale en paracentrale regio's, soorten leverziekten die gerelateerd zijn aan microverdelingen, dus het is belangrijk om bloedstroom en zuurstofconsumptie te kwantificeren. Om de mechanismen te verduidelijken, is het voordeel van onze methode niet-contact en continue optische meting die bloedstroom, vatdiameters en zuurstofgradiënt in de levermicrocirculatie kan kwantificeren. Heel bloed werd onttrokken aan een donormuis en de erytrocyten werden twee keer gewassen met PBS door centrifugatie bij 400 G gedurende vijf minuten.

Los vervolgens twee milligram FITC op in één milliliter, 100 millimolar DI natriumwaterstoffosfaat voordat u het filtert door een membraan met poriën van 0,2 micron. Plaats vervolgens een milliliter FITC-oplossing in een reageerbuis samen met een 0,15 milliliter oplossing van drie millimolar dexterous, een 0,25 milliliter 180 millimolar DI natriumwaterstoffosfaat en een 1,5 milliliter 100 millimolar DI natriumwaterstoffosfaat en klop om te mengen. Bewaar het bij kamertemperatuur gedurende twee uur voordat u de gekleurde RBC's twee keer met PBS wast.

Plaats vervolgens een kleine hoeveelheid RBC-suspensie op een glasslip en bevestig zowel de normale RBC-uiterlijk als voldoende fluorescentie. Suspendeer 0,1 milliliter RBC's in 0,9 milliliter PBS en bewaar het bij vier graden Celsius tot het volgende gebruik. Los 500 milligram BSA op in 10 milliliter PBS. Voeg vervolgens 30 milligram palladiumporfyrine toe en schud de oplossing een nacht lang, centrifugeer de oplossing om eventueel onopgelost palladiumporfyrine te verwijderen en filtreer het supernatant door een 0,2 micron-membraan. Doe een milliliter van het filtraat in testbuisjes en bewaar het bij min 20 graden Celsius. Zorg ervoor dat herhaald bevriezen en ontdooien wordt vermeden.

Om de microcirculatie microscopisch te visualiseren, snijdt u een gat van 20 millimeter diameter in een plastic plaat en bedek het gat met een vierkante dekglas van 30 millimeter per zijde. Spreid de belangrijkste leverkwab uit op een plastic plaat in rugligging na het canuleren van een staarvene. Bedek vervolgens het gebied rond de kwab met meerdere secties van plastic voedselfolie van drie millimeter bij acht millimeter om beweging door ademhaling en uitdroging te voorkomen.

Visualiseer de levercirculatie met een transmissiemicroscoop en bevestig dat er gedurende ten minste 15 minuten geen stagnatie van de bloedstroom in het gezichtsveld is. Om de bloedstroom geleidelijk te observeren, injecteert u twee milliliter van fluorescent gelabelde RBC's.

Om de partiële zuurstofdruk te meten, injecteert u 0,2 milliliter palladiumporfyrine-oplossing. FITC-gelabelde RBC's zullen één vijftigste van alle RBC's in circulatie vertegenwoordigen in het gevisualiseerde gebied, exciteer de FITC door het te belichten met een kwiklamp die is doorgelaten door een bandpassfilter van 450 tot 490 nanometer en neem de fluorescentie op met een CCD-camera. Palladiumporfyrinefosforescentie is relatief zwak en vereist een hooggevoelige detector en een verduisterde kamer.

De absorptiepieken van palladiumporfyrine bevinden zich rond 410 en 532 nanometer, en de tweede harmonische golflengte van 532 nanometer wordt aanbevolen. Deze golflengte wordt geproduceerd door een neodymium YAG pulslaser. Verbind de laserstraal met een omgekeerde microscoop en pas deze aan zodat de straal het centrum van het focale vlak verlicht. De ruimtelijke resolutie van de laser is afhankelijk van de spotgrootte, die kan worden aangepast door de straal door een pinhead te laten passeren.

Bevestig ook een longpassfilter en een fotomultiplierbuis aan de microscoop om fosforescentie te detecteren. De PMT moet gevoelig zijn voor rode golflengten, vooral rond de 700 nanometer. Bemonster de fosforescente signaal en bereken de vervaltijdconstante door een exponentiële functie toe te passen.

In dit experiment hebben we 500 punten bemonsterd bij 200 kilohertz. Om te kalibreren, bereidt u twee palladiumporfyrine-oplossingen voor met een partiële zuurstofdruk van respectievelijk 150 en nul millimeter kwik. Voor de nul millimeter kwik-oploss