Polymerase Chain Reaction: Basis Protocol Plus Problemen oplossen en Optimalisatie Strategieën

Het algemene doel van deze procedure is om de stappen te demonstreren die betrokken zijn bij de polymerasekettingreactie of PCR, die wordt gebruikt om een voldoende voorraad van een specifiek DNA-segment uit een kleine hoeveelheid uitgangsmateriaal te produceren. Eerst, verzamel de reagentia en materialen die in de PCR-reactie zullen worden gebruikt, stel vervolgens de reactiemix samen, inclusief de vier deoxy ribonucleotiden, de DNA-matrijs, de primers en de DNA-polymerase. Programmeer vervolgens de thermische cyclusvoorwaarden en voer de PCR-reactie uit.

Controleer hierna de resultaten om te bepalen of de reactie succesvol was. Uiteindelijk zou een polymerasekettingreactie een specifiek amplicon van de gewenste productgrootte moeten opleveren.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in dit protocol een beetje worstelen met het instellen van de berekeningen van elk van de variabele reagentia, en soms hebben ze problemen met het pipetten, de juiste volumes, vooral met de polymerase die glycerol bevat. Begin het experiment met een vers gevulde emmer met ijs. Draag handschoenen om besmetting van de reactie te voorkomen.

Mengsel en reagentia. Plaats de PCR-componenten op ijs om volledig te ontdooien. Dit omvat de DNA-matrijsprimers, DNA-polymerase 10 x reactiebuffer met of zonder magnesiumchloride, deoxynucleotiden, steriel water en magnesiumchloride.

De magnesiumchloride is vereist als de buffer zonder magnesiumchloride wordt gebruikt. Plaats een 96-wellplaat in een emmer met ijs als houder voor de 0,2 milliliter dunne wand PCR-buisjes. Rust nu het werkblad uit met PCR-buisjes en doppen.

Een PCR-buisjesrek, een ethanolresistente marker en een set micropipettes. Maak altijd een tabel van reagentia met de reactiemix met quantum steriel gedistilleerd water om een ​​eindvolume van 50 microliters te verkrijgen. Bijvoorbeeld, met vijf microliter van een buffer zonder magnesium, één microliter van 10 millimolair DN NTP's, en een geoptimaliseerde 4,0 millimolair magnesium.

Eén microliter van elk 20 micromolair primers, 0,5 microliter van een twee nanogram per microliter matrijs. En 0,5 microliter van polymerase zou 33 microliter steriel water alleen vereisen. Voeg magnesiumchloride toe als het niet aanwezig is in de 10 x buffer of als het nodig is voor PCR-optimalisatie.

Ga door met het labelen van de PCR-buisjes met een ethanolresistente marker voor elke reactiebuis. Voeg eerst de berekende hoeveelheden steriel water toe, voeg vervolgens 10 x buffer en 10 millimolair DN NTP's toe. Voor deze reactie voeren we een titratie uit met magnesiumchloride.

Aangezien de magnesiumconcentratie niet constant zal zijn, wordt magnesiumchloride afzonderlijk aan de PCR-buisjes toegevoegd en wordt het volume genormaliseerd tot 10 microliters met steriel water, zodat 40 microliters van de uiteindelijke mastermix aan elke PCR-buis wordt toegevoegd. Om de 50 microliter reactie en magnesiumchloride te voltooien, gaat u verder met het toevoegen van de DNA-matrijs en primers. Voeg ten slotte 0,5 tot 2,5 eenheden DNA-polymerase per 50 microliter reactie toe in een 1,8 milliliter micro fugebuis.

Bereid een mastermixoplossing voor die voldoende is om controles te accommoderen, evenals pijpettetransferverlies. Stel een micropipet in op ongeveer de helft van het totale oplossingsvolume en meng voorzichtig door te pipetten. Voor elk testmonster elegant mastermix in PCR-buis.

Nu voor de negatieve controle zonder DNA-matrijs, voeg alle reagentia toe en gebruik steriel water om het ontbrekende DNA-volume te compenseren. Gebruik vervolgens voor de positieve controle een set DNA-matrijs en primers die een bekend fragment versterken onder dezelfde omstandigheden als de experimentele PCR-monsters. PCR thermische cyclers verwarmen en koelen snel de reactiemix, waardoor hitte-geïnduceerde denaturatie van duplex, DNA-knielen van primers aan de plus en min strengen van de DNA-matrijs en verlenging van het PCR-product mogelijk is.

De cyclustijden zijn gebaseerd op de grootte van de matrijs en het GC-gehalte van het DNA voor de algemene formule. Begin met een initiële denaturatie van de matrijs, start vervolgens 25 tot 35 rondes van een drie-staps temperatuurcyclusprogramma. De eerste stap van deze cycli om het DNA-matrijs te denatureren.

Programmeer vervolgens voor optimaal, een knielen van primers ongeveer vijf graden Celsius onder de schijnbare smelttemperatuur van de primers, gevolgd door de verlengingsstap om de polymerase naar de DNA-matrijs te brengen en het PCR-product te synthetiseren. Voer nu het aantal cycli in. Volgende programma.

Een verlengde verlengingsstap voor het voltooien van de synthese van amplicons. Ten slotte omvat een terminatiefase, het koelen van het mengsel tot vier graden Celsius. Als standaard PCR-condities niet het gewenste amplicon opleveren, is PCR-optimalisatie noodzakelijk om betere resultaten te behalen.

Dus als de reacties de eerste keer niet werkten, wil je proberen de reactie te troubleshooten. En dus wil je eerst ervoor zorgen dat het probleem geen menselijke fout was. En dat zou kunnen gebeuren als je een pipetfout hebt of als je, als je bent vergeten een reagens toe te voegen aan het test, een van de testbuisjes.

Vervolgens kunt u proberen enkele van de strengheden van de voorwaarden aan te passen, zodat u de instelling van de thermocycler kunt wijzigen, of u kunt de magnesiumconcentratie aanpassen als een andere alternatieve methode. U kunt ook proberen enkele additieven toe te voegen aan het reagens om de problemen op te lossen. Overweeg ook hot start PCR als een veelzijdige modificatie waarbij de initiële denaturatietijd dramatisch wordt verhoogd.

AROS-gelelektroforese wordt vervolgens gebruikt om PCR van het GAL drie gen van genomisch DNA van S seia op te lossen om de optimale magnesiumionconcentratie voor deze set reagentia te bepalen, op te merken, een PCR-product van de verwachte grootte. 2098 basenparen verschijnt bij een magnesiumconcentratie van 2,5 millimolair met een optimale concentratie bij vier millimolair op verschillend DNA-matrijsamplificiatie van het gewenste PCR-product als een discrete band vereist twee millimolair magnesium. Het verminderen van de strengheid van de reactie tot effectief suboptimale amplificatievoorwaarden produceert een smear van niet-specifieke producten.

Bovendien, met