Retrograde Laden van zenuwen, Tracts, en Spinal Roots met fluorescente kleurstoffen

Het algemene doel van deze procedure is om met een eenvoudige, goedkope techniek een hoge concentratie van een fluorescerende of iongevoelige kleurstof te introduceren in neuronen of in elk neuraal traject. Dit wordt bereikt door eerst twee typen pipetten te produceren, type één en type twee. Sluit vervolgens een flexibele elastomeerslang aan op de type één-pipet en oefen positieve druk uit om het doelsegment van het neurale traject in de type één-pipet op te zuigen, waarbij wordt gecontroleerd of er een goede afdichting is gevormd.

Plaats vervolgens de pipette type twee in de pipette type één en gebruik de pipette type twee om het resterende A CSF uit de pipette type één te aspireren. Voeg daarna de kleurstof toe aan de pipette type één, zonder luchtbellen te introduceren. De laatste stap is om de neuronen gedurende zes tot 20 uur in het donker te incuberen.

Uiteindelijk, na het verwijderen van de type 1 pipet, is het preparaat klaar voor in vitro, elektrofysiologische of morfologische studies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals badapplicatie, BOS-injectie en elektroporatie, is dat de D wordt afgeleverd aan een gedefinieerde neuronale populatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen, zoals de activiteit, connectiviteit, morfologie en distributie van gedefinieerde neuronen.

Over het algemeen vereist deze techniek oefening, in het bijzonder om te voorkomen dat de kleurstof wordt verdund in de type 1 pipette en dat er geen luchtbellen in terechtkomen. Begin deze procedure door de polyethyleenbuis over de vlam van een alcoholbrander te trekken om twee korte pipetten met taps toelopende punten te maken. Trek eerst een korte type 1 pipette met een kleine punt die de doelwortel of het tractum stevig kan vasthouden.

Trek vervolgens een type twee pipette met een langere, dunnere schacht en een zeer fijne tip die tot in de tip van de type één pipette kan worden ingebracht. Sluit daarna de type twee pipette aan op een EC-klem met een 19 gauge naald. Plaats vervolgens het geïsoleerde ruggenmerg in een bad.

Houd het gedurende het hele laadproces overstroomd met gekoelde A CSF. Plaats daarna de type één pipet op een電rodehouder, zodat de achteropening eenvoudig via een flexibele slang kan worden verbonden met een spuit. Trek bij deze procedure eerst CSF in de type één pipet met behulp van een spuit.

Teken vervolgens het axonale tractus of de wortel die gevuld moet worden. Verwijder daarna de flexibele slang uit de opening aan de achterzijde. Bevestig vervolgens de pipette type twee aan een andere spuit.

Voeg deze in de pipette van type één, waarin een axonaal traject of een neurale wortel onder de microscoop wordt vastgehouden. Gebruik de spuit die is bevestigd aan de pipette van type twee om A CSF te aspireren, zodat het resterende A CSF het axonale traject net bedekt. Trek vervolgens de pipette van type twee uit de pipette van type één.

Houd het niveau van A CSF enkele minuten in de gaten om te controleren of het axonale tractus of de zenuwen goed zijn afgesloten. Los daarna de kleurstof op in A CSF of 0,2% Triton X 100 in dubbel gedestilleerd water. Trek dit op in de pipette van type twee door een zwakke onderdruk uit te oefenen met de bevestigde spuit, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen worden opgezogen.

Plaats vervolgens de pipet van type twee met de kleurstof in de resterende A CSF-oplossing. Laat de kleurstof in de pipet van type een langzaam in de A CSF vrijkomen door een zachte positieve druk op de spuit uit te oefenen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd en dat het doelweefsel niet vanuit de binnenkant van de tip wordt verplaatst. Als er tijdens het injecteren van de kleurstof een luchtbel in de pipet van type een terechtkomt, zuig de bel dan weg door de tip van de pipet van type twee dicht bij de bel te brengen en vervolgens een zwakke negatieve druk uit te oefenen met de aangebrachte spuit.

Nadat er een voldoende hoeveelheid kleurstof is vrijgekomen, wordt de type twee pipette verwijderd. Incubeer het weefsel vervolgens gedurende zes tot 20 uur in het donker, afhankelijk van het type experiment. Zodra er voldoende tijd is verstreken voor de vulling, wordt de elektrode voorzichtig uit het weefsel getrokken.

Vervolgens is het weefsel gereed voor beeldvorming of histologie. Hier is een schema dat de gelijktijdige belading van drie verschillende dextranen, geconjugeerd met fluorescerende kleurstoffen, in motorneuronen, sensorische afferente neuronen en spinale interneuronen laat zien; motorneuronen en sacrale sensorische afferenten werden terugspoeld met Cascade blue Dextran en Texas red dextran via respectievelijk de ventrale en dorsale wortels. Groen fluorescerend dextran is geladen in spinale interneuronen waarvan de axonen via de ventralis funiculus opstijgen.

Hier wordt een confocale afbeelding getoond van een sectie van het sacrale ruggenmerg waarin de neuronen retrograd하게 zijn gelabeld. Merk op dat de gelabelde sensorische afferenten primair ipsilateraal zijn. Met enkele contralaterale projecties zijn de gelabelde motorneuronen ipsilateraal ten opzichte van de gevulde ventrale wortel, terwijl de gelabelde interneuronen contralateraal daartoe liggen, zoals aangegeven door de pijlpunt.

Na deze procedure kunnen aanvullende methoden worden uitgevoerd om kernvragen te beantwoorden over functionele connectiviteit, excitatoire-inhibitoire balans, sinus-type, de distributie en de neurotransmitterproductie in de neuronen van het DI-veld. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de neurofysiologie van het ruggenmerg en de hersenstam om specifieke neuronale populaties aan te tonen met behulp van iongevoelige kleurstoffen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe fluorescerende en/of iongevoelige kleurstoffen kunnen worden toegepast in neuronen en sensorische vezels in het geïsoleerde ruggenmerg.