In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Dit experiment demonstreert in ovo elektroporatie van het middenhersenen van een kuiken om het effect van exogene genexpressie op de ontwikkeling van de middenhersenen en de differentiatie van dopaminerge neuronen te bestuderen. Injecteer eerst het middenhersenen van hamburger Hamilton, stadium 11 kiजembryo's met het gewenste plasmide-DNA, om exogeen DNA specifiek in de ontwikkelende middenhersenenvesikel te richten. Elektroporeer vervolgens de middenhersenenvesikel met op maat gemaakte kleine elektroden om het exogene DNA specifiek af te leveren in de neurale progenitorcellen van de middenhersenen.

Oogst vervolgens embryo's in stadium 23 met een goede M cherry-expressie in het middenbrein en maak optimale transversale doorsneden van het middenbrein. Uiteindelijk kan immunokleuringanalyse voor markers van dopaminerge neuronen, zoals tyrosinehydroxylase, de differentiatie van neurale progenitorcellen tot mature dopaminerge neuronen aantonen, geïnduceerd door de expressie van de genen van belang. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden van in ovo electroporatie is dat dit protocol membraanspecifieke electroporatie kan bewerkstelligen om de differentiatie van dopaminerge neuronen in het middenbrein te bestuderen.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de ontwikkeling van het middenbrein, kan deze ook worden toegepast op andere delen van het zenuwstelsel voor het uitvoeren van fate mapping-analyses en voor het onderzoeken van de regulatie van genexpressie. Om hamburger Hamilton, stadium 11 embryo's te verkrijgen, plaatst u elk bevrucht datum op zijn zij en markeert u de bovenkant met een potloodstreepje. Plaats de trays vervolgens op een rocker in een voorverwarmde, bevochtigde incubator.

Controleer elke 24 uur de luchtvochtigheid en het waterniveau bij 41 uur na bevruchting. Verwijder de eieren uit de incubator en bewaar deze bij kamertemperatuur. Reinig het oppervlak van elk ei met 70% ethanol en veeg deze droog.

Plaats nu twee stukjes plakband van vier centimeter naast elkaar op een ei om een grote rechthoek over het potloodstreepje te vormen. Strijk het plakband glad tegen het ei om het venster te kaderen met een spuit van 10 milliliter die is voorzien van een naald van 18 gauge. Doorboor de eierschaal waarbij de naald in een hoek van de dooier wordt gehouden om het embryo niet te verstoren of te beschadigen.

Trek vijf milliliters albumine uit het ei. Reinig de naald met 70% ethanol. Droog de naald voordat het volgende ei wordt doorboord.

Voer de instellingen in voor de vlam-bruine micropipet-trekker. Trek vervolgens dunwandige capillaire buisjes tot injectienaalden met een P 10 pipet. Neem vijf tot 10 µL plasmidenoplossing op in een capillaire pipetpunt met een lange tip.

Vul vervolgens de glazen naald langzaam met een continue kolom zonder luchtbellen. Plaats de gevulde naald in de naaldhouder die is bevestigd aan de micromanipulator en micro-injector. Trim de naald nu onder een dissectiemicroscoop, met een donkere achtergrond voor een betere visualisatie van de naald, op het punt waar de groene vloeistof stopt met een veerschaar.

Snijd vanuit het vorige gaatje van de naald een venster van twee tot twee en een halve centimeter diameter. Voor het opzuigen van albumine. Draai het ei in één hand terwijl u snijdt.

Vergeet niet de schaar tussen de eieren door schoon te maken met een kim wipe verzadigd met 70% ethanol. Ga vervolgens over tot het bekijken van het kiजembyo onder een dissectiemicroscoop. Indien nodig kan het embryo gevisualiseerd worden door 0,22 micrometer gefilterde 20% India ink in PBS onder het kiजembyo te injecteren. Positioneer het embryo parallel aan het pad van de naald, waarbij de kop van de naald af is gericht.

Doorboor de neurale buis langzaam onder een hoek van 45 graden bij de overgang van het middenbrein naar het achterbrein. Begin met het injecteren met de pico spritzer micro-injectoren, waarbij de duur is ingesteld op 25 milliseconden. Pas de tijd aan afhankelijk van de afwerking van de naald; vul alleen de neurale blaas die het middenbrein vertegenwoordigt met plasmide-DNA dat fast green-kleurstof bevat.

Nadat de injectienaald is teruggetrokken, worden drie druppels pen-strep-oplossing op het embryo geplaatst. Controleer de instellingen van de B-T-X-E-M-C eight 30 electropor voor een efficiënte electroporatie. Positioneer de kleine, op maat gemaakte L-vormige platina-elektroden op de positie van de ventrale middenhersenen op hetzelfde horizontale niveau als de onderkant van de neurale buis, zodat de embryonale middenhersenen gecentreerd zijn tussen de twee elektroden.

Druk eenmaal op de BTX-voetschakelaar en let op de luchtbellen die rond de elektroden ontstaan. Verwijder na elke succesvolle elektroporatie voorzichtig de elektroden uit het ei en veeg de elektroden schoon. Breng met een in 70% ethanol gedrenkt chem wipe opnieuw drie druppels pen-strep-oplossing aan op het embryo.

Dek het venster nu af met een stuk heldere verpakkingstape van vijf centimeter bij vijf centimeter. Verzegel het ei goed zonder de inhoud van het ei aan te raken en plaats de eieren terug in de incubator met de draaischijven uitgeschakeld. Wanneer het gewenste stadium is bereikt, worden de levende embryo's geoogst in een gemeenschappelijke, met PBS gevulde Petrischaal voor elke conditie.

Gebruik vervolgens een fluorescentiedissectiemicroscoop. Screen de geoogste embryo's op m cherry-expressie en breng positieve embryo's over naar individuele putjes van een 24-well plaat. Vul elk putje met 1 mL vers bereide 2% paraformaldehyde en incubeer gedurende drie uur bij 4 °C.

Was de gefixeerde embryo's 3 keer in PBS en plaats de embryo's in 15% sucrose totdat ze zinken bij equilibratie. Herhaal de equilibratie in 30% sucrose en bed de embryo's vervolgens in OCT; oriënteer de embryo's correct om optimale dwarsdoorsneden van het middenbrein te verkrijgen voor daaropvolgende analyses.

Bereid cryostaatcoupes van 18 micron dikte van het dikke middenbrein voor voor verdere analyse in de in ovo electroporatie-assay van het middenbrein van het embryonale kuiken hh. Kuikenembryo's in stadium 11 worden geïnjecteerd met een plasmidecocktail van de m cherry fluorescentiemarker en genen van belang, samen met een met fast green gekleurde tracker voor het injectieproces. Na electroporatie van het middenbrein worden de embryo's verder geïncubeerd en worden de m cherry positieve embryo's geoogst, gefixeerd en ingebed.

Vervolgens worden cryosneden van het middenbrein geprepareerd. Monsters van succesvol geïnjecteerde en geëlektroporeerde kiजembryo's worden geanalyseerd via immunokleuring met middenbreinmarkers, zoals tyrosinehydroxylase. mCherry-expressie is doorgaans zichtbaar in de regio van het middenbrein na verdere ontwikkeling, waarbij mCherry-expressie dient als injectiemarker.

Embryo's die een correcte m cherry-expressie vertonen, worden vervolgens gefixeerd, ingebed en georiënteerd om cryosneden van de middenhersenen te maken. Hier wordt de specificatie van het dopaminerge lot in geëlektroporeerde neurale progenitorcellen onderzocht door de colocalisatie van m cherry en het flag-getagde gen met de dopaminerge neuronmarkering tyrosinehydroxylase. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe genexpressie regionaal kan worden beperkt tot dopaminerge neuronprogenitoren in de embryonale middenhersenen, inclusief hoe DNA-constructen specifiek in de regio van de middenhersenen kunnen worden geïnjecteerd en hoe electroporatie nauwkeurig kan worden uitgevoerd met behulp van kleine, op maat gemaakte elektroden volgens deze procedure.

Andere methoden, zoals RNI-gemedieerde lockdown of expressie van enhancers die gekoppeld zijn aan reportergenen, kunnen worden gebruikt om genfunctie en genregulatie in specifieke regio's en celtypen van het zenuwstelsel te bestuderen.