De α-test: Rapid Celvrije CD4 Enumeration met hele Speeksel

Er is een dringende behoefte aan betaalbare CD4-bepalingen om de HIV-ziekte in regio's met beperkte middelen te monitoren. Deze video demonstreert een goedkope point-of-care screeningstest waarbij CD4-aantallen worden bepaald op basis van de aanwezigheid van de protease-remmer Alpha 1-PI in het speeksel. Om dit te doen, krijgt de proefpersoon of patiënt eerst een citroencandy om de uitscheiding van sereus vocht in het speeksel te stimuleren.

Het speeksel wordt opgevangen in een monsterbeker en overgebracht naar een assayplaat met 96 putjes. Vervolgens wordt een verzadigende hoeveelheid van het proteinase porcine pancreatic elastase aan het speeksel toegevoegd, waarbij het bindt aan en alfa 1-antitrypsine remt. Daarna wordt een colorimetrisch elastase-substraat toegevoegd.

Alle resterende ongebonden elastase splitst het substraat, wat resulteert in een kleurverandering van kleurloos naar geel. Kumasi-blauw wordt aan de wells toegevoegd om het totale eiwit te kleuren en de colorimetrische metingen worden uitgevoerd met een microplate-reader. Uiteindelijk wordt de ratio van alfa 1 PI ten opzichte van het totale eiwit bepaald en gebruikt om de CD 4-tellingen nauwkeurig te beoordelen op basis van een indexwaarde.

Er zijn verschillende voordelen van deze techniek ten opzichte van de bestaande methode, namelijk flowcytometrie. De assay kan in het veld worden uitgevoerd zonder bloed af te nemen, wat traumatiserend en kostbaar is, zonder gebruik te maken van monoklonale antilichamen, die duur zijn, zonder dat er technische opleiding nodig is en zonder de noodzaak van koeling of transport van monsters. Deze methode overwint een kritieke barrière voor interventies bij AIDS en zou een grote impact moeten hebben op de kosten en de gezondheidsuitkomsten van patiënten en de frequentie van hiv-transmissie, die allen een grote invloed hebben op de wereldeconomie.

Deze methode kan inzicht bieden in hoe Alpha en PI het aantal CD4 T-cellen reguleren via adhesie en migratie, maar kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals de manier waarop andere proteïneremmers de adhesie en celmigratie van andere celtypen reguleren. We kregen het eerste idee voor deze methode toen we ontdekten dat Alpha 1 PI bij HIV-geïnfecteerde patiënten zo laag was, dat het daadwerkelijk beperkt hoeveel CD4 T-cellen in het bloed terechtkomen. Begin dit protocol met het bereiden van de benodigde werkoplossingen voor elke microplaat die gebruikt zal worden.

Bereid 60 milliliters van 0,05 molar tris-gebufferde zoutoplossing of TBS voor bij een pH van 7,8. Bereid daarnaast voor elke microplaat zes milliliters porcine pancreaselastase type één of PPE voor. Schud de PPE-suspensie goed en verdun deze vervolgens in TBS tot een concentratie van ongeveer 0,01 units per milliliter.

Bereid vervolgens een 0,1 molaire voorraadoplossing van het colorimetrische substraat SA three NA in DMSO; deze voorraadoplossing dient onmiddellijk te worden gebruikt of bewaard te worden bij -20 °C indien de voorraad direct zal worden aangewend. Bereid voor elke microplaat zes milliliter van een werkoplossing door deze 1 op 100 te verdunnen in TBS. Bereid tot slot een voorraadoplossing van 10% kumasi brilliant blue R two 50 in TBS en gebruik deze direct of bewaar de oplossing bij -20 °C indien deze onmiddellijk zal worden gebruikt.

Bereid zes milliliter voor voor elke microplaat door de stock 1 op 1000 te verdunnen in TBS. Bij het hanteren van speeksel is het belangrijk om passende voorzorgsmaatregelen te nemen, zoals het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas, terwijl de proefpersoon of patiënt in staande positie is. Plaats een SGO in de mond om serumexudatie te stimuleren.

De rol van de hiv-patiënt in deze demonstratie wordt gespeeld door een onderzoeksassistent. Een suikervrije citroenlepeltje is handig voor hiv-patiënten die vaak tandeloos zijn en geen kauwgom kunnen kauwen; slik indien nodig gedurende de eerste drie minuten en verzamel gedurende de volgende drie minuten het volledige mondspeeksel in een monsterbekertje. Dit zal ongeveer twee milliliters speeksel opleveren.

Indien het speeksel niet onmiddellijk wordt gebruikt, dient het op de dag van verwerking te worden ingevroren en bewaard bij -80 °C; verwarm het monster vervolgens tot 37 °C. Eenmaal ontdooid kan het speeksel tot drie dagen worden bewaard bij 2 tot 4 °C. Elk monster en elke controle wordt in drievoud op een 96-wells vlakbodemplaat geplaatst om de assay op te zetten, waarbij 130 µL TBS aan elke monster- en controlewell wordt toegevoegd.

Vermijd vervolgens mucine, aangezien dit viskeus is en geen serumexudaat bevat. Overbreng 20 µL speeksel naar elk van de drie testwells en drie negatieve controlewells. Voeg daarna 20 µL TBS toe aan de positieve controlewells en meng dit door te pipetteren.

Bij deze stap is het belangrijk om vortexen te vermijden om beluchtingsvorming tijdens het pipetteren van het speeksel te voorkomen, en om te voorkomen dat vaste deeltjes en slijm worden gepipetteerd. Schud vervolgens de PO-sign pancreatische elastase of PPE-werkoplossing goed om te mengen; voeg daarna 50 µL toe aan de monsters, de positieve controleputjes en de negatieve controleputjes.

Voeg 50 µL TBS toe. Mengen is niet nodig, aangezien het toegevoegde volume groot genoeg is om een gelijkmatige verdeling in het speekselmengsel mogelijk te maken. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg na de incubatie aan elke put 50 µL van de werkende oplossing van het elastase-substraat SA three NA toe. Incubeer vervolgens nogmaals 45 minuten bij 23 °C. Wanneer 45 minuten zijn verstreken, voegt u aan elke put 50 µL van de werkende oplossing van Coomassie-blauw toe.

Lees vervolgens de absorbantie in een microplaatlezer af bij 405 nanometer voor de detectie van SA drie NA-splitsing en bij 595 nanometer voor de detectie van kumasi-blauw, wat de totale eiwitgehalte vertegenwoordigt. Om de alpha één PI-index te berekenen, gebruikt u eerst de volgende formule om de genormaliseerde absorbantie voor elke golflengte te verkrijgen door het verschil tussen het gemiddelde van het monster en het gemiddelde van de negatieve controle te delen door het verschil tussen het gemiddelde van de positieve controle en het gemiddelde van de negatieve controle. Om vervolgens de alpha één PI-index te bepalen, deelt u de genormaliseerde absorbantie bij 405 nanometer door de genormaliseerde absorbantie bij 595 nanometer, zoals hier wordt getoond, om vast te stellen of de alpha-test geschikt zou kunnen zijn voor gebruik als point-of-care screeningtest voor het monitoren van CD4-aantallen in endemische, hulpbronbeperkte regio's.

Gestimuleerd speeksel werd verzameld van 20 vrouwelijke en 11 mannelijke HIV-1-patiënten die voor routinezorg naar een kliniek in Kameroen kwamen. In overeenstemming met voorlopige observaties tijdens de ontwikkeling van de alfatest met speeksel verzameld in New York City, correleerden de alpha one PI-index en het speeksel verzameld in Kameroen met CD4-tellingen met een R²-waarde van 0,91 en een P-waarde van minder dan 0,0001. De relatie werd gedefinieerd door een drie-parameter sigmoïdale curve, wat consistent is met de dosis-responscorelatie. De 95%-betrouwbaarheids- en predictie-intervallen zijn respectievelijk weergegeven met blauwe en rode lijnen.

In een eerdere studie hebben we vastgesteld dat CD4-positieve T-cellen een sinusoidale cyclus vertonen met een periodiciteit van 23 ± 3,5 dagen bij HIV-1-patiënten en bij personen met de erfelijke vorm van alfa-1-PI-deficiëntie, PIZZ. Hier is een representatief voorbeeld van een computergegenereerde sinuscurve-analyse van CD4-cycli bij een HIV-negatieve gezonde controlepersoon met een periodiciteit van 27 dagen. Computergeneerde sinuscurve-analyses van de CD4-positieve T-celveranderingen bij zes proefpersonen leverden de verwachte waarden voor de piek-tot-piek amplitude en de oscillatie-as op. De oscillatie-as was gecorreleerd met de amplitude met een R-kwadraatwaarde van 0,96 en een p-waarde van 0,009.

Bij patiënten met lage CD4-positieve T-celgetallen waren de cyclische veranderingen in het CD4 T-celgetal klein, terwijl deze veranderingen bij patiënten met hoge CD4-positieve T-celgetallen groot waren, omdat de hier afgebeelde regressielijn de oscillatie-as schat en de oscillatie-as gecorreleerd is met de amplitude. De amplitude kan voor de regressielijn worden berekend om te schatten hoe ver boven en onder de regressielijn de CD4-positieve T-cellen naar verwachting zouden variëren als gevolg van cyclische schommelingen; na het overlayen van de berekende amplitude en het betrouwbaarheidsinterval werd vastgesteld dat de amplitude, aangegeven door de groene lijn, binnen het 95%-betrouwbaarheidsinterval ligt, aangegeven door de blauwe lijn.

Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in 90 minuten worden uitgevoerd, vanaf het moment van speekselafname tot het verkrijgen van het CD4-celgetal voor de patiënt. Deze procedure is bedoeld voor gebruik als screeningstest om CD4-getallen te monitoren. Indien een patiënt significante veranderingen in de CD4-getallen vertoont, dient deze patiënt verder gevolgd te worden met flowcytometrie om te bevestigen dat de CD4-metingen geldig zijn en om te ondersteunen bij behandelbeslissingen.

In de volgende ontwikkelingsfase zal de microplaat-assay worden omgezet in dipsticktechnologie, waardoor tests kunnen worden uitgevoerd zonder instrumentarium of elektriciteit. Hoewel de kans dat hiv via speeksel wordt overgedragen klein is, hebben hiv-patiënten vaak andere infectieziekten zoals tuberculose en hepatitis C; houd er daarom rekening mee dat het werken met speeksel, net als bij bloed, extreem risicovol kan zijn vanwege onbekende infectieuze deeltjes. Er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en andere persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens het uitvoeren van deze procedure.