Name: Karakterisering van moleculaire mechanismen van In vivo UVR Induced Cataract (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Leer hoe u cataract induceert bij ratten met UVR-expositie en de moleculaire mechanismen analyseert via kwantitatieve RT-PCR en immunohistochemie. Deze methode biedt inzicht in apoptose in de lens.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Karolinska Institutet KID-financiering, Zweeds Instituut voor Stralingsbescherming, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, St. Erik&#39;s Eye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

1. Blootstelling aan ultraviolette straling <ol><li> 15 min voor de opname verdoven een vrouwelijke Sprague-Dawley rat met een mengsel van 90 mg / kg Ketalar (ketamine) en 10 mg / kg Rompun (xylazine) door intraperitoneale injectie. </li><li> Plaats het dier in een rat restrainer en draai de riemen tot immobilisatie van de rat zonder dat een boomstam squeeze 13. </li><li> Instill Mydriacyl (tropicamide), 10 mg / ml, in beide ogen van de rat mydriasis induceren. </li><li> Plaats het dier, zodat een oog is geplaatst tegen een smalle bundel UVR bij 300 nm 14 met 10 nm breedte op halve hoogte en beschermen de contralaterale oog met zwarte tape. </li><li> Expose de rat eenzijdig sub-threshold dosis 1 kJ / m 2 UVR-B bij 300 nm gedurende 15 minuten 15. </li></ol> 2. Ontleding <ol><li> Na voorafbepaalde na blootstelling interval (1, 5, 24 en 120 uur), offeren zes weken oude ratten (gewicht &lt;200 g) door carbon dioxide stikken of breken van de halswervels. </li><li> Ophelderen ogen. Daarna neer te zetten in het oog hoornvlies, posterieure zijde naar boven. Dan stoot een minimale gat door het toepassen van een 27 gauge canule en druk tangentiaal aan de sclera om te voorkomen dat schade aan de lens die zeer dicht bij de sclera. Maak dan gebruik van een paar van oogheelkundige chirurgie schaar om de omtrek snijden net achter de limbus tot het achterste gedeelte van de sclera kan worden getild. Til de lens met een stomp gebogen tang. </li><li> Verwijder resten van het corpus ciliare van de lens equator onder een microscoop, waarbij de lens in gebalanceerde zoutoplossing niet meer dan 5-10 min. </li></ol> 3. Kwantitatieve RT-PCR <ol><li> Plaats een lens in een mix van 350 ul lysis buffer RA1 (NucleoSpin RNA II totaal RNA isolatie kit) en 3,5 ul β-mercaptoethanol in een 2 ml Eppendorf buisje. </li><li> Houd de lens in deze mix gedurende 30 min bij kamertemperatuur. </li><li> Homogeniseer de lens meteen naald tot enige harde kern van de lens is links van de lens (cortex en capsule van de lens gelyseerd in de lysisbuffer). Verwijder de kern van de mix. </li><li> Store monsters onmiddellijk bij -70 ° C. </li><li> Ontdooi de monsters en volg het protocol &quot;Totaal RNA zuivering uit gekweekte cellen en weefsels&quot; (NucleoSpin RNA II totaal RNA isolatie kit). </li><li> Store RNA monsters bij -70 ° C. </li><li> Om voldoende verwijdering van DNA van elk monster te verifiëren, uitvoeren van een PCR onder de volgende voorwaarden (stap 1: 95 ° C gedurende 2 min; stap 2 gedurende 40 cycli: 95 ° C gedurende 20 sec, 55 ° C gedurende 20 seconden, 72 ° C gedurende 20 sec, stap 3: 72 ° C gedurende 7 min) met p53 DNA primers, voorwaarts 5&#39;-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 &#39;en reverse 5&#39;-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3&#39; en Taq DNA polymerase (dNTPack) volgens de fabricage protocol. De verwachte PCR product is 243 baseparen. </li><li> Voer een 1,5% agarose gelelektroforese om DNA specifieke PCR product van 243 basenparen detecteren. Voor te bereiden1,5% agarose gel in TBE buffer nemen 3,75 g agarose en oplossen in 250 ml TBE buffer. Voeg ethidiumbromide (0,5 mg / ml) 500 pi in 500 ml 1,5% agarose gel oplossing. Verwarm het mengsel in een magnetron en roer om de agarose op te lossen. </li></ol> Geen van de monsters moet elke DNA specifieke PCR producten onthullen op 1,5% agarose gelelektroforese. <ol start="9"><li> Concentratie van RNA monsters (1 pi) en de verhouding van het monster absorptie bij 260 nm (RNA) en 280 nm (proteïne) in een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer. Als de verhouding van RNA tot eiwit RNA monster absorptie van 2,0 of meer dan de RNA monster zuiver is. Als de verhouding van RNA monster absorptie lager dan 2,0, opnieuw RNA zuiveringsstap 3.5. </li><li> Neem een zodanige hoeveelheid RNA monster overeenkomend met 1 ug cDNA synthetiseren en volgens het protocol 1 st Strand cDNA synthese kit (1 st Strand cDNA Synthesis Kit voor RT-PCR). </li><li> Bewaar cDNA monsters bij -20 ° C(Voor een periode van 1 jaar en bewaren bij -70 ° C). </li><li> Run kwantitatieve real-time PCR op ICycler MyiQ Een kleur Real Time PCR detectie systeem. Belasting drievoud op 96-well plaat met 1 pi cDNA monster TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay voor caspase 3, volgens de instructies vervaardigen. Belasting drievoud op een andere plaat met 96 putjes met 1 pi cDNA monster TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay voor 18s volgens instructies (TaqMan Gene Expression Assay Protocol) productie. Verdun in serie een fractie van cDNA van drie willekeurig gekozen niet-belichte lenzen. Lopen samen met seriële verdunningen van cDNA monsters in een 96-well plaat. </li><li> De standaard curve werkwijze voor kwantificering van de resultaten. Het aantal cycli bij drempel fluorescentie wordt gebruikt als meting MyiQ software. Een standaard kromme waarin aantal cycli bij drempel als functie van relatieve concentratie van kalibrator is established voor de seriële verdunningen in elke plaat. cDNA van drie onbehandelde monsters lens werd gebruikt voor kalibratie. Relateren de drempel aantal cycli voor elk monster voor de standaardcurve om de relatieve concentratie van het monster gemeten cDNA te verkrijgen. Tenslotte krijgen expressie van de doelwitgenen door betreffende de relatieve concentratie van het target cDNA de interne controle 18s cDNA. </li></ol> 4. Immunohistochemische kleuring <ol><li> Bevestiging <ol><li> Prepareer het oog in PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4). </li><li> Zet het oog in een buis gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA) in ijskoud gedurende 20 minuten. Bereid PFA 4% de dag voordien. Bewaren bij +4 ° C tot gebruik. PFA is vers voor ongeveer een week. </li><li> Verwijderen PFA met een micropipet. Vervolgens wassen met ijskoud PBS gedurende 20 minuten. </li><li> Zet het oog in 30% sucrose bij +4 ° C gedurende de nacht. </li><li> Zet het oog in een beker gevuld met optimale snijtemperatuur (OCT)-medium (Tissue-Tek). Zet het oog op een geschikte plaats voor het snijden. </li><li> Freeze in OCT-medium op droog ijs. </li><li> Bewaren bij -70 ° C tot gebruik. </li></ol></li><li> Snijden <ol><li> Plaats de oog voor cryo-snijden in een geschikte vliegtuig. </li><li> Snijd drie 5 urn dik mid-sagittale secties van een centraal gedeelte van elke lens. Ontdoen tenminste 6 secties tussen opeenvolgende secties voorkom vlekken dezelfde kernen in verschillende secties. </li><li> Zodra een gedeelte is gesneden plaats voorzichtig een dia bovenop. De sectie moet dan vasthouden aan de dia. </li><li> Laat de dia&#39;s aan de lucht drogen voor gebruik. Dia&#39;s kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot nodig. </li></ol></li><li> Fluorescentie immunohistochemie <ol><li> Laat monsters bereiken kamertemperatuur (5-10 min). </li><li> Teken randen rond de exemplaren met een PAP-pen (Invitrogen). </li><li> Laat de rand even drogen (10 min). </li><li> Label de objectglaasjes. </li><li> Vocht opnemen in 1 × PBS gedurende 15 minuten. </li><li> Permeabiliseren in standaardblok oplossing gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg primaire antilichaam (konijn polyklonaal, gekloofd caspase-3 antilichaam Asp175 9661; Cell Signalling Technology, Inc) verdund 1:3,000 in standaard blok oplossing. </li><li> Opslag in een bevochtigde kamer bij +4 ° C gedurende de nacht. </li><li> Wassen in PBS door pipetteren (3 x 5 min) of door onderdompeling in een groot bad (&gt; 15 min, 1-2 opent). </li><li> Voeg secundair antilichaam (anti konijn secundair antilichaam met een specifieke absorptie / emissie-spectrum) verdund 1:300 in de standaard blok oplossing. </li><li> Wassen in PBS door pipetteren (3 x 5 min) of door onderdompeling in een groot bad (&gt; 15 min, 1-2 opent). </li><li> Veeg PAP-pen uitstrijkjes. </li><li> Bewaar in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. Vermijd blootstelling aan licht. </li><li> Voeg een druppel Vectashield en plaats een dekglas op de dia. Vermijd het maken van bubbels. </li><li> Laat uitharden Vectashield (~ 20 min). </li><li> Houd secties in het donker. </li><li> Alle aanstuurgedeelten worden verwerkt in de afwezigheid van primaire antilichaam. </li><li> Zoek de resultaten binnen enkele uren onder een fluorescentiemicroscoop. </li><li> Count epitheelcellen &#39;kernen van de ene kant nucleaire boeg naar de andere kant nucleaire boeg van het objectief. Breng de standaard blauwe filter toe op alle lens epitheel kernen in blauw en een standaard filter dat de uitstoot van het secundaire antilichaam past om te zien de caspase-3 positieve kernen in het groen te zien. </li><li> Noteer het aantal van alle kernen lens epitheel en het aantal positieve kernen. Tel de cellen drie keer voor elke sectie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brian, G., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract+blindness%3A+challenge+for+the+21+st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Cataract blindness: challenge for the 21 st century.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).</li>
<li>Jose, J. G., Pitts, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependency+of+cataracts+in+albino+mice+following+chronic+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure.</a> Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cataract+in+the+rat+after+exposure+to+radiation+in+the+300+nm+wavelength+region.+A+study+of+the+macro-%2C+micro-+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%29%22%5BJournal%5D)">Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).</li>
<li>Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+dependent+cataractogenesis+and+Maximum+Tolerable+Dose+%28MTD+2.3%3A16%29+for+UVR+-+B+induced+cataract+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice.</a> Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).</li>
<li>McCarty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lifetime+ocular+exposure+to+UV-B%3A+the+Melbourne+visual+impairment+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project.</a> Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).</li>
<li>Sasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+cortical+cataract+in+subjects+of+diverse+races+and+latitude%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%22%5BJournal%5D)">Experimental cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).</li>
<li>Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+damage+in+the+lens+after+in+vivo+close+to+threshold+exposure+to+UV-B+radiation%3A+cytomorphological+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis.</a> Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).</li>
<li>McCarty, C. A., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+epidemiologic+evidence+linking+ultraviolet+radiation+and+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts.</a> Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).</li>
<li>Li, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cell+apoptosis+appears+to+be+a+common+cellular+basis+for+non-congenital+cataract+development+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals.</a> Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).</li>
<li>Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rat+lens+after+in+vivo+threshold+dose+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).</li>
<li>Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Expression+and+Apoptosis+In+The+Lens+After+Ultraviolet+Radiation+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+of+visual+science%22%5BJournal%5D)">p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure.</a> Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).</li>
<li>Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+universal+rat+restrainer+for+ophthalmic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new universal rat restrainer for ophthalmic research.</a> Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cataract+after+repeated+exposure+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation.</a> Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).</li>
<li>Söderberg, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+ultraviolet+radiation+exposure+to+the+lens+expressed+by+maximum+tolerable+dose+%28MTD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD).</a> Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).</li>
<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
<li>Löfgren, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cataract+from+ultraviolet+radiation%22">Cataract from ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).</li>
<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+limit+estimation+for+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%22">Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+and+sex+in+ultraviolet+radiation+cataract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

<html> Dit artikel beschrijft de methoden die het mogelijk maken het bestuderen van moleculaire gebeurtenissen die plaatsvinden tijdens UVR-B geïnduceerde cataract. Aangezien dat de meeste informatie in vivo UVR geïnduceerde cataract werd verkregen uit proeven op albino Sprague-Dawley ratten 7, 16, 17, 18, ​​19, besloten we de albino Sprague-Dawley rat gebruikt in de huidige studie. Leeftijd van de ratten was zes weken oud. Het geslacht werd gekozen tot vrouwelijke, omdat,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Ketalar </td><td> Pfizer </td><td> 150086 </td><td> 50 mg / ml </td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td> 022545 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Oculentum Simplex </td><td> Apoteket, Zweden </td><td> 336164 </td><td> 5 g </td></tr><tr><td> Mydriacyl </td><td> Alcon </td><td> 00352 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Gebalanceerde zoutoplossing </td><td> Alcon </td><td> 0007950055 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 ul β-mercaptoethanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II totaal RNA isolatie kit </td><td> Macherey-Nagel GmbH &amp; Co, Düren, Duitsland </td><td> 740.955,50 </td><td></td></tr><tr><td> p53 DNA specifieke primers </td><td> biomers.net GmbH </td><td> Custom made </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA polymerase, dNTPack </td><td> Roche </td><td> 04 728 866 001 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Ethidiumbromide oplossing 0,5 mg / ml </td><td> Sigma </td><td> E1385 </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop ND-1000 spectrofotometer </td><td> NanoDrop Producten </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 st Strand cDNA synthese kit voor RT-PCR (AMV) </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 11 483 188 001 </td><td></td></tr><tr><td> ICycler MyiQ Een kleur Real Time PCR detectie systeem </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td></td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> 96-well plaat </td><td> Sarstedt </td><td> 72.1979.202 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene Expression Master Mix </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4369016 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene Expression Assay voor caspase 3 </td><td> Applied Biosystems </td><td> Rn00563902_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene Expression Assay voor 18s </td><td> Applied Biosystems </td><td> Hs99999901_s1 </td><td></td></tr><tr><td> MyiQ software </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gekloofd caspase-3 (Asp175) </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 9661 </td><td></td></tr><tr><td> Anti konijn IgG </td><td> Abcam </td><td> Ab6798 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Universele Microscoop Axioplan 2 Imaging </td><td> Carl Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 441244 </td><td></td></tr><tr><td> TBE buffer 10x </td><td> Promega </td><td> V4251 </td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisering van moleculaire mechanismen van<em&gt; in vivo</em&gt; uvr induced cataract

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

Cataract is de belangrijkste oorzaak van blindheid in de wereld 1. De World Health Organization definieert cataract als een vertroebeling van de lens van het oog die de overdracht van licht belemmert. Cataract is een multifactoriële aandoening is in verband met diabetes, roken, ultraviolette straling (UVR), alcohol, ioniserende straling, steroïden en hoge bloeddruk. Er is een sterke experimentele 2-4 en epidemiologische bewijzen dat 5,6 UVR cataract veroorzaakt. Wij een diermodel voor UVR B geïnduceerde cataract in zowel verdoofd 7 en niet-verdoofde dieren 8. De enige remedie voor cataract is een operatie, maar deze behandeling is niet voor iedereen toegankelijk. Er is geschat dat een vertraging van het begin van cataract 10 jaar zou de noodzaak voor cataractchirurgie met 50% 9. Om de incidentie van cataract vertragen, is het nodig om de mechanismen van cataract te begrijpen en vinden effectieve preventie strategies. Onder de mechanismen voor cataract ontwikkeling apoptose speelt een cruciale rol bij de initiatie van cataract bij mensen en dieren 10. Onze focus is onlangs apoptose in de lens als het mechanisme voor de ontwikkeling van cataract 8,11,12. Verwacht wordt dat een beter begrip van het effect van UVR op de apoptose route zal mogelijkheden bieden voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen te voorkomen cataract. In dit artikel beschrijven we hoe cataract kan experimenteel geïnduceerd worden door in vivo blootstelling aan UVR-B. Verdere RT-PCR en immunohistochemie worden gepresenteerd als hulpmiddel om de moleculaire mechanismen van UVR-geïnduceerde cataract B bestuderen.

De verschillende bronnen van variatie in de metingen werden geraamd met een variantie-analyse en werd vastgesteld dat gezien drie metingen per dier de variantie voor metingen was in de orde van 15% van die van dieren. Aldus gezien gehele lens analyse is niet mogelijk om de precisie. Orthogonale testen opgehelderd een statistisch significant contrast voor caspase-3-bericht tussen de 120 uur latentie-interval ten opzichte van kortere latency intervallen. In vivo UVR blootstelling indu...

Cataract is de belangrijkste oorzaak van blindheid in de wereld. UV-zonnestralen (UVR) is de belangrijkste risicofactor voor de ontwikkeling van cataract. Een diermodel van ver UVR-B geïnduceerde cataract ontwikkeld. In dit artikel beschrijven we methoden voor onderzoek naar cataract: blootstelling aan UVR, kwantitatieve RT-PCR en immunohistochemie.

Karakterisering van moleculaire mechanismen van<em&gt; In vivo</em&gt; UVR Induced Cataract

Cataract is de belangrijkste oorzaak van blindheid ter wereld 1. De Wereldgezondheidsorganisatie definieert cataract als een vertroebeling van de ooglens die ...

Deze video demonstreert een methode voor het induceren van cataract bij de rat met behulp van ultraviolette straling. De moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van cataract worden vervolgens bestudeerd met kwantitatieve real-time PCR en immunocytochemie. Allereerst wordt het oog van de rat blootgesteld aan ultraviolette straling om cataractvorming te induceren.Het andere oog dient als controle. Vervolgens worden de lenzen gedissekeerd en verwerkt om RNA te verkrijgen voor de bepaling van de expressieniveaus van CAS B via kwantitatieve real-time PCR, of gekleurd met een antilichaam tegen gecleavde caspase-3 om de expressie en lokalisatie van het actieve eiwit te beoordelen.Uiteindelijk bevestigen de resultaten van deze assays een toename van caspase three mRNA en de expressie van het actieve eiwit in de nucleus van de lenscellen na blootstelling aan UVR. Het belangrijkste voordeel van dit protocol ten opzichte van bestaande methoden is dat het gebruikmaakt van een unieke smalbandige UVR-bron en een universele rattenfixatie, waardoor we dieren veilig en nauwkeurig kunnen blootstellen aan een goed gedefinieerd UV-spectrum en een specifieke dosering. Bovendien hebben we moderne biologische technieken toegepast, zoals kwantitatieve R-T-P-C-R en immunohistochemie, om apoptose in de lens te bestuderen. Deze methode kan informatie verschaffen over de moleculaire mechanismen van cataract geïnduceerd door ultraviolette straling.Het kan ook worden toegepast op andere experimentele modellen, zoals door ultraviolette straling geïnduceerde huidkanker, gedragsneurowetenschappen bij ratten en experimenteel oogonderzoek met de focus op apoptose. Begin dit protocol door een geanestheseerde vrouwelijke Sprague Dawley-rat in een rattenfixateur te plaatsen; trek de riemen aan totdat de rat is geïmmobiliseerd, zonder de romp samen te knijpen. Om midriasis of pupilverwijding op te wekken, wordt één tot twee druppels van een 10 mg/mL oplossing van tropicamide in elk oog aangebracht.Breng vervolgens zalf aan op het niet-blootgestelde oog en dek dit af met zwarte tape om UV-straling te blokkeren. Plaats het dier daarna in de fixatiehouder, zodat het onbedekte oog is gepositioneerd om een smalle bundel ultraviolette straling van 300 nanometers te ontvangen, met een volledige breedte op halve maximale hoogte van 10 nanometer, gegenereerd door een hogedruklamp met kwik. Stel de rat unilateraal bloot aan een sub-drempelwaarde dosis van één kilojoule per meter squared UVRB gedurende 15 minuten na blootstelling.Verwijder de tape van het niet-blootgestelde oog en breng zalf aan in beide ogen. Plaats het dier terug in de kooi en bedek het met zacht papier om het warm te houden. Houd het dier in de gaten tot het voldoende bewustzijn heeft teruggewonnen om in sternale recumbens te blijven.Plaats de herstelde rat vervolgens terug in de kooi bij de andere ratten. 1, 5, 24 en 120 uur na de blootstelling.Plaats het geënucleerde oog van de geëuthanaseerde rat met de hoornvlieszijde naar beneden en de posterieure zijde naar boven op een zacht papieren tissue. Werk vervolgens onder een dissectiemicroscoop. Gebruik een canule van 27 gauge om een minimaal gaatje te ponsen door tangentieel tegen de sclera te duwen om beschadiging van de lens, die zeer dicht bij de sclera ligt, te voorkomen.Knip vervolgens met een oogheelkundige chirurgische schaar circumferentieel vlak achter de limbus tot het posterieure deel van de sclera kan worden opgetild. Til daarna met stompe gebogen pincetten de lens op, plaats de lens in een gebalanceerde zoutoplossing en verwijder resten van het ciliaire lichaam van de lens. De lens mag niet langer dan 10 minuten in de gebalanceerde zoutoplossing worden bewaard.Plaats na dissectie een lens in een microcentrifugebuis van 2 ml met 350 µL ra, one lysisbuffer van de nucleo spin RNA two total RNA isolation kit en 3,5 µL Beamer keto ethanol. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik na incubatie een naald om de lens mechanisch te homogeniseren totdat alleen de harde kern overblijft. De cortex en het kapsel van de lens worden gelyseerd door de lysisbuffer.Verwijder de kern uit het mengsel en gooi deze weg. Bewaar de monsters onmiddellijk bij -70 °C. De monsters kunnen tot een jaar worden bewaard totdat men klaar is om verder te gaan.Filter de monsters en zuiver het RNA volgens het protocol voor totale RNA-zuivering uit gekweekte cellen en weefsel van de kit. Bewaar de RNA-monsters bij -70 °C. Om te verifiëren dat DNA voldoende uit elk monster is verwijderd, wordt het DNA geamplificeerd met P 53 DNA-specifieke primers onder de volgende condities.Stap 1: 95 °C gedurende twee minuten. Stap 2: voor 40 cycli, 95 °C gedurende 20 seconden. 55 °C gedurende 20 seconden.72 °C gedurende 20 seconden. Stap 3: 72 °C gedurende zeven minuten. Zodra de run is voltooid, worden de producten gescheiden op een 1,5% agarosegel.Om het DNA-specifieke PCR-product van 243 basenparen te detecteren, dient u ervoor te zorgen dat er een positieve en een negatieve controlemonsters zijn opgenomen. Als het DNA succesvol is verwijderd, zullen de PCR-producten niet zichtbaar zijn. Er zou slechts een band zichtbaar moeten zijn in de baan van de positieve controle, waarbij een NanoDrop-spectrofotometer wordt gebruikt om de concentratie van de RNA-monsters te meten en de ratio van RNA ten opzichte van proteïne te bepalen.Als de ratio RNA ten opzichte van proteïne van de RNA-monsterabsorbentie of de 260/280-ratio 2,0 of hoger is, dan is het RNA-monster puur. Synthetiseer vervolgens, gebruikmakend van één microgram RNA, cDNA met een first strand cDNA synthesekit voor RT-PCR en bewaar de cDNA-monsters bij -20 °C. Breng vervolgens, om kwantitatieve real-time PCR uit te voeren, de monsters in triplo aan op een 96-well plaat.Elke well moet één microliter cDNA-monster bevatten, gecombineerd met de TAC man genexpressie mastermix voor caspase 3 op een aparte plaat. Pas hetzelfde toe voor de monsters, maar gebruik dan de TAC man genexpressie assay voor 18 s. Om vervolgens een standaardcurve voor de analyse te genereren, wordt één microliter cDNA van drie willekeurig gekozen niet-blootgestelde lenzen in serie verdund.Voer seriële verdunningen uit samen met het cDNA uit de monsters. In een 96-wells plaat op elke plaat. Centrifugeer de plaat en voer deze vervolgens uit op een iCycler iQ, single-color real-time PCR-detectiesysteem.Stel na de run, met behulp van mijn IQ-software, een standaardcurve op waarin het aantal cycli bij de drempelwaarde wordt uitgedrukt als een functie van de relatieve concentratie van de calibrator voor de seriële verdunningen in elke plaat. Gebruik de standaardcurve om de relatieve concentratie van het gemeten cDNA-monster te bepalen aan de hand van het aantal drempelcycli voor elk monster.Bepaal tot slot het expressieniveau van de doelgenen door de relatieve concentratie van het doel-cDNA te relateren aan het interne controle 18 s cDNA. Om immunohistochemische kleuring uit te voeren, wordt het oog gedissekeerd en na dissectie in PBS geplaatst. Overbreng het oog naar een buis gevuld met 4%paraformaldehyde en incubeer dit gedurende 20 minuten op ijs.Verwijder het paraformaldehyde met een micropipet. Breng het oog vervolgens over naar een eppendorfbuisje van 2 ml met 1 ml ijskoud PBS en incubeer dit 20 minuten op ijs. Breng het oog daarna over naar een eppendorfbuisje met 30% sucrose.Incubeer gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Gebruik de volgende dag een pincet om het oog over te brengen naar een bekerglas gevuld met optimal cutting temperature of OCT-medium. Plaats het oog in een rechte positie voor het maken van coupes.Plaats het bekertje vervolgens op droogijs om het bij -70 °C te bevriezen en te bewaren tot het oog wordt gesneden voor analyse via fluorescentiemicroscopie. Begin met het positioneren van het in OCT ingebedde oog op een chuck in de cryostaat voor cryosectie. Probeer de platste zijde van de ooglens parallel aan de snijkant van het mes uit te lijnen.Snijd drie midsagittale secties van vijf micron dikte uit een centraal deel van elke lens. Verwijder ten minste zes secties tussen opeenvolgende secties om te voorkomen dat dezelfde kernen in verschillende secties worden gekleurd. Plaats, zodra een sectie is gesneden, voorzichtig een objectglas daarop.De sectie moet vervolgens aan de objectglas kleven. Laat de objectglazen aan de lucht drogen voor gebruik. Objectglazen kunnen bij -70 °C worden bewaard tot ze nodig zijn voor kleuring.Laat de preparaten terugkeren naar kamertemperatuur. Voer vervolgens een antilichaamkleuring uit om gesplitste CAS fase drie te identificeren zoals beschreven in het bijbehorende document; inspecteer de preparaten na enkele uren onder een fluorescentiemicroscoop. Tel alle kernen van de lens-epitheelcellen.Registreer het aantal van alle lens-epitheelkernen door de DAPI-gekleurde cellen te tellen en het aantal caspase-3-positieve kernen door de actieve caspase-3-gelabelde cellen te tellen. Tel de cellen drie keer voor elke sectie.Caspase drie is een belangrijk protease in de executiefase van apoptose. Transmissie-elektronenmicroscopie. Studies tonen aan dat UVR apoptose in de lens induceert.Experimentele studies naar apoptose bevestigen dat caspase drie een betrouwbare marker voor apoptose is. Om vast te stellen of in vivo UVR-blootstelling caspase drie-expressie induceert, werd de mRNA-expressie in de kristallijne lens gemeten via QPCR 1, 5, 24 en 120 uur na in vivo blootstelling aan 1 kilojoule per meter vierkante UVR bij 300 nanometer. De gemiddelde ratio van CASP drie-mRNA ten opzichte van 18S-rRNA tussen de blootgestelde lens en de contralaterale niet-blootgestelde lens werd vervolgens uitgezet voor elk tijdspunt.Deze figuur toont de expressie van caspase 3 mRNA in de loop van de tijd en demonstreert de transcriptie van apoptose. Marker caspase 3 in de lens in vivo na blootstelling aan orthogonale far UVR-testen resulteerde in een statistisch significant contrast voor het caspase 3 mRNA-signaal bij een latentie-interval van 120 uur vergeleken met kortere latentie-intervallen. De expressie van caspase 3 in een blootgestelde en niet-blootgestelde lens werd ook vergeleken middels immunofluorescentiemicroscopie, zoals getoond in deze beelden 24 uur na blootstelling; de kernen zijn gelabeld, wat duidt op de aanwezigheid van actief caspase 3.Deze immunokleuringsmethode biedt waardevolle informatie over de ruimtelijke distributie van epitheelcellen in de lens die zijn gelabeld met de apoptosemarker caspase three. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u experimenteel UVR-staar kunt induceren en hoe u het moleculaire mechanisme van UVR-geïnduceerde staar kunt bestuderen met behulp van kwantitatieve RT-PCR en immunohistochemie.

characterization-molecular-mechanisms-vivo-uvr-induced

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een formele demonstratie van het ontleden van een muis oog, wat resulteert in een hele berg van het retinale pigment epitheel.

Ontleding van een muis Oog voor een hele berg van de retinaal pigment epitheel

Microglia-activatie en microgliose zijn de belangrijkste reacties op chronische neurodegeneratie. Hier presenteren we werkwijzen voor in vivo visualisatietechnieken retinale CX3CR1-GFP + cellen door microgliale confocale Ophthalmoscopie, en drempel en morfometrische analyses worden geïdentificeerd en gekwantificeerd hun activering. We monitoren microglia veranderingen tijdens de vroege stadia van leeftijdsgebonden glaucoom.

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de Lambda Selecteer cII mutatie assay in gekweekte cellen van transgene knaagdieren of de overeenkomstige dieren behandeld met een chemische/fysieke agent van belang. Deze aanpak heeft wijd gebruikt voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen.

De Lambda Selecteer cII mutatie detectiesysteem

Dit protocol toont de gelijktijdige detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), levende cellen en dode cellen in levende primaire culturen van muisoculaire oppervlaktecellen. 2',7'-Dichloorfluoresceindiacetaat, propidiumjodide en Hoechst-vlekken worden gebruikt om respectievelijk de ROS-, dode cellen en levende cellen te beoordelen, gevolgd door beeldvorming en analyse.

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

In dit rapport presenteren we een protocol waarmee de onderzoeker een muismodel van intraoculaire uveïtis kan genereren. Meer algemeen aangeduid als experimentele auto-immune uveïtis (EAU), dit gevestigde model legt vele aspecten van de menselijke ziekte vast. Hierin zullen we beschrijven hoe de progressie van de ziekte kan worden geïnduceerd en gevolgd met behulp van verschillende uitlezingen.

Experimentele auto-immune uveïtis: een intraoculair inflammatoir muismodel

Oculaire oppervlakteontsteking schaadt de oculaire oppervlakteweefsels en compromitteert vitale functies van het oog. Het huidige protocol beschrijft een methode om oogontsteking te induceren en gecompromitteerde weefsels te verzamelen in een muismodel van Meibomian gland dysfunction (MGD).

Inductie van oculaire oppervlakteontsteking en verzameling van betrokken weefsels

Muismodellen kunnen nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoeken van de biologie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE). Er is vastgesteld dat muizen een reeks RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen op te helderen en te kwantificeren met behulp van licht, transmissie-elektron en confocale microscopie.

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Deze methode modelleert staarchirurgie in vivo door lensvezelcellen van volwassen muizen te verwijderen en de kapselzak met bevestigde lensepitheelcellen (LEC's) achter te laten. De letselrespons wordt vervolgens op verschillende tijdstippen na de operatie beoordeeld aan de hand van moleculaire en morfologische criteria.

Modellering van staaroperaties bij muizen

We detail een nieuw nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) katheter voor twee-dimensionale intravasculaire moleculaire beeldvorming van plaque...

In vivo Near Infrared Fluorescentie (NIRF) Intravasculaire Moleculaire Beeldvorming van Inflammatoire Plaque, een multimodale aanpak Imaging Atherosclerose

Een In vivo Knaagdieren Model van krimp veroorzaakte letsel en niet-invasieve monitoring van de Recovery

Leer hoe u cataract induceert bij ratten met UVR-expositie en de moleculaire mechanismen analyseert via kwantitatieve RT-PCR en immunohistochemie. Deze methode biedt inzicht in apoptose in de lens.

Karakterisering van moleculaire mechanismen van

Meer video's verkennen