Voorbereiden van T-cel groeifactor van Rat Splenocyten
31 oktober 2007
We beschrijven de voorbereiding van de T-cel groeifactor gebruikt voor de in vitro expansie van antigeen-specifieke T-lymfocyt rat lijnen.
Hallo, ik ben Christine Beaton. Ik ben assistent-onderzoeker in het lab van George Chen in het Departement Fysiologie en biofysica van de Universiteit van Californië in Irvine. En de komende twee dagen ga ik je laten zien hoe je TCGF kunt bereiden, wat staat voor T-celgroeifactor.
Dus voor onze dagelijkse celcultuur, wanneer we geen nauwkeurige kennis van de samenstelling van de cytokinen in het kweekmedium nodig hebben, gebruiken we T-celgroeifactor, wat S-supernatant is van spl CY-cultuur die de vereiste cytokinen bevat om de T-cellen te helpen uitbreiden. Dus de manier waarop we de TCGF bereiden is door gezonde Louis-ratten te doden, we nemen hun milt, bereiden een eencellige suspensie, verwijderen de rode bloedcellen door ze te lyseren, en dan gaan we de mononucleaire cellen stimuleren met con carnaval in a, wat de T-cellen gaat induceren om alle vereiste cytokinen voor hun groei te produceren. Om de TCGF te genereren, moeten we de cellen activeren.
Dus de manier waarop we het doen is dat we lectin conval in a, afgekort als corona A, aan onze celcultuur toevoegen. Dus wanneer we de conc in a aan onze celcultuur toevoegen, zal het zich binden aan het geglycosyleerd T-celreceptorcomplex en door zich tegelijkertijd aan verschillende complexen te binden, gaat het doen wat we capping noemen. Dus het gaat aggregeren, een cluster van alle receptoren op het oppervlak van de cel maken en dat gaat een activeringssignaal induceren in de T-lymfocyten.
Dus nadat de cellen geactiveerd zijn, gaan ze blasten. Dus ze gaan groter worden en dan gaan ze cytokinen gaan afscheiden. Dus oorspronkelijk dachten we dat TCGF voornamelijk interleukine twee was, maar we weten nu dat dat niet echt het geval is.
Het bevat ook interferon gamma TNF alfa en waarschijnlijk ook cytokinen in zeer kleine hoeveelheden die gewoon nodig zijn om cellen levendig te houden na 48 uur. In cultuur hebben de cellen alle cytokinen geproduceerd die we nodig hebben. Dus we gaan de cellen verwijderen en wanneer we de cellen hebben verwijderd en we hebben alleen nog de supernatant, hebben we nog steeds wat vrij conal in a in de snat. En dat gaat een probleem worden omdat we onze T-celgroeifactor echt willen gebruiken om T-cellijnen te laten groeien.
En als we de conval in a vrij laten, gaat het de cellen activeren wanneer we niet willen dat ze worden geactiveerd. Dus om dat probleem op te lossen, gaan we een overmaat van een suiker toevoegen die zich gaat binden aan alle vrije conc in a, in de ate. Dus het zal volledig worden geïnactiveerd en zich niet aan andere geglycoseerde receptoren op de cellen binden wanneer we de TCGF aan de cultuur toevoegen.
Dus laten we beginnen. De eerste stap voor dit experiment is om de milt uit de rat te halen direct na euthanisatie. Dus dat ga ik meteen doen met behulp van steriele instrumenten.
En zodra ik de milten eruit heb, ga ik ze in PBS zetten dat is aangevuld met antibiotica en als antibiotica gebruik ik penicilline en streptomycine. Dus laten we beginnen. Dus ik spuit de rat af met 70% ethanol om ervoor te zorgen dat ik geen enkele besmetting van mijn cultuur heb.
En dan ga ik met mijn instrumenten een kleine snede maken in de huid hier. Dan verwijder ik een laag spier en de milt verschijnt hier. Dus ik neem andere pincetten, ik trek de milt voorzichtig eruit zonder hem te beschadigen.
Ik verwijder het bindweefsel zoals dit. Dus nu heb ik een milt. Natuurlijk moet ik er erg voorzichtig mee zijn om niets anders in de buikholte te beschadigen omdat elke schade aan de darm zal leiden tot onmiddellijke besmetting van mijn milt.
En dan ga ik mijn milt overbrengen in een buisje met PBS plus antibiotica. En dit buisje houd ik op ijs. Dus nu heb ik de milten gehaald van drie ratten.
Dus we zijn klaar om te gaan en een eencellige suspensie van die milten te bereiden. Dus nu dat ik mijn milten heb, heb ik ze naar een weefselcultuur gehaald om een eencellige suspensie van hen te bereiden met behulp van 70 micron celtrainers. Dus ik heb verschillende dingen nodig om de eencellige suspensie van de milten te maken.
Ik heb steriele instrumenten nodig, een paar pincetten en een paar schaar. Dan heb ik de plunjer van een steriele één mil-spuit in het petrischaaltje. Ik ga mijn milten in PBS plus antibiotica zetten.
En in een ander petrischaaltje heb ik 70 micron celtrainer geplaatst in 10 milliliter PBS plus antibiotica. Dus de eerste stap is ervoor te zorgen dat de milten schoon zijn omdat zoals je hier kunt zien, er nog kleine stukjes bindweefsel zijn en ik ga ze verwijderen omdat ze de celtrainer erg snel zullen verstoppen. Dus daarvoor snijd ik gewoon af wat ik niet wil en gooi het weg in het deksel van het petrischaaltje.
Dus nu zijn mijn milten grotendeels schoon, dus ik ga de milten een voor een nemen, ze in de celtrainer doen en ze in kleine stukjes snijden En ik meng alle drie de milten. De volgende stap is om een eencellige suspensie te maken. Dus natuurlijk omdat ik alles sterieel wil hebben, raak ik de celtrainer helemaal niet aan en ik gebruik de plunjer van een steriele één mil-spuit om mijn stukjes milt door de celtrainer te persen.
En zoals je kunt zien aan de buitenkant van de celtrainer, wordt er een eencellige suspensie gemaakt. Dus de eerste keer dat ik nog wat kleine stukjes milt heb, maar ik ga de eencellige suspensie al verwijderen. Ik heb het al overgebracht naar een 50 mil-buisje dat ik op ijs heb bewaard.
En ik ga mijn celtrainer weer vullen met nog eens 10 mil PBS en antibiotica. Dus ik neem nog eens ongeveer 10 mil van mijn PBS met antibiotica, het hoeft niet erg nauwkeurig 10 minuten te zijn, we wassen gewoon. Ik doe het in de celtrainer en dan gebruik ik dezelfde procedure.
Ik ga terug naar mijn spuitplunjer en ik pers er nog een beetje doorheen. Dus natuur
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de bereiding van T cel groeifactor (TCGF) die wordt gebruikt voor de in vitro expansie van antigeen-specifieke rat T lymfocyten lijnen. Het proces omvat de verzameling en stimulatie van splenische mononucleaire cellen van gezonde ratten om de noodzakelijke cytokinen voor T cel groei te produceren.
Belangrijke studie componenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Cytokine onderzoek
Achtergrond
- T cel groeifactor is cruciaal voor T cel expansie in vitro.
- Gezonde ratten worden gebruikt als bron voor splenische cellen.
- Activering van T cellen is noodzakelijk voor cytokine productie.
- Begrip van TCGF kan helpen bij immunologisch onderzoek en therapieën.
Doel van studie
- Om de bereiding van TCGF voor T cel cultuur te demonstreren.
- Om een protocol te bieden voor onderzoekers om antigeen-specifieke T lymfocyten te expanderen.
- Om de belangrijkheid van cytokinen in T cel groei te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Verzameling van milten van gezonde Louis ratten.
- Bereiding van een enkele cel suspensie uit splenisch weefsel.
- Verwijdering van rode bloedcellen uit de suspensie.
- Stimulering van mononucleaire cellen met concanavalin A.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle activering van T cellen leidend tot cytokine productie.
- Bereiding van TCGF die T cel expansie ondersteunt.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode voor in vitro studies.
- Beschaving van een reproduceerbaar protocol voor onderzoekers.
Conclusies
- TCGF is essentieel voor de groei van antigeen-specifieke T lymfocyten.
- De beschreven methode is efficiënt en eenvoudig.
- Dit protocol kan onderzoek in immunologie en celbiologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Preparing T cell growth factor (TCGF) from rat splenocytes provides a cost-effective, cytokine-rich alternative to recombinant interleukin-2 for sustaining antigen-specific T cell lines in vitro. This approach supports mechanistic de-risking in early discovery by enabling reliable T cell expansion without exogenous cytokine bias, thereby improving predictive confidence in immunological assays. The method’s scalability and reproducibility make it suitable for integration into discovery workflows requiring consistent T cell culture conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of T cell-dependent therapeutic hypotheses by providing a physiological cytokine milieu for antigen-specific T cell maintenance.
- Operational Value: Reduces reliance on expensive recombinant cytokines, lowering reagent costs in target validation screens.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, cytokine-defined supernatants that support reproducible T cell proliferation assays.
- Operational Value: Facilitates assay scalability through large-batch preparation and long-term storage at -20°C.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports preclinical continuity by maintaining functional T cell lines for downstream efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Minimizes batch-to-batch variability in T cell culture, enhancing data consistency across translational experiments.
Pipeline & Workflow Integration
TCGF preparation fits within the discovery continuum from early T cell target validation through assay development to preclinical validation, where sustained T cell culture is required for functional readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing a native cytokine environment that avoids artificial polarization seen with IL-2 alone.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible T cell expansion outputs essential for hit confirmation and lead identification.
- Analytics: Enables measurement of cytokine-dependent proliferation as a functional readout for immunomodulatory compound screening.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by preserving T cell phenotype and function for mechanism validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytokine production platform applicable across multiple T cell–targeted projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in T cell–mediated responses.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined preparation and inactivation of residual mitogen.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by replacing costly cytokine cocktails with an in-house-produced alternative.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions by ensuring reliable T cell culture conditions across projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic tissue culture and rodent spleen processing.
- Depends on centrifugation, sterile filtration, and cell counting infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of mitogen inactivation using alpha methyl mannoside.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to different rat strains or species.
- Limited by the 48-hour cytokine production window and dependence on fresh splenocyte isolations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
10:23
Lysis of Red Blood Cells
0:00
Title
12:40
Preparing Splenocyte Culture
0:06
Introduction
17:53
Conclusion
1:13
TCGF Secretion
3:22
Harvesting Spleens from Lewis Rats
13:34
Elimination of the Conconavalin A
5:15
Preparing Single Cell Suspensions from Rat Spleens
