Name: Retrograde Laden van zenuwen, Tracts, en Spinal Roots met fluorescente kleurstoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Leer een eenvoudige, kosteneffectieve techniek voor retrograde laden van fluorescente kleurstoffen in neuronen en zenuwbanen met behulp van polyethyleen pipetten. Deze methode maakt gedetailleerde visualisatie van neurale activiteit mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"&gt; Dit werk werd ondersteund door de intramurale programma van de National Institutes of Neurologische Aandoeningen en Stroke in de National Institutes of Health. Wij zouden ook graag Dr George Mentis bedanken voor zijn eerdere bijdragen aan de methode en de gegevens in figuur 3.</p

Fluorescerende dextranen zijn gebruikt als anatomische gereedschappen en voor het afbeelden van neuronale activiteit 1-4. Velden et al.., (2009) 4 publiceerde een protocol voor het toepassen van ionen-en voltage-sensitieve kleurstoffen om axonale stukken met een focus op het ruggenmerg als modelsysteem. Hier beschrijven we een meer gedetailleerde procedure voor de toepassing van TL-en / of ion-gevoelige kleurstof om de snede ventrale wortels, dorsale wortels of een neuronale kanaal van het ruggenmerg voor in-vitro optophysiological en morfologische studies. 1. Type-I en type-II pipetten Begin met het trekken van twee korte delen van polyethyleen buis (PE90, Clay Adams Brand) boven de vlam van een alcohol lamp 7 tot en met pipetten te produceren met taps toelopende tips. Een pipet (Type-I) moet kort (3-7 mm) met een kleine tip die goed kan houden het doel root of darmkanaal (Outer Diameter: 0,2-0,4 mm; Inner Diameter: 0,1-0,3 mm). Trek vervolgens een tweede pipet (Type-II) met een langere (8-12 cm) dunner, as en een zeer fijne punt (buitendiameter: 0,2-0,3 mm, binnendiameter: 0,1-0,2 mm) kan worden ingebracht in de type-I pipetteren zover haar tip. De tweede dunnere pipet wordt gebruikt om te zuigen respectievelijk invoeren kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) en kleurstof oplossing uit de Type-I pipet. 2. Positionering van Type-I Pipetteer Ontleden en te isoleren het ruggenmerg 8,9 en plaats deze in een bad, superfused met gekoeld aCSF (~ 16 ° C) gedurende het laadproces. Plaats de type-I pipet op een elektrode houder (H1/12 elektrode houder Narishige) zodat de rug openingen kunnen gemakkelijk worden aangesloten op een injectiespuit (1 ml U-100 insulinespuit, Becton Dickenson of vergelijkbare) via een flexibele slang (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002, 10 cm) (Afb.1A-B). 3. Dye toepassing <ol><li> Met behulp van de injectiespuit in de eerste tekenenaCSF in de type-I pipet (fig.1b; 2A) gevolgd door de axonale-darmkanaal of root in te vullen (fig. 2B). De flexibele slang moet dan uit de achterkant opening. De type-II pipet wordt aan een injectiespuit en opgenomen in de type-I pipetteren die het axonale tractus of wortels. Met behulp van de spuit aan de type II-pipet, zuig aCSF zodat de resterende aCSF alleen de axonale-darmkanaal (fig.1c; 2C-D) bedekt. Dan trekt de type II-pipet uit het type-I pipet. Controleer de aCSF niveau voor een paar minuten om een ​​goede afdichting te controleren op de axonale-darmkanaal of de zenuwen (zie hoofdstuk 3 in Problemen oplossen voor &quot;goede afsluiting&quot;). </li><li> Los de kleurstof in aCSF of 0,2% Triton X-100 in dubbel gedistilleerd water en trek het in de type-II-pipet met aandacht niet om luchtbellen te nemen. Plaats de type-II pipet met de kleurstof in de type-I pipet in de residuale aCSF oplossing (Fig. 2E). Langzaam vrijde kleurstof in de aCSF met zachte overdruk (fig. 2F). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in te voeren of verplaatsing van het te onderzoeken weefsel van binnen de tip veroorzaken. Trek de type II-pipet na voldoende hoeveelheid kleurstof is vrijgegeven (3-5 ul van kleurstof oplossing). </li></ol> 4. Incubatie Incubeer het weefsel in het donker van 6 tot 20 uur, afhankelijk van het type experiment. Zodra voldoende tijd is gegeven voor het vullen trek weg elektrode van het weefsel waarbij de weefsel gereed voor beeldvorming of histologie. Problemen oplossen <ol><li> Wanneer het doel weefsel niet gemakkelijk gaan de punt van het type I pipet of los binnen komt dan de tip diameter de verkeerde maat. Als dit gebeurt, trekken en een andere pipet. </li><li> Voor het toevoegen van de kleurstof aan de aCSF in het type-I pipet, zorg ervoor dat er genoeg aCSF zo blijft dat het kan worden bereikt met deType-II pipetpunt (fig. 2D). Anders een luchtspleet aanwezig als de kleurstof toegevoegd. Als dit gebeurt, niet voeg de kleurstof en verwijder de axonale-darmkanaal van de pipet en plaats deze terug in met voldoende aCSF te bereiken door de Type-II-pipet. </li><li> Als de aCSF niveau in de type-I pipet neemt toe nadat het werd opgezogen met de type-II-pipet, betekent dit dat de afdichting met het weefsel niet goed is. Gebruik een andere elektrode, anders wordt de kleurstof worden verdund tijdens de benoemingsprocedure. </li><li> Als er een luchtbel wordt in de type-I pipet, terwijl het injecteren van de kleurstof, weglopen de bel door het bevorderen van de type-II-pipetpunt in de buurt van de bel en voorzichtig aanbrengen van een zwakke negatieve druk met behulp van de bijgevoegde spuit. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Als u een toepassing van de methode te illustreren, hebben we tegelijkertijd geladen motoneuronen, sensorische afferenten en spinale interneuronen met drie verschillende DEXTrende-geconjugeerd fluorescerende kleurstoffen (Fig. 3A). Zoals getoond in Fig. 3B, drie klassen van het neuron zijn gelabeld; sensorische afferenten (rood), interneuronen projecteren in het ventrale funiculus (groen) en motoneuronen (blauw). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave Pipetteer Type-I en Type-II-montage. (A) Type-I pipet (lichtblauw) wordt geplaatst op een elektrodehouder zodat rug openingen kunnen gemakkelijk worden verbonden met de flexibele elastomeer buis (B) en waarin een type-II pipet kan ingevoegd (C) worden. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische weergave het laadproces van motorneuronen met fluorescerende kleurstoffen. (A) Een type-I pipet wordt geplaatst in de buurt van de ventrale wortel in te vullen. (B) zuignap wordt toegevoerd aan de pipet aCSF trekken in de pipet gevolgd door de wortel. (C-D) Ontkoppel de flexibele elastomeer slang van de backend van Type-I pipet en vermindering van de hoeveelheid aCSF door te zuigen aan de Type-II-pipet. (E) Steek de punt van de type-II-pipet met de opgeloste kleurstof in de resterende aCSF in de type-I pipet. (EF) Langzaam vullen de type-I pipet met de kleurstof en verwijder dan de Type-II-pipet. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" /> Figuur 3. Toepassing van het vullen van de geïsoleerde muis ruggenmerg. (A) met hierin de drie type-I pipetten gebruikt om verschillende neuronale klassen te vullen in het ruggenmerg. Motoneuronen (blauw; Cascade Blue dextran) en sacrale sensorische afferenten (rood, Texas-Rood dextran) werden opgevuld door de ventrale en dorsale wortels, respectievelijk. Fluoresceïne dextran werd gebruikt om de spinale interneuronen (groen), waarvan de axonen stijgen door de ventrale funiculus (VF) te laden. 1 mg per dextran kleurstof (10.000 MW, Molecular Probes)werd opgelost in 6 ul gedistilleerd water dat 0,2% Triton X-100 (B). Confocaal beeld van een gedeelte van het koord sacrale een ruggenmerg waarbij de neuronen werden back-gelabeld zoals beschreven in A. Merk op dat de gelabelde sensorische afferente hoofdzakelijk ipsilaterale met enkele contralaterale uitsteeksels. De gelabelde motoneuronen zijn ipsilaterale de gevulde ventrale wortel dat de gelabelde interneuronen contralateraal aan de zijkant van de vulling (pijlpunt). Kalibratie bar 200 micrometer.

<ol><li>Nance, D. M., Burns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextrans+as+sensitive+anterograde+neuroanatomical+tracers%3A+applications+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls.</a> Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).</li>
<li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextran-amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li>
<li>McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+neuronal+activity+in+tissue+labeled+by+retrograde+transport+of+Calcium+Green+Dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran.</a> Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).</li>
<li>Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+nervous+system+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging nervous system activity.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3(2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+neurons+retrogradely+and+anterogradely+labelled+with+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes.</a> J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).</li>
<li>Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+recording+using+retrogradely+transported+dye+in+the+chicken+spinal+cord%3A+staining+and+signal+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).</li>
<li>Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Cord+Electrophysiology+II%3A+Extracellular+Suction+Electrode+Fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication.</a> J. Vis. Exp. (48), e2580(2011).</li>
<li>Smith, J. C., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+brainstem-spinal+cord+preparations+for+study+of+motor+systems+for+mammalian+respiration+and+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion.</a> J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Cord+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal Cord Electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (35), e1660(2010).</li>
<li>Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+reduced+sensorimotor+connections+form+with+normal+specificity+despite+abnormal+muscle+spindle+development%3A+the+role+of+spindle-derived+neurotrophin+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3.</a> J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).</li>
<li>Mentis, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+functional+impairment+of+sensory-motor+connectivity+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neuron. 69, 453-467 (2011).</li>
<li>Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+sacral+neurons+involved+in+activation+of+the+lumbar+central+pattern+generator+for+locomotion+in+the+neonatal+rodent+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Soc.+Neurosci.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord.</a> Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+spatiotemporal+organization+of+neural+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord.</a> Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).</li>
<li>Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+patterns+of+vestibular-mediated+synaptic+inputs+to+axial+and+limb+motoneurons+in+the+neonatal+mouse+assessed+by+optical+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording.</a> J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).</li>
<li>Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+functional+synaptic+connections+between+medullary+reticulospinal+neurons+and+lumbar+descending+commissural+interneurons+in+the+neonatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse.</a> J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Wij hebben niets te onthullen.</p

<p class="jove_content"&gt; We beschrijven hier een eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor de invoering van kleurstoffen in de neuronen, de zenuwen en spinale traktaten. Deze methode omvat het blootstellen geïdentificeerd anatomische trajecten een zeer geconcentreerde kleurstof oplossing voor de duur van het laden. Dit resulteert in een retrograde etikettering van de target site met weinig achtergrond in vergelijking met micro-injecties, bad toepassing en elektroporatie technieken. Echter, de werkwijze beperkt tot sites in het zenuwstelse...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td colspan="2"<strong&gt; Materiaalnaam</strong</td&gt;<td<strong&gt; Bedrijf</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogus nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commentaar</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="2"&gt; Slangen</td&gt;<td&gt; PE90 (IDxOD: 0,034 &quot;x0.050&quot;; muur Thikness: 0.008 &quot;)</td&gt;<td&gt; Clay Adams Brand Intermedic</td&gt;<td&gt; 427.421</td&gt;<td&gt; Voor type I en type II pipetten</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NSF-51 (IDxOD: 1/16x1/8; muur Thikness: 1/32)</td&gt;<td&gt; PharMed BPT, Cole-Parmer</td&gt;<td&gt; AY242002</td&gt;<td&gt; Voor Flexibele buis</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Spuit</td&gt;<td&gt; 1 ml insuline spuit U-100</td&gt;<td&gt; Becton Dickenson</td&gt;<td&gt; 329.650</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Naald</td&gt;<td&gt; 19G x1-1/2 &quot;Metal Hub Naald</td&gt;<td&gt; MONOJECT</td&gt;<td&gt; 200.136</td&gt;<td&gt; Aansluiten van Type II pipet op de spuit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Alcohol Lamp</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Afsluitkraan</td&gt;<td&gt; Drie-wegkraan met mannelijke Luer Slip-adapter</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corp</td&gt;<td&gt; 2C6241</td&gt;<td&gt; Gebruik met spuit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="3"&gt; Houder</td&gt;<td&gt; H-1 elektrodehouder</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; H-1/12</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Magnet stand</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; GJ-8</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Micromanipulator</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; M-3333</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pincet</td&gt;<td&gt; W &amp; T-DUMONT Zwitserse 00632-11</td&gt;<td&gt; DUMONT</td&gt;<td&gt; JF-5 TC</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"&gt; * Dat zijn voorgestelde materialen. Kan worden vervangen door elke compatibele producten</p

retrograde laden van zenuwen, tracts, en spinal roots met fluorescente kleurstoffen

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Retrograde etikettering van neuronen is een standaard anatomische methode 1,2 die ook is gebruikt om calcium-en voltage-sensitieve kleurstoffen te laden in neuronen 3-6. Over het algemeen worden de kleurstoffen toegepast als vaste kristallen, of door lokale druk injectie met glazen pipetten. Dit kan echter leiden tot een verdunning van de kleurstof en een verminderde intensiteit van de etikettering, in het bijzonder wanneer meerdere uren nodig zijn voor kleurstofdiffusie. Hier tonen een eenvoudige en goedkope methode voor het inbrengen fluorescentie en ion-gevoelige kleurstoffen in neuronen met een polyethyleen zuig pipet gevuld met de kleurstofoplossing. Deze methode biedt een betrouwbare wijze voor handhaving van een hoge concentratie van de kleurstof in contact met axons gedurende het laden.

Wij beschrijven een eenvoudige en goedkope methode voor het inbrengen hoge concentratie van fluorescerende en calcium-gevoelige kleurstoffen in neuronen of neuronale kanaal met een polyethyleen zuig pipet.

Retrograde Laden van zenuwen, Tracts, en Spinal Roots met fluorescente kleurstoffen

Retrograde labeling van neuronen is een standaard anatomische methode1,2 die ook is gebruikt om calcium- en spanningsgevoelige kleurstoffen in neuronen te laden3-6. ...

Het algemene doel van deze procedure is om met een eenvoudige, goedkope techniek een hoge concentratie fluorescerende of iongevoelige kleurstof in neuronen of elk neuraal traject te introduceren. Dit wordt bereikt door eerst twee typen pipetten te produceren, type één en type twee. Sluit vervolgens een flexibele elastomeerslang aan op de type één pipet en breng positieve druk aan om het doelspecifieke neurale traject in de type één pipet op te zuigen, waarbij wordt gecontroleerd of er een goede afdichting is gemaakt.Plaats vervolgens de type twee pipet in de type één pipet en gebruik de type twee pipet om het resterende A CSF uit de type één pipet te aspireren. Voeg daarna de kleurstof toe aan de type één pipet, waarbij geen luchtbellen mogen worden geïntroduceerd. De laatste stap is om de neuronen gedurende zes tot 20 uur in het donker te incuberen.Uiteindelijk, na het verwijderen van de type één pipet, is de preparaat klaar voor in vitro, elektrofysiologisch of morfologisch onderzoek. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals badapplicatie, BOS-injectie en elektroporatie, is dat de D wordt afgeleverd aan een gedefinieerde neuronale populatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de neurowetenschappen, zoals de activiteit, connectiviteit, morfologie en distributie van gedefinieerde neuronen.Over het algemeen vereist de techniek oefening, met name om ervoor te zorgen dat de kleurstof niet wordt verdund in de type 1-pipet en dat er geen luchtbellen in worden geïntroduceerd. Begin deze procedure door de polyethyleenslang over de vlam van een alcoholbrander te trekken om twee korte pipetten met taps toelopende punten te maken. Trek eerst een korte type 1-pipet met een kleine punt die de doelwortel of het tractum stevig kan vasthouden.Trek vervolgens een pipette van type twee met een langere, dunnere schacht en een zeer fijne punt die tot aan de punt in de pipette van type one kan worden ingebracht. Sluit daarna de pipette van type twee aan op een EC-geclippte naald van 19 gauge. Plaats vervolgens het geïsoleerde ruggenmerg in een bad.Houd het gedurende het hele laadproces overgoten met gekoelde A CSF. Plaats daarna de type één pipet op een elektrodehouder, zodat de achteropening eenvoudig via een flexibele slang kan worden verbonden met een spuit. Trek in deze procedure eerst met een spuit CSF in de type één pipet.Teken vervolgens het axonale tractus of de wortel die gevuld moet worden. Verwijder daarna de flexibele slang uit de achteropening. Bevestig vervolgens de pipet type twee aan een andere spuit.Voeg deze toe aan de pipette van type één, waarin een axonaal tractaat of een neurale wortel onder de microscoop wordt vastgehouden. Gebruik de spuit die is bevestigd aan de pipette van type twee om A CSF te aspireren, zodat het resterende A CSF het axonale tractaat net bedekt. Trek vervolgens de pipette van type twee uit de pipette van type één.Monitor het A CSF-niveau gedurende enkele minuten om te controleren of het axonale tractus of de zenuwen goed zijn afgedicht. Los daarna de kleurstof op in A CSF of 0,2% Triton X 100 in dubbel gedestilleerd water. Trek dit op in de pipette van type twee door een zwakke onderdruk uit te oefenen met de bevestigde spuit, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen worden opgezogen.Plaats vervolgens de pipet van type twee met de kleurstof in de resterende A CSF-oplossing. Laat de kleurstof in de pipet van type één langzaam in de A CSF vrij door een zachte positieve druk op de spuit uit te oefenen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd en dat het doelweefsel niet vanuit de binnenkant van de tip wordt verplaatst. Als er tijdens het injecteren van de kleurstof een luchtbel in de pipet van type één terechtkomt, trek deze bel er dan uit door de tip van de pipet van type twee dicht bij de bel te brengen en vervolgens een zwakke negatieve druk uit te oefenen met de bevestigde spuit.Nadat er voldoende kleurstof is vrijgekomen, wordt de type twee pipet verwijderd. Incubeer het weefsel vervolgens zes tot 20 uur in het donker, afhankelijk van het type experiment. Zodra er voldoende tijd is verstreken voor de vulling, wordt de elektrode voorzichtig uit het weefsel getrokken.Vervolgens is het weefsel klaar voor beeldvorming of histologie. Hier is een schematisch diagram dat de gelijktijdige belading van drie verschillende geconjugeerde fluorescente dextraankleurstoffen in motorische neuronen, sensorische afferente neuronen en spinale interneuronen laat zien; motorische neuronen en sacrale sensorische afferente neuronen werden respectievelijk via de ventrale en dorsale wortels teruggevuld met Cascade blue dextraan en Texas red dextraan. Groen fluorescent dextraan is geladen in spinale interneuronen waarvan de axonen door de ventralis funiculus opstijgen.Hier is een confocale afbeelding getoond van een doorsnede van het sacrale ruggenmerg waarin de neuronen retrospectief zijn gelabeld. Merk op dat de gelabelde sensorische afferenten primair ipsilateraal zijn. Op enkele contralaterale projecties na, bevinden de gelabelde motorneuronen zich ipsilateraal ten opzichte van de gevulde ventrale wortel, terwijl de gelabelde interneuronen zich contralateraal daartoe bevinden, zoals aangegeven door de pijlpunt.Na deze procedure kunnen aanvullende methoden worden uitgevoerd om kernvragen te beantwoorden over zaken als functionele connectiviteit, excitatoire inhibitie, sinus type, de distributie en de productie van neurotransmitters in de neuronen van het DI-veld. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de neurofysiologie van het ruggenmerg en de hersenstam om specifieke neuronale populaties te markeren met behulp van iongevoelige kleurstoffen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe fluorescerende en/of iongevoelige kleurstoffen moeten worden toegepast in neuronen en sensorische vezels in het geïsoleerde ruggenmerg.

retrograde-loading-nerves-tracts-spinal-roots-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Calcium is een alomtegenwoordige boodschapper in het zenuwstelsel, essentieel voor het activeren van vrijkomen van neurotransmitters en veranderingen in de synaptische sterkte. Hier laten we zien een techniek voor het laden van Ca 2 +-indicatoren in Drosophila zenuwuiteinden. We tonen ook aan de fabricage van de benodigde apparatuur en benadrukken punten van cruciaal belang voor het succes van de techniek is.

Het laden van Drosophila zenuwuiteinden met Calcium-indicatoren

We structurele kenmerken van de Glia-neuromusculaire synapsen beschreven in een roman Inside-out het prepareren van weefsels van levende larven gebruik van fluorescerende kleurstoffen met confocale microscopie. We leven zenuwuiteinden gelabeld met fluorescente primaire antilichamen tegen HRP, en ook gevisualiseerd het perisynaptic ruimte met fluorescerende dextranen.

Het visualiseren van de Live- Drosophila Gliale-neuromusculaire Junction met fluorescente kleurstoffen

Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy

Retrograde transport van fluorescente kleurstof labelt een sub-populatie van neuronen op basis van anatomische projectie. Gelabelde axons kunnen visueel worden...

Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen<em&gt; In vivo</em

Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the method of retrograde labeling of Drosophila motor neurons using lipophilic dyes. The dye enters the axon, travels retrogradely, and labels the neurons green, allowing detailed visualization of their morphology and projections under a confocal microscope.

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes

Source: Wang, J., et al. Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing. J. Vis. Exp. (2021). This video demonstrates a method to trace the origins of sensory neurons in the dura mater using fluorescence microscopy. A retrograde tracer is introduced into the exposed dura mater of an anesthetized rat. The tracer is taken up by sensory neuronal axons and travels retrogradely to their cell bodies...

Investigating the Origins of Sensory Neurons in the Dura Mater Using Fluorescence Microscopy

We presenteren een protocol dat gebruikmaakt van twee-foton excitatie time-lapse microscopie om gelijktijdig de dynamica van axon- en myeline-verwondingen in real time te visualiseren. Dit voorgestelde protocol maakt studies mogelijk van zowel intrinsieke als extrinsieke factoren die het lot van centrale gemyeliniseerde axonen na verwonding kunnen beïnvloeden en kunnen bijdragen aan permanente klinische handicaps.

Een Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

We beschrijven een techniek voor neuronen en hun processen label via anterograde of retrograde tracer injecties in de hersenen kernen met een in vitro bereiding. We pasten een bestaande methode i n vitro tracer elektroporatie door gebruik te maken van fluorescent gelabelde muis mutanten en eenvoudige optische apparatuur om de nauwkeurigheid etikettering te verhogen.

Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

Hier beschrijven we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp in de zenuwuitgangen. We presenteren ook een protocol voor de opname en analyse van snelle calcium transiënten in de perifere zenuw eind.

Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

We beschrijven fluorescentiefotoactivatiemethoden om het axonale transport van neurofilamenten te analyseren in enkele gedeinlineerde axonen van perifere zenuwen van transgene muizen die een fotoactief neurofilament-eiwit uitdrukken.

Beeldvorming en analyse van neurofilament transport in accijnzen muis tibial zenuw

Leer een eenvoudige, kosteneffectieve techniek voor retrograde laden van fluorescente kleurstoffen in neuronen en zenuwbanen met behulp van polyethyleen pipetten. Deze methode maakt gedetailleerde visualisatie van neurale activiteit mogelijk.

Retrograde Laden van zenuwen, Tracts, en Spinal Roots met fluorescente kleurstoffen

Meer video's verkennen