Planarian Immobilisatie, Gedeeltelijke Bestraling en weefseltransplantatie

Het algemene doel van het volgende experiment is om een populatie van gezonde stamcellen naast weefsel met uitgeschakelde stamcellen binnen een parian te plaatsen om het gedrag van stamcellen en hun nakomelingen in vivo tijdens regeneratie te analyseren. Dit wordt bereikt door het verdoven en immobiliseren van een niet-bestraalde of een bladvormig bestraalde parian voor verdere manipulatie. Vervolgens wordt de geïmmobiliseerde niet-bestraalde parian gedeeltelijk afgeschermd met lood en vervolgens met röntgenstralen bestraald, wat resulteert in een ongedeerd parian met uitgeschakelde stamcellen in het weefsel dat naast het beschermde weefsel ligt dat nog steeds stamcellen bevat.

Alternatief kan een weefseltransplantaat van een niet-bestraalde donor worden getransplanteerd in een eerder bestraalde gastheer om een parian te produceren met een geïsoleerde populatie stamcellen. De resultaten tonen geïsoleerde populaties stamcellen naast weefsel met uitgeschakelde stamcellen door hele mount RNA in situ twee hybridisatie voor stamcel markergenen.

Dus de hier beschreven methoden hebben als doel de regeneratie van planarianen beter te begrijpen door het gedrag van stamcellen te bestuderen in zowel een transplantatieparadigma als een gedeeltelijk bestralingsparadigma, wat ons in staat stelt te testen of de omringende weefsels en de lokale omgevingen waarin deze stamcellen zich bevinden, het gedrag van deze neo blasten of stamcellen beïnvloeden. Tijdens het regeneratieproces, een tot twee maanden voorafgaand aan het experiment, voed de planarian volgens het bijbehorende manuscript. Om de gewenste grootte in deze demonstratie te verkrijgen, worden planarianen tussen één en twee centimeter lang en breder dan twee millimeter geselecteerd.

Vervolgens worden ze drie tot zeven dagen voor gebruik uitgehongerd. Bereid vervolgens de Chloro tone-oplossing, een mild lokaal anestheticum, door 0,1 tot 0,2% gewicht per volume cleone op te lossen in het parian water. Koel vervolgens de oplossing op ijs voor weefseltransplantatie met een Bunsenbrander, buig een capillairbuis met een binnendiameter van 0,75 millimeter op één tot twee centimeter van het uiteinde naar een hoek van 90 graden voor het snijden van het transplantatieweefsel.

Buig vervolgens een andere capillaire buis met een buitendiameter van 0,7 millimeter op één tot twee centimeter van het uiteinde naar een hoek van 90 graden voor het maken van een gat in de gastheer om het transplantaat te ontvangen. Snijd vervolgens het zwarte filterpapier watman. Nummer drie, filterpapier Kim wipe en sigarettenpapier volgens de maten die in het bijbehorende manuscript zijn aangegeven.

Bereid daarna de gemodificeerde Holt Fers-oplossing en Caine verzadigde Holt Fretter-oplossing. Koel beide op vier graden Celsius. Bevestig vervolgens een gevouwen Kim wipe aan een vierkant van Paraform.

Plaats het op de Peltier-koelplaat of een ander koelapparaat onder een dissectiescoop. Verzadig vervolgens de Kim wipe met gekoelde Holt Fretter-oplossing. Plaats vervolgens twee rechthoeken van zwart filterpapier op de Kim wipe.

Plaats nu een stuk Watman nummer twee filterpapier in een petrischaal. Bevochtig het filterpapier met Holt Fretter-oplossing. Koel vervolgens de schaal op ijs voor gedeeltelijke bestraling.

Plaats een grotere papieren voering in een grotere schaal, vergelijkbaar met weefseltransplantatie. Bevochtig het filterpapier met Holt Fretter-oplossing. Koel vervolgens de schaal op ijs.

Bij deze procedure vult u een petrischaal met gekoelde cleone-oplossing. Pipet de Planaria in de schaal voor transplantatie. Verdoof slechts één gastheer en één donor per keer.

Voor gedeeltelijke bestraling kunnen veel dieren tegelijkertijd worden verdoofd. Laat vervolgens de paria vijf tot tien minuten in de cleone-oplossing weken totdat ze onbeweeglijk worden. Spoel de paria door ze met een pipetter in een schaal met gekoelde Holt Fretter-oplossing te pipetten.

Immobiliseer vervolgens het plania-gebied door ze met een pipetter op het zwarte filterpapier te pipetten dat verzadigd is met gekoelde Holt fretter-oplossing. Orienteer ze met de buikzijde naar beneden met een tang. Plaats nu een gekoelde petrischaal, eerder bereid, in een ijskoud emmer dat past in een bovenbron X-straalbestraler.

Schik het verdoofde plania-gebied in een petrischaal door de zwarte filterpapieren te verplaatsen. Breng ze vervolgens over naar de X-straalbestraler met de bovenste bron. Plaats de ijskoude emmer zodanig dat de afstand tussen de kathodebuis en de paria wordt geminimaliseerd. Dit maximaliseert de effectieve dosissnelheid.

Plaats vervolgens de loodschermen tussen de paria en de kathodebuis voor de dosis röntgenstraling. Als volledige stamcelablatie van niet-afgeschermde gebieden gewenst is, lever dan 30 gray of meer. Direct na de röntgenemissie brengt u de parian over in gekoeld parian-water.

Laat vervolgens het parian-water opwarmen tot kamertemperatuur en laat de dieren zichzelf losmaken van het zwarte filterpapier. De procedure voor gedeeltelijke bestraling is nu voltooid. Om deze procedure onder de dissectiescoop te starten, schik de verdoofde gastheer en donor plania-gebied op afzonderlijke rechthoekige zwarte filters op de Kim wipe, die al is afgekoeld op de peltier- of koelplaat.

Gebruik een capillaire buis met een binnendiameter van 0,75 millimeter om de transplantaatplug uit de donor te snijden. Plaats deze vervolgens met een tang op een deel van de gastheer dat niet in de weg zit. Gebruik vervolgens een capillaire buis met een buitendiameter van 0,7 millimeter om een plug uit de gastheer te verwijderen.

Positioneer vervolgens het transplantaat in het gat. Breng de getransplanteerde gastheer op het rechthoekige zwarte filterpapier over naar de eerder bereide petrischaal. Bevochtig een stuk rolpapier met Caine verzadigde Holt Fretter-oplossing.

Plaats het vervolgens op de getransplanteerde gastheer. Week vervolgens vier stukken filterpapier met verzadigd Holter-oplossing en indien de getransplanteerde gastheer vervolgens vier ballen gesneden Kim wipe met verzadigd Holt Fretter-oplossing. Leg ze over de filterpapieren.

Sluit vervolgens de deksel. Plaats de petrischaal op ijs. Breng vervolgens