Planarian Immobilisatie, Gedeeltelijke Bestraling en weefseltransplantatie

Het algemene doel van het volgende experiment is om een populatie gezonde stamcellen naast stamcel-geablateerd weefsel in een parian te positioneren, om zo het gedrag van stamcellen en hun nakomelingen in vivo tijdens regeneratie te analyseren. Dit wordt bereikt door een niet-bestraalde of een Leafly-bestraalde parian te anesthetiseren en te immobiliseren voor verdere manipulatie. Vervolgens wordt de geïmmobiliseerde, niet-bestraalde parian gedeeltelijk afgeschermd met lood en daarna röntgenbestraald, wat resulteert in een onbeschadigde parian met stamcel-geablateerd weefsel naast het afgeschermde weefsel dat nog steeds stamcellen bevat.

Als alternatief kan een weefseltransplantaat van een niet-bestraalde donor worden getransplanteerd in een eerder bestraalde gastheer om een parian te produceren met een geïsoleerde populatie stamcellen. De resultaten van een gastheer waarbij de stamcellen zijn geablateerd, laten zien dat er geïsoleerde stamcelpopulaties aanwezig zijn naast de stamcel-geablateerde weefsels, aangetoond via whole mount RNA in situ hybridisatie voor stamcelmarkergenen.

De hier beschreven methoden zijn erop gericht het regeneratieproces van planaria beter te begrijpen door het gedrag van stamcellen te bestuderen in zowel een transplantatieparadigma als een paradigma met partiële bestraling; dit stelt ons in staat om te testen of de omliggende weefsels en de lokale omgevingen waarin deze stamcellen zich bevinden het gedrag van deze neoblasten of stamcellen beïnvloeden. Voed de planaria één tot twee maanden vóór het experiment volgens het bijbehorende manuscript tijdens het regeneratieproces. Om de gewenste grootte voor deze demonstratie te verkrijgen, worden planaria geselecteerd met een lengte tussen één en twee centimeter en een breedte van meer dan twee millimeter.

Vervolgens worden ze drie tot zeven dagen vóór gebruik uitgehongerd. Bereid daarna de Chlorotoon-oplossing, een mild plaatselijk anestheticum, door 0,1 tot 0,2% gewicht per volume cleone op te lossen in pariaans water. Koel de oplossing daarna op ijs voor weefseltransplantatie; buig met een bunsenbrander een capillaire buis met een binnendiameter van 0,75 millimeter op één tot twee centimeter van het uiteinde in een hoek van 90 graden om het transplantaatweefsel af te snijden.

Buig vervolgens een andere capillaire buis met een buitendiameter van 0,7 millimeter op één tot twee centimeter van het uiteinde in een hoek van 90 graden om een gat in de gastheer te maken waar het transplantaat in geplaatst kan worden. Knip daarna het zwarte Watman filterpapier nummer drie, Kimwipe filterpapier en sigarettenpapier volgens de afmetingen die in het bijbehorende manuscript worden aangegeven.

Bereid daarna de gemodificeerde Holt Fers-oplossing en de verzadigde Holt Fretter-oplossing van Caine voor. Koel beide oplossingen af tot vier graden Celsius. Bevestig vervolgens een gevouwen Kimwipe aan een vierkant stuk Paraform.

Plaats het op de Peltier-koelplaat of een ander koelapparaat onder een dissectiemicroscoop. Verzadig vervolgens de Kim wipe met gekoelde Holt Fretter-oplossing. Plaats daarna twee rechthoeken zwart filterpapier op de Kim wipe.

Plaats nu een stuk Watman nummer twee filterpapier in een Petrischaal. Bevochtig het filterpapier met Holt Fretter-oplossing. Koel de schaal vervolgens op ijs voor gedeeltelijke bestraling.

Plaats een grotere papieren voering in een grotere schaal, vergelijkbaar met weefseltransplantatie. Bevochtig het filterpapier met Holt Fretter-oplossing. Koel de schaal vervolgens af op ijs.

Vul bij deze procedure een petrischaal met gekoelde cleone-oplossing. Pipetteer de Planaria in de schaal voor transplantatie. Anestheseer slechts één gastheer en één donor tegelijk.

Voor gedeeltelijke bestraling kunnen veel dieren tegelijkertijd worden geanestheseerd. Laat de paria vervolgens vijf tot 10 minuten weken in de cleone-oplossing totdat ze bewegingsloos worden. Spoel de paria door ze met een pipet in een schaal met gekoelde Holt Fretter-oplossing over te brengen.

Immobiliseer daarna het plin-gebied door deze met een pipet op de zwarte filterpapieren te plaatsen die verzadigd zijn met gekoelde Holt fretter-oplossing. Richt ze vervolgens met een pincet met de ventrale zijde naar beneden. Plaats nu een eerder voorbereide gekoelde Petrischaal, die in een ijsemmer staat, in een top source röntgenbestralingsapparaat.

Schik het geanestheseerde plin-gebied in een Petrischaal door de zwarte filterpapieren te verschuiven. Verplaats ze vervolgens naar de bovenste röntgenbron-bestraler en plaats de ijsemmer zodanig dat de afstand van de kathodebuis tot de paria wordt geminimaliseerd. Hiermee wordt de effectieve dosisrate gemaximaliseerd.

Plaats vervolgens de loden afschermingen tussen de paria en de kathodebuis voor de röntgendosis. Indien volledige ablatie van stamcellen in de niet-afgeschermde regio's gewenst is, dient een dosis van 30 grays of meer te worden toegediend. Plaats de paria direct na de röntgenemissie in gekoeld pariawater.

Laat daarna het parian-water opwarmen tot kamertemperatuur, zodat de dieren zichzelf kunnen losmaken van het zwarte filterpapier. De procedure voor gedeeltelijke bestraling is nu voltooid. Om deze procedure onder de dissectiemicroscoop te starten, plaatst u de gebloqueerde gastheer en het donor-plin-gebied op afzonderlijke rechthoekige zwarte filters op de Kim wipe, die reeds is afgekoeld op de peltier- of koelplaat.

Gebruik een capillaire buis met een binnendiameter van 0,75 millimeter om de graftplug uit de donor te snijden. Gebruik vervolgens een pincet om deze op een ongebruikt deel van de gastheer te plaatsen. Gebruik daarna een capillaire buis met een buitendiameter van 0,7 millimeter om een plug uit de gastheer te verwijderen.

Plaats vervolgens het transplantaat in het gat. Verplaats de getransplanteerde gastheer op het rechthoekige zwarte filterpapier naar de eerder klaargemaakte Petri-schaal. Bevochtig een stukje sigarettenpapier met een verzadigde Holt Fretter-oplossing van Caine.

Plaats het vervolgens bovenop de getransplanteerde gastheer. Week daarna vier stukjes filterpapier in verzadigde Holter-oplossing en, indien de getransplanteerde gastheer inzinkt, vier propjes gesneden Kimwipe in verzadigde Holt-Fretter-oplossing. Leg deze over de filterpapieren heen.

Sluit daarna het deksel. Plaats de Petrischaal op ijs. Breng vervolgens de donor-parian over naar het parianwater voor herstel en regeneratie.

Wanneer alle transplantaties zijn voltooid, wordt het getransplanteerde parian gedurende één nacht in een incubator bij 10 °C geplaatst. De volgende ochtend wordt het overgebracht naar een Petrischaal gevuld met parianwater. Laat het parian zich ofwel zelf losmaken van het filterpapier, of verwijder het voorzichtig met een pincet, en verschoon daarna elke twee tot drie dagen het parianwater.

Hole mount in situ hybridisatie in de bestraalde, maar volledig afgeschermde controle-parian, gefixeerd drie dagen na bestraling, vertoont een stamceldistributie die niet te onderscheiden is van die van de wildtype parian. Daarentegen lijken bij de parian die slechts gedeeltelijk was afgeschermd, waarbij de anterieure en posterieure delen waren blootgesteld, de stamcellen in de niet-afgeschermde regio's te zijn geablateerd. Hier worden de dorsale en ventrale aanzichten getoond van een succesvol getransplanteerde parian.

Drie dagen na transplantatie is het transplantaat duidelijk zichtbaar op zowel de dorsale als ventrale zijden, en wordt omringd door karakteristiek ongepigmenteerd weefsel op de interface tussen het transplantaat en de gastheer. Echter, bij een mislukte transplantatie is er geen zichtbaar transplantaatweefsel aanwezig op de transplantatieplaats. Whole mount in situ hybridisatie onthulde de aanwezigheid van stamcellen uitsluitend in of rond de locatie van het transplantaat, wat wijst op het succes van de transplantatie zodra deze beheerst is.

Transplantaties kunnen in slechts vijf minuten per stuk worden uitgevoerd. Met succespercentages die 90 tot 100% naderen, kan gedeeltelijke bestraling aanzienlijk worden opgeschaald, mits de veldgrootte van uw bestralingsapparaat voldoende groot is.