Analyse van de pulmonale dendritische cel maturatie en migratie tijdens de allergische luchtwegontsteking
July 23rd, 2012
We beschrijven een strategie om de rijping en migratie van pulmonale dendritische cellen te volgen in reactie op ovalbumine in de setting van ovalbumine geïnduceerde allergische luchtwegontsteking. Deze strategie kan worden aangepast aan de migratie van pulmonale dendritische cellen te beoordelen in de instellingen van de infectie.
Het doel van deze procedure is om de rijping en migratie van pulmonaire dendritische cellen of DC te beoordelen tijdens het beloop van door Val Boomin geïnduceerde allergische luchtwegontsteking bij muizen. Dit wordt bereikt door eerst de muizen te sensibiliseren met Val Boomin, gevolgd door een luchtweguitdaging met fitsy-gelabelde Val Boomin. Vervolgens worden de longen en de mediastinale lymfeklieren geoogst.
Ten slotte wordt een enkele celsuspensie bereid uit de long- en lymfeklierweefsels. Uiteindelijk kunnen de rijpingsstatus en het absolute aantal cellen van de Pullman-gelezen dendritische cellen die in de mediastinale lymfeklier worden aangetroffen na FITC Val Boomin-uitdaging worden beoordeeld door middel van flowcytometrische analyse. Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over pulmonaire immuunresponsen, zoals of dendritische cellen rijpen, afnemende antigeenblootstelling ondergaan en of ze migreren naar de beoordelingslymfeklieren.
En als ze dat doen, wat dan de snelheid van migratie is. Begin door vers bereide Val Boomin-oplossing druppelsgewijs toe te voegen in een buis met alum met een een-op-een verhouding tijdens het vortexen. Roer het mengsel gedurende 30 minuten en vul vervolgens een enkele milliliter spuit met 0,2 milliliter van het mengsel.
Gebruik de duim op de wijsvinger van de ene hand om de muis die moet worden geïnjecteerd vast te grijpen door het stuk van de nek dicht bij de basis van de schedel. Injecteer vervolgens de Val Boomin-alum-oplossing in de buikholte van de muis met de andere hand. Zeven dagen na de tweede injectie van Val in alum, houd een geanesthetiseerd val in alum gesensibiliseerd dier in een rechtopstaande positie en gebruik vervolgens steriele pipettentips om 100 microliter en vers bereide val in fxi-oplossing druppelsgewijs op het NAS van de muis te pipetten.
Begin door een 20 gauge katheter aan te sluiten op een milliliter spuit. Bevestig vervolgens na het bevestigen van de euthanasie van de muis, de borstholte van het dier helemaal open tot aan de nek om de luchtpijp van de muis te ontbloten en te canuleren. Het is absoluut van cruciaal belang om de longen te lavageren en het hart te profusen om er zeker van te zijn dat alle verontreinigende alveolaire macrofagen en mononucleaire cellen die aanwezig zijn in het perifere bloed zijn verwijderd.
En zorg ervoor dat u deze volgende twee stappen zorgvuldig en natuurlijk, met een vaste hand, uitvoert. Nu dient u ijskoud PBS met EDTA driemaal door de katheter toe te dienen om de lagere luchtwegen te spoelen en cellen uit de alveolaire ruimten te verwijderen. Spuit vervolgens de longen met 10 milliliter PBS met heparine via de rechterventrikel van het hart, nadat u een 10 milliliter spuit hebt voorzien van een 20 gauge naald.
Het verwijderen van alle resterende bloedcellen uit het longvaatbed wordt als voltooid beschouwd wanneer de longen wit worden. Vervolgens verwijdert u de mediastinale lymfeklieren en plaatst u ze in een aparte schaal. Voorkom fit se-quenching door de lichtblootstelling van het weefsel te minimaliseren.
Dissecteer vervolgens de geperfuseerde longen en plaats ze in een petrischaal. Snijd de longen met schaar in stukken. Vervolgens verteer je het longweefsel bij 37 graden Celsius in 250 eenheden per milliliter collageenase D. Voeg na 25 minuten incubatie EDTA toe aan het mengsel gedurende vijf minuten om de collageenase-activiteit te stoppen. Ten slotte passeer je de fragmenten van verteerde longen door een 100 micron celzeef en scheid je de erytrocyten met hypotone buffer.
Trek de mediastinale lymfeklieren uit elkaar met behulp van fijne naalden en verteer ze met collageenase zoals net voor de longen is aangetoond, gevolgd door het sifonen van het weefsel door een celzeef na intraperitoneale, sensibilisatie en luchtweg. Val in uitdaging. De aanwezigheid van ontstekingscellen kan worden geëvalueerd door hemat, toine en eosinekleuring in representatieve longsecties van controle.
Dieren behandeld met zoutoplossing, de weefsels zijn ontdaan van ontsteking zoals gedemonstreerd door de bovenste afbeelding. In tegenstelling daarmee zijn ontstekingscellen overal aanwezig in de longsecties van Val in gesensibiliseerde en uitgedaagde dieren, zoals te zien is in de onderste. Grafische periodieke zuurverschuivingskleurstof kan worden gebruikt om de productie van slijm te beoordelen zoals getoond in deze onderste afbeelding.
De inductie van allergische luchtwegontsteking na val in-uitdaging in Val in gesensibiliseerde muizen wordt bevestigd door de aanwezigheid van slijm. Omgekeerd wordt een volledige afwezigheid van slijmproductie getoond door controle. Met zoutoplossing behandelde muizen zoals gedemonstreerd in de bovenste afbeelding na val in-uitdaging ondergaan pulmonaire dc's rijping en daaropvolgende migratie naar de drainerende lymfeklieren.
Hier toont een representatieve analyse van muis mediastinale lymfeklieren dat een bescheiden maar consistente toename in het aandeel van CD 11 C-positieve cellen wordt gedetecteerd in dier gesensibiliseerd en uitgedaagd met Val Boomin in vergelijking met met zoutoplossing behandelde muizen. Bovendien toont de analyse van het absolute aantal CD 11 C-positieve CD 11 B-positieve Val Boomin fits C-positieve cellen uit de mediastinale lymfeklieren van Val in gesensibiliseerde en uitgedaagde muizen dat er een meervoudige toename in DC-getallen optreedt bij uitgedaagde muizen in vergelijking met met zoutoplossing behandelde dieren. Na het bekijken van deze video, zouden we een heel goed begrip moeten hebben van onze techniek voor het analyseren van pulmonaire dendritische celrijping en migratie.
En als je deze techniek echt begrijpt, kun je doorgaan met het aanpassen ervan om pulmonaire dendritische celresponsen op andere pathogenen en andere experimentele factoren te beoordelen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie beschrijft een methode om de rijping en migratie van pulmonaire dendritische cellen te evalueren als reactie op ovalbumine tijdens allergische luchtwegontsteking. De aanpak kan worden aangepast voor het onderzoeken van het gedrag van dendritische cellen in verschillende infectiecontexten.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Allergieonderzoek
- Celbiologie
Achtergrond
- Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de immuunrespons.
- Het begrijpen van hun migratie en rijping is van vitaal belang voor allergieonderzoek.
- Ovalbumine wordt vaak gebruikt om allergische reacties in experimentele modellen te induceren.
- Deze studie richt zich op de pulmonaire immuunrespons bij muizen.
Doel van het onderzoek
- Om de rijpingsstatus van pulmonaire dendritische cellen te beoordelen.
- Om de migratie van deze cellen naar lymfeklieren tijdens allergische ontsteking te evalueren.
- Om inzicht te geven in de dynamiek van dendritische celreacties op allergenen.
Gebruikte methoden
- Muizen worden gesensibiliseerd met ovalbumine.
- Luchtweguitdaging wordt uitgevoerd met FITC-gelabeld ovalbumine.
- Long- en mediastinale lymfeklieren worden na de uitdaging geoogst.
- Flowcytometrische analyse wordt uitgevoerd op suspensies van enkele cellen.
Belangrijkste resultaten
- Beoordeling van de rijpingsstatus van dendritische cellen wordt bereikt.
- Migratiepatronen van dendritische cellen naar lymfeklieren worden geanalyseerd.
- Belangrijke vragen over immuunreacties worden beantwoord.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van allergische luchtwegontsteking.
Conclusies
- De methode volgt effectief het gedrag van dendritische cellen bij allergische reacties.
- De verkregen inzichten kunnen therapeutische strategieën voor allergieën informeren.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot onderzoek naar infectieziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding dendritic cell maturation and migration is critical for de-risking target validation in immunology-driven drug discovery. This method provides quantitative, flow cytometry-based readouts that enable mechanistic insight into allergic airway inflammation models. It supports predictive confidence in early discovery by linking antigen exposure to immune cell dynamics relevant to asthma and allergy therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic cell activation pathways in response to antigen exposure.
- Operational Value: Provides standardized metrics for assessing immune cell maturation and migration kinetics.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of therapeutic targets involved in dendritic cell-mediated immune responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative data on dendritic cell phenotypes using defined markers.
- Operational Value: Establishes a transferable assay platform for monitoring immune cell trafficking in lung tissue models.
- Assay Readiness: Outputs are compatible with high-content analysis and cross-lab standardization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects innate immune activation to adaptive response initiation in a disease-relevant system.
- Operational Value: Facilitates longitudinal tracking of immune responses from sensitization to challenge phases.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned assessment of dendritic cell function in preclinical allergy models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the immunology discovery continuum, supporting early target validation through to preclinical mechanistic de-risking in allergy and asthma research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of antigen-specific dendritic cell responses and pathway modulation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative readouts for immune cell maturation and migration under controlled conditions.
- Analytics: Enables statistical comparison of dendritic cell frequencies and activation states across experimental groups.
- Translational Research: Links cellular immune dynamics to downstream T cell activation and inflammatory outcomes in lung tissue.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple allergens, pathogens, or immunomodulatory compounds in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in immune-mediated disease models through direct visualization of dendritic cell behavior.
- Operational Value: Promotes assay reproducibility and cross-functional alignment between immunology and pharmacology teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early immunological readouts linked to clinical phenotypes like airway inflammation and mucus production.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their effects on dendritic cell maturation and migration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine immunology, tissue harvesting, and flow cytometry panel design.
- Dependent on access to collagenase digestion systems, cell strainers, and fluorescence-activated cell sorting equipment.
- Necessitates standardization of antigen sensitization and challenge protocols across laboratories.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of tissue digestion and marker panels.
- Light sensitivity of FITC-labeled antigen necessitates careful sample handling to prevent signal quenching.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Sensitizing and Intranasal Challenge of Mice with Ovalbumin
2:39
Preparation of Single-cell Suspension from the Lungs and the Draining Lymph Nodes
5:37
Results: OVA Sensitization and Challenge Induces an Increase in CD11c+ Cell Trafficking to Murine Mediastinal Lymph Nodes
7:33
Conclusion
