Name: Detectie van virale RNA door fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer virale RNA-detectie door fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) in geïnfecteerde cellen. Deze methode visualiseert RNA-lokalisatie en intracellulair virusverkeer met fluorescentiemicroscopie voor virologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken verleden en huidige leden van het lab voor bijdragen aan de ontwikkeling van de methodiek die hier geschetst en Alan Cochrane voor advies. LA is een ontvanger van een Canadese Institutes of Health Research (CIHR) Doctoral Fellowship en AJM wordt ondersteund door een Fraser, Monat en MacPherson Career Award. Dit werk wordt ondersteund door een subsidie ​​van het CIHR (subsidie ​​# MOP-56974).

1. Probe Voorbereiding <ol><li> Digest 1 pg van het in vitro transcriptie vector, pKS (+) pol 236nt 9 met Kpn1 enzym bij 37 ° C gedurende 1 uur en loopt het gelineariseerde DNA product op een agarose gel. Het fragment dient ongeveer 2500 bp. </li><li> Snij het ​​fragment van de gel en zuiveren met de Roche Micro Elueer gelextractiekit (alle gebruikte reagentia worden in tabel 1). Voer de laatste elutie in 30 pi elutiebuffer. Run 5 ul van het product op een agarose gel om de zuivering te controleren. </li><li> Meng een in vitro transcriptie reactie (zie onderstaand recept) met de DIG Roche RNA labeling kit en incuberen bij 37 ° C gedurende 2 uur. </li></ol> In vitro transcriptie reactie: <table border="1"><tbody><tr><td> Gelineariseerde DNA </td><td> 23 pl </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA etikettering mix (Roche) </td><td> 4 pi </td></tr><tr><td> 1X Transcription buffer </td><td> 8 pl </td></tr><tr><td> 20U RNase UIT </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> 80U T7 RNA-polymerase </td><td> 4 pi </td></tr><tr><td> Totaal </td><td> 40 pi </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Voeg 228 U van DNase I en incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Stop de reactie door toevoeging EDTA pH 8,0 tot een eindconcentratie van 20 mM. </li><li> Zuiver de reactie met behulp van de Quick Spin kolommen van Roche zoals gespecificeerd door de fabrikant. </li><li> Zuiver de sonde door neerslag met 1/10 volume DEPC behandeld met 3M NaOAc pH 5,2 en 2,5 volumes van ijskoude 95% ethanol. Mengen en incuberen bij -80 ° C gedurende 30 min een nacht. </li><li> Centrifugeer de sonde 15 min bij 4 ° C bij 15.000 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en was de pellet in ijskoude 70% ethanol. Centrifugeer opnieuw gedurende 5 min bij 4 ° C bij 15.000 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en droog de pellet. Resuspendeer de pellet in 50 ul water (DNase / RNase gratis) met 10 U Invitrogen RNase OUT. </li><li> Bereken de concentratie van probe spectrofotometrisch (maatregel RNA bij 260 nm), en verdund tot een concentratie van 5 ng / pl. Bewaren in fracties bij -20 ° C voor kortdurend gebruik, of -80 ° C voor opslag op lange termijn. Het wordt aanbevolen om onder assay vergelijkingen uit te voeren, zodat behoud van een hoeveelheid voor. </li></ol> 2. Cell Fixatie <ol><li> Het is in eerste instantie belangrijk om zaad hechtende cellen op onbehandeld, steriele glazen dekglaasjes zodat de uiteindelijke confluentie na de oogst is ongeveer 70-80%. Voor niet-hechtende cellen groeien normaal en wanneer bereid verzamelen, te incuberen met dekglaasjes die zijn 0,01% w / v poly-L-lysine (Sigma-Aldrich, Inc) behandeld gedurende 1 uur. Voor een typische 12 en polystyreen weefselkweek plaat (3,8 cm 2) worden 150.000 cellen (bijv. HeLa) uitgeplaat 24 uur voorafgaand aan transfectie. Niet-hechtende cellen geïnfecteerd of getransfecteerd zoals gebruikelijk en mag adhier om dekglaasjes voor fixatie 3. </li><li> Gooi de media en was de cellen met 1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing bereid in dubbel gedistilleerd water (DPBS) gedurende 1 minuut. Diethylpyrocarbonaat (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc) behandelde 1X PBS kunnen ook worden gebruikt, kunnen echter onbehandelde PBS niet omdat kan RNase enzymen. </li><li> Gooi de PBS en voeg 4% paraformaldehyde, genoeg om volledig te bedekken de cellen. Incubeer gedurende 15-20 minuten. </li><li> Gooi de paraformaldeyhyde en was cellen met 1X DPBS gedurende 1 minuut. </li><li> Gooi de DPBS en voeg 0,1 M glycine (opgelost in 1X DPBS). Incubeer gedurende 10 minuten. </li><li> Gooi de glycine en was de cellen met 1X DPBS gedurende 1 minuut. </li><li> Gooi de DPBS en voeg 0,2% Triton-X (opgelost in 1X DPBS). Incubeer gedurende 5-10 minuten. Als kleuring voor nucleolair of nucleaire envelop-eiwitten, permeabilize met Triton X-100 voor niet meer dan 5 min of het eiwit wordt de lokalisatie en diffuus. </li><li> Gooi Triton X-100 en was een keer in1X DPBS 1 min. </li><li> Voor de lange-termijn opslag, vervang PBS met 70% ethanol en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal vier maanden. U kunt ook eenmaal meer wassen met 1X DPBS en beginnen te vissen. </li></ol> 3. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) <ol><li> Indien de dekglaasjes opgeslagen in ethanol, vervangen ethanol 1X DPBS en kunnen de cellen te rehydrateren gedurende 30 minuten. Rehydratatie kan &#39;s nachts worden gedaan als de dekglaasjes worden opgeslagen bij 4 ° C. </li><li> Was de dekglaasjes met 1X DPBS gedurende 1 minuut. </li><li> Bereid je dia&#39;s aan het broeden op dekglaasjes en zorg te reinigen en goed te labelen ze. </li><li> Voor een 18mm dekglaasje, voeg 50 ul DNase oplossing (25 eenheden / dekglaasje, los verkrijgbaar) aan de dia. Voeg de dekglaasje, waarbij u het cel zijde leggen en dat zij het incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de dekglaasjes met 1X DPBS gedurende 1 minuut. </li><li> Voeg 50 ul hybridisatiemengsel (zie recept) per dekglaasje opeen dia en incubeer het dekglaasje cel naar beneden gedurende 16-18 uur bij 42 ° C De incubatie moet worden uitgevoerd in een bak met een 50% formamide, 2X SSPE mix (12,5 ml gedeïoniseerd formamide, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml water). </li></ol> Hybridisatiemengsel (voor een dekglaasje 50 pi): <table border="1"><tbody><tr><td> Bedrag op voorraad </td><td> Materiaal (bij uiteindelijke concentratie) </td></tr><tr><td> 25 pi </td><td> Formamide, 50% (gedeïoniseerd; elke bron) </td></tr><tr><td> 5 il (10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc) </td></tr><tr><td> 5 il (20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 il (van 50X) </td><td> Denharts, 5x </td></tr><tr><td> 0,125 pi (5 eenheden) </td><td> RNase UIT </td></tr><tr><td> 5 pi (25 ng 5 ng / pl) </td><td> Sonde </td></tr><tr><td> 5 pi </td><td> H2O DEPC, de uiteindelijke tevolume 50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Incubeer dekglaasjes cel naar beneden in 50 pi 50% formamide (verdund in 1X DPBS) gedurende 15 minuten bij 42 ° C. </li><li> Tweemaal wassen de dekglaasjes in 2X SSPE door incubatie deze cel naar beneden in 50 pi 2X SSPE (20X SSPE verdund in 1X DPBS) gedurende 5 min elk bij 42 ° C. </li><li> Was de dekglaasjes in 1X DPBS gedurende 1 minuut. </li></ol> 4. Immunofluorescentiekleuring <ol><li> Blok de dekglaasjes door ze cel naar beneden in 50 pi 1X Roche blokkeeroplossing (10X Roche blokkeren verdund in 1X DPBS) gedurende 30 minuten. </li><li> Incubeer de dekglaasjes cel naar beneden in 50 pi primaire antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. Anti-DIG antistof worden verdund volgens fabrikant richting 1X blokkeeroplossing. Als andere antilichamen worden gebruikt om eiwitten vlek, kunnen zij worden toegevoegd aan het juiste concentratie voorwaarde dat alle gebruikte antilichamen zijn afgeleid van verschillende gastheer specn. </li><li> Was de dekglaasjes gedurende 10 min in 1X DPBS. </li><li> Incubeer de dekglaasjes cel naar beneden in 50 pi secundair antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. Alexa Fluor-geconjugeerde antilichamen (Invitrogen) kan worden gebruikt om verschillende kleuren genereren en worden op 1:500 in 1X blokkeeroplossing, 1X DPBS. </li><li> Was twee keer de dekglaasjes gedurende 10 minuten elk in 1X DPBS. </li><li> Droog de dekglaasjes cel kant naar boven op Whatman papier. Zorg ervoor dat u de dekglaasjes dekking van blootstelling aan licht en bleken te voorkomen. </li><li> Zodra alle vloeistof is verdampt, monteren de dekglaasjes op verse dia&#39;s met 8 pi ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.) Tik voorzichtig naar beneden het dekglaasje om eventuele luchtbellen te verwijderen. </li><li> Breng nagellak aan de randen van het dekglaasje om deze vast te zetten. </li><li> De visualisatie van RNA en eiwitten door microscopische technieken is ook cruciaal voor het succes van deze techniek. Instellingen op de gebruikte microscoop kan helpen of hinderen visualisatie dus het is belangrijk dat deinstellingen van de microscoop goed ingesteld en consistent ene monster elkaar in een bepaalde proef. Voor gedetailleerde microscopie instellingen, optica en antilichaam combinaties zie referenties 1,10. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een voorbeeld van virale RNA kleuring te zien in figuur 2. Het virale RNA voor HIV-1 is te zien in het cytoplasma diffuus weergegeven voor het grootste deel, hoewel kleine cytoplasmatische punctae zijn niet ongewoon. De specificiteit kan worden gezien door het vergelijken van positieve cellen naar de omliggende cellen die geen fluorescentie weer te geven. Zoals in de inleiding, HIV-1 die de regulerende Rev eiwit mist produceert RNA dat wordt vastgehouden in de kern: dit kan gezien worden als een heldere signaal in de kern, en een gebrek aan RNA fluorescentiesignaal in het cytoplasma. Overexpressie van cellulaire eiwitten kan ook verschuiving van de verdeling van de HIV-1 RNA. In figuur 2 </strong&gt;, de overexpressie van eiwitten die betrokken zijn bij endosomale vesicle mensenhandel (bijvoorbeeld Rab7-interactie lysosomale eiwit (RILP) 11 of N-terminaal verwijderd RILP (RILPN) 11, en ​​eiwitten die interfereren met dyneine motorische functie [bv p50/dynamitin 1, 12], interfereren met de normale stationaire toestand lokalisatie van het virale genoom RNA bepaald door FISH analyse RILP expressie leidt opnieuw lokalisatie van het virale genoom RNA het microtubule organisatie centrum (MTOC) 13;. RILPN dispergeert late endosomen in de cytoplasma als gevolg van het onvermogen om te binden aan p150 gelijmd van de dyneine motor complex 14 en p50/dynamitin blokkeert de grote subeenheid van dyneine motor en releases endosomen laat, maar ook het virale genoom RNA en HIV-1 structurele eiwitten van de cel periferie 1 (Figuur 2). De manipulatie van de steady-state lokalisatie van het virale genoom RNA, een belangrijke bijdrage leveren aan de besmettelijkheid vanvirusdeeltjes, zou in de eventuele ontwikkeling van geneesmiddelen. In onze handen viraal RNA in de cel reeds op 3 uur na transfectie en infectie 10 en wordt gemakkelijker door deze FISH techniek 12 uur. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomschema van het protocol voor FISH / IF co-analyses. De cellen worden gekweekt op dekglaasjes en daarna gefixeerd met paraformaldehyde. Behandelingen glycine en Triton-X worden uitgevoerd voordat de cellen worden gebruikt voor hetzij FISH / IF of opgeslagen in 70% ethanol voor opslag. Cellen gedehydrateerd voor opslag worden gerehydrateerd in 1X DPBS (DEPC behandelde PBS) alvorens verder te gaan met FISH / IF. Cellen worden behandeld met DNase I en liet nacht te hybridiseren met de probe. Na hybridisatie is voltooid, worden de cellen gewassen met formamide, en met SSPE, en een laatste 1X DPBS spoelen. Blokkeren oplossing wordt aangebracht op de cellen, gevolgd door incubatie metde primaire antilichamen. Na het wassen worden secundaire antilichamen toegepast. Laatste twee wasbeurten in 1X DPBS completeren het kleuringsprocedure waar op de dekglaasjes worden gedroogd en gemonteerd op dia&#39;s voor de beeldvorming. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Figuur 2. Representatieve resultaten met FISH / IF co-analyses. A) HIV-1 wordt getransfecteerd in HeLa-cellen en in sommige gevallen met constructen die de expressie van cellulaire eiwitten (RILP, p50/Dynamitin en RILPΔN (een amino-terminale deletie mutant) veroorzaken) . FISH / IF co-analyses werd uitgevoerd: RNA wordt aangeduid in het groen met een G3BP of LAMP1 (rood) te differentiëren. B) HIV-1 wordt uitgedrukt in HeLa en verzameld op verschillende tijdstippen. Viraal RNA expressie wordt gevolgd in het groen, terwijl het cellulaire eiwit, hnRNP A1, is gekleurd in het rood. Grootte balken 10 urn. Afbeeldingen gewijzigd ten opzichte van referenties 1 (selecteer cijfers van panel A; RILP, p50/Dynamitin en RILP deltaN)en 17 (panel B).

<ol><li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li>
<li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727(2011).</li>
<li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li>
<li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li>
<li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mRNA+export%3A+insights+from+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li>
<li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li>
<li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li>
<li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA%2C+Gag%2C+and+Vpr+localization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li>
<li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li>
<li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li>
<li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li>
<li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li>
<li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li>
<li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li>
<li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hRIP%2C+a+cellular+cofactor+for+Rev+function%2C+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li>
<li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import%3A+implications+for+HIV-1+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li>
<li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li>
<li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+destinies%3A+degradation%2C+targeting%2C+assembly%2C+and+endocytosis+of+HIV+Gag%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li>
<li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li>
<li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li>
<li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li>
<li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li>
<li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007(2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

FISH / IF co-analyse is een betrouwbare methode om virale RNA te visualiseren in cellen die nu is geraffineerd 9,15,16. In de loop van enkele jaren, hebben we een verfijndere methode van kleuring voor RNA. Deze techniek kan worden gebruikt op een groot aantal celtypes die de sonde specifiek voor het doel RNA 17. Door het labelen van de sonde met DIG, zijn wij in staat het visualiseren van de RNA door eenvoudige kleuring. Wanneer kleuring voor RNA en andere eiwitten worden gecombineerd, FISH / IF co-analyses uitgegroeid tot een krachtig instrument om cellulaire structuren en eiwit / RNA-lokalisatie te observeren. De specificiteit van de RNA detectie vrij hoog. Dit wordt geïllustreerd in figuur 2. In een deel van het originele werk dat zich richtte op virale genoom RNA lokalisatie, FISH vastgesteld dat een gebrek aan Rev viraal RNA gevangen in de kern 18. Aangezien dit is, heeft veel nieuwe informatie over virale genoom RNA lokalisatie is verkregen met behulp van de technique hier beschreven. Door overexpressie cellulaire eiwitten kunnen specifieke groepen en niet alle van het virale RNA gedwongen lokaliseren verschillende gebieden van de cel. RILP overexpressie, die lijkt op de fenotype verkregen wanneer hnRNP A2 is uitgeput door siRNA in HIV-1-expresserende cellen 13, waardoor de RNA zichtbaar ophopen op de MTOC. De virale genoom RNA kan worden geduwd om de cel omtrek uitschakelen van de min-end motor eiwit dyneine: p50/Dynamitin overexpressie of knockdown van de zware keten dyneine 1 resulteert in het vrijkomen van virale genoom RNA van intracellulaire domeinen van de cellulaire periferie ( Figuur 2). Een mutant van RILP, RILPΔN, die niet meer bindt de dyneine motor, verspreidt endosomen (getagged door LAMP1) in het cytoplasma, omdat ze niet meer actief gelokaliseerd in juxtanuclear domeinen. Deze resultaten wijzen op het idee van een plastic populatie van HIV-1 RNA genoom en in het bijzonder, dat verschillende zwembaden van HIV-1 genoomRNA bestaan ​​soms identificeerbare rollen in de virale replicatie cyclus. Dezelfde begrippen zijn reeds aangegeven voor het eiwit gecodeerd door dit mRNA, Gag 19. Er zijn beperkingen aan het gebruik van FISH / IF co-analyses die zijn gerelateerd aan antilichaam keuze en beschikbaarheid. De optimalisatie van de beste combinatie van primaire en secundaire antilichamen, en de concentraties daarvan, zal de tijd nemen om te optimaliseren (zie tabel 1 &amp; 2). Antilichamen gemaakt van hybridoma of geproduceerd door grote bedrijven kan hebben concentraties die overal variëren van 1:2 tot 1:2000, maar zorg ervoor dat de richtlijnen van de fabrikant voor het beste resultaat te volgen. De gastheer waarin het antilichaam geproduceerd moet worden overwogen. Mengen schapen met geit antilichamen moet worden vermeden in primaire en secundaire antilichamen als deze combinatie hoge achtergrond door cross-soortherkenning (gegevens niet getoond). Voor de Alexa-Fluor secondary antilichamen, kan de concentratie worden gebruikt 1:500 bijna elk antilichaam in de toestel. De andere nadeel van FISH / IF co-analyses, zoals beschreven in dit rapport is het vangt de RNA op de locatie bij steady-state, na cellen zijn gefixeerd en doorlaatbaar gemaakt met behulp van paraformaldehyde en wasmiddel (Figuur 1). Er is echter RNA-imaging in levende cellen is bereikt door een verscheidenheid aan middelen 20-22, meestal in varianten van de virale RNA-genomen die zijn voorzien van tag door fluorescerende eiwitten zoals GFP. Echter aanvullende middelen om RNA-lokalisatie te identificeren in levende cellen blijven aan de oppervlakte. Deze nieuwe methoden betrekking op de tagging RNA door middel van Spinazie 23, SNAP 24, of MTRIP 2. Deze technieken lijden enkele nadelen waaronder de vereiste cellen permeabilize voor toevoeging substraten of een groep worden geconstrueerd om de mRNA labelen te detecteren mRNA microscopie. Immers de belangrijkste ADVAntage van FISH analyse beschreven in dit rapport ligt in het feit dat de natieve RNA ongewijzigde leidt tot de fysiologisch relevante resultaten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 18mm dekglaasjes </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% paraformaldehyde </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> 4% maken: Los 20g in 500 ml 1XDPBS bij 60 ° C met 5 druppels NaOH. pH-waarde tot 7,2 van het vuur en bewaar bij -20 ° C. Neem niet meer dan 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Elueer Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Etikettering Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transcriptie T7-RNA polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Snel Spin Columns </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamide </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNase UIT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescerende Antilichaam Enhancer Set voor DIG Detection # 4 (het blokkeren oplossing) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor secundaire antilichamen </td><td> Invitrogen </td><td> Zie tabel 2 </td><td></td></tr><tr><td> Hybridisatie Oven </td><td> Boekel Scischappelijke </td><td> Model 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Identificatie van specifieke reagentia en apparatuur <table border="1"><tbody><tr><td> Soorten van anti-DIG antistof (verdunning; bedrijf, catalogusnummer) </td><td> Kleuren </td><td> Alexa Fluor gebruikte (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Muis (1:500, Sigma, B7405) </td><td> groen </td><td> Alexa Fluor 488 ezel anti-muis (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> rood </td><td> Alexa Fluor 594 ezel anti-muis (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> blauw </td><td> Alexa Fluor 647 ezel anti-muis (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Schapen (1:200, Roche, 11376623) </td><td> groen </td><td> Alexa Fluor 488 ezel anti-schaap (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> rood </td><td> Alexa Fluor 594 ezel anti-schaap (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> blauw </td><td> Alexa Fluor 647 ezel anti-schaap (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Combinaties van secundaire antilichamen en anti-DIG weergegeven met catalogusnummer en concentraties.

detectie van virale rna door fluorescentie<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie (fish)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Virussen die cellen infecteren oproepen specifieke wijzigingen in de normale celfuncties, die dienen om energie en grondstoffen af ​​te leiden voor virale replicatie. Veel aspecten van de gastheercel functie worden gevorderd door virussen, meestal door de expressie van virale gen-producten die werven gastheercel eiwitten en machines. Bovendien, virussen ingenieur specifieke membraan organellen of tag op de mobiele blaasjes en motor eiwitten aan de regio&#39;s van de cel (tijdens de novo infectie, virussen coöpteren moleculaire motor eiwitten aan de kern richten richten, later, tijdens de montage virus, zullen ze kapen cellulaire machinerieën die zal helpen bij de assemblage van virussen). Minder is wel te verstaan ​​over de manier waarop virussen, met name die met een RNA genoom, het coördineren van de intracellulair verkeer van zowel eiwit-en RNA-componenten en hoe ze te bereiken montage van infectieuze deeltjes op specifieke loci in de cel. De studie van RNA lokalisatie begon in eerder werk. Het ontwikkelen van een lagere eukaryote embryos en neuronale cellen die belangrijke biologische informatie, en ook gewezen op het belang van RNA lokalisatie in de programmering van genexpressie cascades. Het onderzoek in andere organismen en cel systemen heeft geleid tot soortgelijke belangrijke informatie. Virussen zijn obligate parasieten en moeten gebruik maken van hun gastheercellen te repliceren. Zo is het essentieel te begrijpen hoe RNA virussen de RNA-genomen richting van de kern via de nucleaire poriën door het cytoplasma en aan een van zijn eindbestemming, in voorloper virusdeeltjes 1. FISH dient als een nuttig hulpmiddel om veranderingen in de steady-state lokalisatie van viraal RNA te identificeren. In combinatie met immunofluorescentie (IF) analyse 22, VIS / IF co-analyses zullen informatie geven over de co-lokalisatie van eiwitten met het virale RNA 3. Deze analyse geeft daarom een ​​goed uitgangspunt om voor RNA-eiwit interacties te testen door andere biochemische of biofysischetest 4,5, omdat co-localisatie is op zichzelf niet genoeg bewijs om zeker te zijn van een interactie. Bij het ​​bestuderen van viraal RNA lokalisatie met behulp van een methode als deze is, heeft veel informatie opgedaan op zowel virale en cellulaire RNA handel gebeurtenissen 6. Bijvoorbeeld, HIV-1 RNA produceert in de kern van geïnfecteerde cellen, maar de RNA alleen vertaald in het cytoplasma. Wanneer een toets viraal eiwit ontbreekt (Rev) 7 is FISH van het virale RNA gebleken dat het blok van virale replicatie door het behoud van de HIV-1 RNA genomische in de kern 8. Hier wordt de gevolgde methode voor visuele analyse van genomisch viraal RNA in situ. De methode maakt gebruik van een gelabeld RNA probe. Deze sonde is ontworpen om een ​​aanvulling op het virale genoom RNA. Tijdens de in vitro synthese van de antisense RNA probe de ribonucleotide die is gemodificeerd met digoxigenine (DIG) is opgenomen in een in vitro transcription reactie. Zodra de probe gehybridiseerd is de doel-mRNA in cellen worden vervolgens antilichaam labeling stappen (figuur 1) tonen de lokalisatie van de mRNA en eiwit van belang bij het ​​uitvoeren FISH / IF.

Een fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)-methode is ontwikkeld om visueel te detecteren virale genoom RNA met behulp van fluorescentie microscopie. Een sonde wordt met specificiteit voor de virale RNA die vervolgens kan worden geïdentificeerd door een combinatie van hybridisatie en immunofluorescentie technieken. Deze techniek biedt het voordeel dat het identificeren van de lokalisatie van het virale RNA of DNA bij steady-state, het verstrekken van informatie over de controle van intracellulaire virus mensenhandel evenementen.

Detectie van virale RNA door fluorescentie<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

Virussen die cellen infecteren, roepen specifieke veranderingen in de normale celfuncties op, die dienen om energie en hulpbronnen om te leiden naar virale replicatie. Veel ...

Het algemene doel van deze procedure is om de lokalisatie van viraal RNA in C twee binnen cellen te visualiseren. Om dit te bereiken, worden de cellen die getransfecteerd of geïnfecteerd zullen worden eerst gekweekt op glazen dekglasjes. De tweede stap is het fixeren van de cellen met 4%paraform aldehyde na een succesvolle transfectie of infectie.Incubeer vervolgens de cellen met een hybridisatiemengsel dat het RNA labelt. Dit gebeurt door het dekglas met de celzijde naar beneden op het hybridisatiemengsel op een objectglas te plaatsen. De laatste stap in deze procedure is het gebruik van antilichamen om de cellen te kleuren voor het RNA-label.Uiteindelijk wordt de lokalisatie van het gelabelde RNA binnen de cel gevisualiseerd door middel van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals RNA-imaging in levende cellen met behulp van tags, is dat natief RNA kan worden gedetecteerd in plaats van gemodificeerd RNA. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan deze techniek moeite hebben, omdat het zorgvuldigheid vereist bij de behandeling en hantering van dekglasjes, standaardisatie van de methode en een zeer precieze timing.Tijdens de incubaties hangt de specifieke procedure voor het kweken van cellen voor fixatie af van het celtype. Voor adherente cellen is het in eerste instantie belangrijk om deze uit te zaaien op onbehandelde steriele glazen dekglasjes, zodat de uiteindelijke confluentie bij het oogsten ongeveer 70 tot 80% bedraagt. Niet-adherente cellen moeten op de standaardmanier worden gekweekt tot ze klaar zijn om te worden verzameld.Incubeer deze vervolgens met dekglasjes die zijn behandeld met poly-L-lysine voor een typische polystyreen tissuekweekplaat met 12 putjes; gebruik 150.000 cellen per putje, 24 uur vóór infectie of transfectie. Incubeer de cellen op de dekglasjes gedurende één uur bij 37 °C om de procedure voor celfixatie te starten. Verwijder het medium door voorzichtig af te zuigen en voeg voorzichtig 1x PBS toe, bereid in dubbel gedestilleerd water.Of was de cellen gedurende één minuut met DPBS. Diethylpyrocarbonaat- of DEPC-behandelde 1x PBS kan ook worden gebruikt. Gebruik geen onbehandelde PBS, omdat deze RNase-enzymen kan bevatten.Verwijder de DPBS en voeg voorzichtig voldoende 4% paraformaldehyde toe om de cellen volledig te bedekken; laat dit 15 tot 20 minuten incuberen. Verwijder daarna de paraformaldehyde en was de cellen gedurende één minuut met DPBS. Verwijder de DPBS en voeg 0,1 molair glycine toe; laat dit 10 minuten incuberen.Verwijder vervolgens de glycine en was de cellen gedurende één minuut met DPBS. Voeg na het verwijderen van de DPBS 0,2% Triton X 100 toe en incubeer dit gedurende vijf tot 10 minuten. Indien er wordt gekleurd voor nucleolaire eiwitten of eiwitten van de kernenveloppe, permeabiliseer dan met Triton X 100 gedurende maximaal vijf minuten, anders wordt de eiwitlokalisatie diffuus.Verwijder triton X 100 en was twee keer in DPBS gedurende telkens één minuut voordat de procedure voor vissen wordt gestart. Bereid de objectglazen voor waarop de dekglasjes worden geïncubeerd, waarbij u erop let deze goed te reinigen en te labelen. Voeg voor een dekglasje van 18 millimeter 50 µL DNA-oplossing toe aan het objectglas.Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de juiste behandeling van de dekglasjes. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de juiste zijde van het dekglasje wordt geïncubeerd en dat deze voorzichtig worden gehanteerd. Om breuk te voorkomen, plaatst u het dekglasje op het objectglas, waarbij u erop let dat de celzijde naar beneden is gericht, en incubeert u dit gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de dekglasjes na 15 minuten met de celzijde naar boven in een kweekschaal met 1X-DPBS.Was de dekglasjes gedurende één minuut. Dit mengsel bevat het volgende: 50% gedeïoniseerd formamide, 1 mg/mL TRNA, 2 X-S-S-P-E, 5 X dnar RNAs-probe en DEPC-water tot een eindvolume van 50 µL.De probe is een digoxigenine-gelabelde RNA-probe die is ontworpen om complementair te zijn aan het virale genomische RNA. Plaats elk dekglas met de celzijde naar beneden op het hybridisatiemengsel op de objectglasplaat. De incubatie dient te worden uitgevoerd in een bak met 50% formamide in 2X SSPE.Meng en incubeer gedurende 16 tot 18 uur bij 42 °C. Incubeer vervolgens het dekglas met de celzijde naar beneden in 50 µL 50% fide gedurende 50 minuten bij 42 °C. Was de dekglazen twee keer in 2X SSPE door ze met de celzijde naar beneden te incuberen in 50 µL 2X SSPE gedurende telkens vijf minuten bij 42 °C.Was ten slotte de dekglasjes in 1 X DPBS gedurende één minuut. Om deze procedure te starten, worden de dekglasjes geblokkeerd door ze met de celzijde naar beneden te plaatsen in 50 µL van een 1 X Roche blokkeringsoplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Wanneer de blokkering voltooid is, wordt elk dekglasje met de celzijde naar beneden geplaatst in 50 µL van een primaire antilichaamoplossing die alle primaire antilichamen voor het experiment in de juiste concentraties bevat. Incubeer gedurende één uur bij 37 °C.Plaats het dekglas met de celzijde naar boven in een kweekschaal met DPPS en was de dekglazen gedurende 10 minuten. Pipetteer vervolgens 50 µL van de secundaire antilichaamoplossing op een objectglas voor elk dekglas. Alexa Fluor-geconjugeerde antilichamen kunnen worden gebruikt om een reeks kleuren te genereren en worden gebruikt in een verdunning van 1:500 in 1x blokkeringsoplossing en 1x DPBS. Plaats elk dekglas met de celzijde naar beneden in de secundaire antilichaamoplossing en incubeer gedurende één uur bij 37 °C.Was de dekglasjes tweemaal gedurende 10 minuten. Droog de dekglasjes in DPBS met de celzijde naar boven op een stuk blottingpapier. Zorg ervoor dat de dekglasjes worden afgedekt om blootstelling aan licht en bleken te voorkomen.Zodra alle vloeistof is verdampt, worden de dekglasjes op nieuwe objectglazen gemonteerd. Gebruik acht µL immuno mount en tik voorzichtig op het dekglasje om eventuele luchtbellen te verwijderen; breng vervolgens nagellak aan op de randen van het dekglasje om het op zijn plaats te fixeren. De visualisatie van RNA en eiwitten middels microscopische technieken is eveneens cruciaal voor het succes van deze procedure.De instellingen van de gebruikte microscoop kunnen de visualisatie bevorderen of belemmeren. Daarom is het essentieel dat de instellingen van de microscoop correct zijn ingesteld en consistent zijn tussen de verschillende monsters binnen een bepaald experiment. Een representatief resultaat van de visualisatie van viraal RNA in vissen en eiwitlokalisatie via immunofluorescentie wordt in deze figuur geïllustreerd.In dit eerste paneel, waarin HeLa-cellen zijn getransfecteerd met HIV-1, is het viraal RNA voor HIV-1 in het groen zichtbaar over het gehele cytoplasma, waarbij het grotendeels diffuus wordt weergegeven, hoewel kleine cytoplasmatische puncta niet ongebruikelijk zijn; de specificiteit kan worden vastgesteld door positieve cellen te vergelijken met omringende cellen die geen fluorescentie vertonen, zoals geïllustreerd door de zwart-wit inzetafbeelding die uitsluitend de kleuring van viraal RNA weergeeft. De rode kleuring weerspiegelt de immunofluorescentie van Ross GA PSH three domain binding protein of G3BP, dat primair het cytoplasma markeert wanneer HeLa-cellen zijn getransfecteerd met HIV-1 dat het regulatoire Rev-eiwit mist. Het geproduceerde viraal RNA blijft in de nucleus behouden.Dit kan worden gevisualiseerd als een heldergroen signaal in de nucleus en een gebrek aan RNA-fluorescentiesignaal in het cytoplasma. De distributie van het HIV-1 virale RNA kan ook worden beïnvloed door overexpressie van bepaalde cellulaire eiwitten. Bijvoorbeeld, de overexpressie van RAB7-interagerend lysosomaal eiwit (RLIP), een eiwit dat betrokken is bij het transport van endosomale blaasjes, leidt tot relocalisatie van het in het groen gemarkeerde virale genomische RNA naar het microtubulaire organisatiecentrum.Hier zijn de endosomen gelabeld met LAMP1 en rood gekleurd. In contrast hiermee zorgt overexpressie van een amino-terminaal gedeleteerde delta N, die niet in staat is om te binden aan p150Glued van het dyneïne-motorcomplex, voor verspreiding van late endosomen binnen het cytoplasma. Overexpressie van p50 dyneïne blokkeert de grote subunit van de dyneïne-motor en laat late endosomen vrij, maar ook het virale genomische RNA en HIV-V1-structurele eiwitten naar de celperiferie. Wanneer HIV-1 wordt tot expressie gebracht in HeLa-cellen en deze cellen vervolgens op verschillende tijdstippen worden verzameld en geanalyseerd, verschijnt het virale RNA al drie uur na transfectie en infectie in de cel en is dit tegen 12 uur duidelijk waarneembaar met deze FISH-techniek.Hier wordt de virale RNA-expressie in het groen gevolgd, terwijl het cellulaire eiwit H-N-R-N-P-A one in het rood is gekleurd. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze op dag één in 20 minuten en op dag twee in vier en een halve uur worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de dekglasjes voorzichtig te hanteren om breuk te voorkomen en ervoor te zorgen dat blootstelling aan licht wordt vermeden zodra het secundaire antilichaam is aangebracht. Vergeet niet dat bij het werken met HIV V one en andere pathogenen van een hoger risiconiveau de situatie uiterst gevaarlijk is vóór de fixatie; daarom moeten er bij het uitvoeren van deze procedure altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals adequate training en inperking.

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, the cells infected with MCPyV virions were subjected to in situ hybridization chain reaction to detect MCPyV specific genomes. Further, the DNA-HCR technique was combined with FISH to visualize the MCPyV DNA in infected human skin cells.

HCR-DNA FISH: A Fluorescence In Situ Hybridization Technique to Detect Viral DNA in Infected Cells

Bron: Vallery, T. K. &amp; Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (2019)Deze video demonstreert fluorescentie in situ hybridisatie om viraal RNA te visualiseren in virusgeïnfecteerde cellen. Er wordt een overzicht gegeven van de stappen die betrokken zijn bij probe-hybridisatie, signaalamplificatie en confocale beeldvorming.

Bepaling van de virale RNA-distributie in gastheercellen via fluorescentie in situ hybridisatie

This video demonstrates the application of Hybridization Chain Reaction (HCR)-Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) for visualizing the spatial distribution of SARS-CoV-2 subgenomic RNA. Combining HCR with immunofluorescence techniques has the potential to provide insights into host-virus interactions at the single-cell level.

Using Immuno-RNA Fluorescence In Situ Hybridization to Visualize SARS-CoV-2

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

We hebben een fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de detectie van een persistente DNA virusgenoom in weefselcoupes van diermodellen. Dit protocol maakt het bestuderen infectie proces codetection van het virale genoom, zijn RNA producten en virale of cellulaire eiwitten in enkele cellen.

Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een fluorescentiebeeldvormingsbenadering, multiplex immunofluorescent cell-gebaseerde detection van DNA, RNA en protein (MICDDRP), een methode die in staat is tot gelijktijdige fluorescentie eencellige visualisatie van virale eiwitten en nucleïnezuren van verschillende type en gestrandheid. Deze aanpak kan worden toegepast op een breed scala aan systemen.

Eencellige multiplexed fluorescentie beeldvorming om virale nucleïnezuren en eiwitten te visualiseren en HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika-virus en influenza-infectie te controleren

Hier beschrijven we een eenvoudige methode die RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (RNA-FISH) combineert met immunofluorescentie om ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA te visualiseren. Dit protocol kan het begrip van de moleculaire kenmerken van SARS-CoV-2 RNA-host interacties op eencellig niveau vergroten.

Visualisatie van SARS-CoV-2 met behulp van Immuno RNA-Fluorescentie In Situ Hybridisatie

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe je een sperma monster proces om goede kwaliteit te bereiken...

Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Leer virale RNA-detectie door fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) in geïnfecteerde cellen. Deze methode visualiseert RNA-lokalisatie en intracellulair virusverkeer met fluorescentiemicroscopie voor virologisch onderzoek.

Detectie van virale RNA door fluorescentie

Meer video's verkennen