Analyse van de pulmonale dendritische cel maturatie en migratie tijdens de allergische luchtwegontsteking

Het doel van deze procedure is om de rijping en migratie van pulmonale dendritische cellen (DC) te beoordelen tijdens het verloop van door Val Boomin geïnduceerde allergische luchtwegontsteking bij muizen. Dit wordt bereikt door de muizen eerst te sensibiliseren met Val Boomin, gevolgd door een challenge van de luchtwegen met fitsy-gelabeld Val Boomin. Vervolgens worden de long en de mediastinale lymfeklieren geoogst.

Ten slotte wordt er een cellusie gemaakt van de long- en lymfeknktweefsels. Uiteindelijk kunnen de rijpingsstatus en het absolute celgetal van de pulmonale dendritische cellen in de mediastinale lymfeknoop na FITC Val Boomin-challenge worden bepaald via flowcytometrische analyse. Deze methode kan ons helpen bij het beantwoorden van kernvragen over pulmonale immuunresponsen, zoals of dendritische cellen rijpen bij blootstelling aan antigenen en of zij migreren naar de drainerende lymfeknopen.

En indien zij migreren, wat dan de migratiesnelheid is. Begin met het druppelsgewijs toevoegen van vers bereide Val Boomin-oplossing in een verhouding van één-op-één aan een buisje alum onder vortexen. Roer het mengsel 30 minuten en vul vervolgens een injectiespuit van 1 milliliter met 0,2 milliliters van het mengsel.

Pak de te injecteren muis met de duim en wijsvinger van één hand vast bij de nekvel, vlakbij de basis van de schedel. Injecteer vervolgens met de andere hand de Val Boomin alum-oplossing in de peritoneale holte van de muis. Zeven dagen na de tweede injectie van Val in alum houdt u een geanestheseerd, met val in alum gesensitiseerd dier in een rechtopstaande positie en pipetteert u vervolgens met steriele pipetpunten 100 µL van een vers bereide val in fxi-oplossing druppelsgewijs op de NAS van de muis.

Begin met het bevestigen van een 20 gauge katheter aan een spuit van één milliliter. Open vervolgens, na bevestiging van de euthanasie van de muis, de borstholte van het dier tot aan de nek om de trachea van de muis bloot te leggen en te canuleren. Het is absoluut essentieel om de longen te spoelen en het hart te perfunderen om er zeker van te zijn dat alle contaminerende alveolaire macrofagen en mononucleaire cellen die in het perifere bloed aanwezig zijn, zijn verwijderd.

Zorg ervoor dat u de volgende twee stappen zorgvuldig uitvoert en uiteraard met een vaste hand. Dien nu drie keer ijskoude PBS met EDTA toe via de katheter om de onderste luchtwegen te spoelen en cellen uit de alveolaire ruimtes te verwijderen. Perfuseer vervolgens de longen met 10 milliliter PBS met heparine via de rechter ventrikel van het hart, met behulp van een spuit van 10 milliliter voorzien van een 20 gauge naald.

Het verwijderen van alle resterende bloedcellen uit de longvasculatuur wordt als voltooid beschouwd wanneer de longen wit worden. Verwijder vervolgens de mediastinale lymfeklieren en plaats deze in een apart schaaltje. Voorkom quenching van het fluorescente signaal door de blootstelling van het weefsel aan licht te minimaliseren.

Dissekeer vervolgens de geperfuseerde longen en plaats deze in een Petrischaal; hak de longen met een schaar fijn. Verteer daarna het longweefsel bij 37 °C in 250 units per milliliter collagenase D. Voeg na 25 minuten incubatie EDTA toe aan het mengsel gedurende vijf minuten om de collagenase-activiteit te stoppen. Filter tot slot de fragmenten van de verteerde longen door een 100 micron cell strainer en lyseer de erytrocyten met hypotone buffer.

Scheid de mediastinale lymfeklieren met fijne naalden en verteer deze met collagenase, zoals zojuist gedemonstreerd voor de longen, gevolgd door het zeven van het weefsel door een celzeef na intraperitoneale sensibilisatie en uitdaging van de luchtwegen. De aanwezigheid van ontstekingscellen kan worden geëvalueerd via hematoxyline- en eosinekleuring in representatieve longcoupes van de controlegroep.

Bij met zoutoplossing behandelde dieren zijn de weefsels vrij van ontsteking, zoals aangetoond in de bovenste afbeelding. In contrast hiermee zijn ontstekingscellen wijdverspreid in de longcoupes van Val bij gesensitiseerde en uitgedaagde dieren, zoals te zien is in de onderste afbeelding. Periodaat-Schiff-kleuring kan worden gebruikt om de mucusproductie te beoordelen, zoals getoond in deze onderste afbeelding.

De inductie van allergische luchtwegontsteking na uitdaging met val in gesensitiseerde muizen wordt bevestigd door de aanwezigheid van slijm. Omgekeerd wordt een volledige afwezigheid van slijmproductie vertoond door de met zoutoplossing behandelde controlemuizen, zoals aangetoond in de bovenste afbeelding; na uitdaging met val ondergaan pulmonale dc's rijping en daaropvolgende migratie naar de drainerende lymfeklieren.

Hier toont een representatieve analyse van mediastinale lymfeklieren van muizen aan dat een bescheiden maar consistente toename in het aandeel CD 11 C-positieve cellen wordt gedetecteerd in dieren die zijn gesensitiseerd en uitgedaagd met Val Boomin, vergeleken met met saline behandelde muizen. Bovendien laat analyse van het absolute celgetal van CD 11 C-positieve CD 11 B-positieve Val Boomin fits C-positieve cellen uit de mediastinale lymfeklieren van Val in gesensitiseerde en uitgedaagde muizen zien dat er een meervoudige toename in het aantal DC's optreedt in uitgedaagde muizen vergeleken met met saline behandelde dieren. Na het bekijken van deze video zouden we een zeer goed begrip moeten hebben van onze techniek voor het analyseren van de rijping en migratie van pulmonale dendritische cellen.

Zodra u deze techniek volledig beheerst, kunt u deze aanpassen om de respons van pulmonale dendritische cellen op andere pathogenen alsmede andere experimentele factoren te beoordelen.