Name: Voorbereiden van T-cel groeifactor van Rat Splenocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T22:24:33.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Leer de bereiding van T-cel groeifactor uit rattensplenocyten voor immunologisch onderzoek. Deze methode stimuleert mononucleaire cellen met concanavaline A om cytokineproductie te induceren voor T-celcultuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li> Neem Lewis rat milt (ratten tussen de 160-200g zijn het beste). Dilacerate op ijs in een petrischaaltje met PBS + antibiotica (PBS-PS) met behulp van een cel zeef. In een 50 ml buis. Vullen met PBS-PS. </li><li> Spin gedurende 10 min bij 4 ° C om pellet de cellen. </li><li> Was de cellen twee keer. </li><li> Resuspendeer de pellet in NH 4 Cl 0,15 M (5 ml per milt). Meng voorzichtig en continu met een pipet gedurende 3 minuten op ijs om de erytrocyten lyseren. Vul de buis met medium. </li><li> Spin gedurende 10 min bij 4 ° C om pellet de cellen. </li><li> Was de cellen twee keer. </li><li> Tel de cellen. Een rat milt geeft 200 tot 250 miljoen cellen. </li><li> Zaad van de cellen op 2 miljoen per ml in compleet medium: 50 ml per 75 cm 2 kolf. </li><li> Laten groeien gedurende 48 uur in de incubator. </li><li> Spin 15 min bij 4 ° C om pellet de cellen. </li><li> Verzamel de supernatant, gooi de cellen. </li><li> Voeg toe 15 mg / ml een methyl mannoside aan het supernatant. Meng goed. </li><li> Filter (0,2 mm) </li><li> Aliquot en bewaar bij -20 ° C. Kunnen worden bewaard bij 4 ° C gedurende 10 dagen indien nodig. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. 166, 936-944 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockade+of+T+lymphocyte+K%2B+channels+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%2C+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad%22%5BJournal%5D)">Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).</li>
<li>Mor, F., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Lewis+rat+encephalitogenic+T+cell+lines%3A+T-cell-growth-factor+is+superior+to+recombinant+IL-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2.</a> J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

We bereiden TCGF van Lewis rat splenocyten, omdat we regelmatig naïeve ratten euthanaseren van deze stam tot de oogst serum en thymi om Lewis rat T-cel-lijnen te stimuleren in vitro. Dit TCGF kan gebruikt worden om de groei en overleving van T-cel-lijnen van de andere ratten stammen te bevorderen. TCGF kunnen ook worden bereid uit andere stammen van ratten.

Ter voorbereiding compleet kweekmedium het volgende toe te voegen aan een 500 ml fles van RPMI 1640 en steriel-filter: 10% FCS, 1 fles van PSG, 5 ml RPMI vitaminen; 5 ml natriumpyruvaat; 5 ml niet-essentiële aminozuren; 50 uM beta-mercapto-ethanol, 2 ug / ml Concanavaline A.

voorbereiden van t-cel groeifactor van rat splenocyten

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Onderhoud van antigeen-specifieke T-cellijnen of klonen in cultuur vereist rondes van antigeen-geïnduceerde activatie van elkaar gescheiden door fasen van celexpansie 1,2. Toevoeging van interleukine 2 tot en met de cultuur media tijdens de expansiefase nodig is om celdood te voorkomen en voldoende is om op korte termijn T-cel-lijnen te handhaven, maar is aangetoond dat Th1-polarisatie 3 te verhogen. Vervanging van interleukine-2 door T-cel groeifactor (TCGF), die een mix van cytokines bevat, is effectiever dan interleukine 2 het behoud op lange termijn T-cellijnen in vitro 3. Bovendien kan TCGF gemakkelijk worden bereid in grote hoeveelheden in het laboratorium en is veel goedkoper dan recombinant interleukine 2. Hier laten we zien hoe TCGF te bereiden van de rat splenocyten kweeksupernatanten. Voor deze procedure, oogsten we de milt van naïeve Lewis-ratten gedood voor de thymus en bloedafname. Wij bereiden single-cell schorsingen van de milt, Lyze de rode bloedcellen door osmotische schok, en zaad van de splenocyten in kweekmedium. De cellen worden gestimuleerd met Concanavaline A, een mitogeen dat niet-selectief activeert alle rat T-lymfocyten, het induceren van de productie van cytokines. De cultuur supernantant is 48 uur later verzameld andexcess Concanavaline A is gebonden aan alfa-methyl-mannoside om te voorkomen dat het activeren van T-cellijnen die TCGF zal worden toegevoegd. De TCGF wordt dan steriel gefiltreerd, gealiquoteerd, en opgeslagen bij -20 ° C.

We beschrijven de voorbereiding van de T-cel groeifactor gebruikt voor de in vitro expansie van antigeen-specifieke T-lymfocyt rat lijnen.

Voorbereiden van T-cel groeifactor van Rat Splenocyten

Het onderhouden van antigeenspecifieke T-cellijnen of -clonen in kweek vereist ronden van antigeen-geïnduceerde activatie, gescheiden door fasen van celexpansie 1,2. ...

Hallo, ik ben Christine Beaton. Ik ben assistent-onderzoeker in het laboratorium van George Chen bij de afdeling Fysiologie en Biofysica van de University of California in Irvine. In de komende twee dagen ga ik u laten zien hoe u TCGF bereidt, wat staat voor T-celgroeifactor.Voor onze dagelijkse celkweek, wanneer we geen precieze kennis nodig hebben van de samenstelling van de cytokinen in het kweekmedium, gebruiken we T-celgroeifactor (TCGF). Dit is het supernatant van een miltcelkweek die de benodigde cytokinen bevat om de T-cellen te helpen expanderen. De manier waarop we TCGF bereiden, is door de milten te nemen van gezonde Lewis-ratten nadat deze zijn gedood, een suspensie van enkelvoudige cellen voor te bereiden, de rode bloedcellen te verwijderen door middel van lyse, en vervolgens de mononucleaire cellen te stimuleren met concanavaline A, wat de T-cellen induceert om alle benodigde cytokinen voor hun groei te produceren. Om de TCGF te genereren, moeten we de cellen activeren.De methode die we gebruiken is dat we lectine ConA (afgekort als ConA) toevoegen aan onze celcultuur. Wanneer we ConA toevoegen aan de celcultuur, bindt dit aan het glycosyleerde T-celreceptorcomplex. D

preparing-t-cell-growth-factor-from-rat-splenocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ex vivo Uitbreiding van Tumor-reactieve T-cellen door middel van Bryostatin 1/Ionomycin en de Gemeenschappelijke Gamma Chain Cytokines Formulering

This video demonstrates the screening of immunomodulatory compounds via fluorescent-based assay. Transgenic mouse-derived T lymphocytes with green fluorescent protein expression cassettes are treated with these compounds. The enhanced and reduced GFP signals enable the identification of the compounds' stimulatory and inhibitory effects, respectively.

A Fluorescence-Based Assay Using Engineered Lymphocytes for Screening Immunomodulatory Compounds

The video showcases a flow cytometry-based assay for assaying immunodominance in cytotoxic T lymphocytes or CTL responses. Injected fluorescent target cells exhibit varying fluorescence corresponding to immunogenic epitopes. Post-spleen collection and sorting reveal a reduction in high-intensity fluorescent cells, confirming immunodominance in CTL responses.

An Assay to Evaluate Immunodominance in Cytotoxic T Lymphocyte Responses

De lymfodeletieve en immunomodulerende effecten van chemotherapie en stralingsstandaardzorg kunnen worden benut om de antitumor-effectiviteit van T-celimmunotherapie te verbeteren. We schetsen een methode voor het genereren van EGFRvIII-specifieke chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen en het toedienen ervan in de context van glioblastoma standaardzorg.

Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care

Hier presenteren we een protocol bij het opwekken van tolerantie in transplantatie, en beoordelen van in vitro en in vivo de onderdrukkende capaciteit van afzonderlijke cel subsets van de ontvanger en de immuunstatus van de ontvanger naar donor of exogene antigenen.

In Vitro en In Vivo beoordeling van T-, B- en myeloïde cellen onderdrukkende activiteit en humorale reacties van transplantatie ontvangers

Hier presenteren we een protocol voor het snel en reproducibly genereren van biologisch geïnspireerde, biologisch afbreekbare articifical antigeen presentatie van cellen (aAPC) met afstembare grootte, vorm en oppervlakte-proteïne presentatie voor T cel expansie ex vivo of in vivo .

Fabricage van anisotrope polymere kunstmatige antigeen presentatie van cellen voor CD8 + T cel activatie

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe rooster Light-Sheet Microscopie te gebruiken om vierdimensionaal visualiseren oppervlakte receptor dynamiek in levende cellen. Hier worden T-celreceptoren op CD4+ primaire T-cellen weergegeven.

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

Dit protocol biedt een in vitro co-kweekstrategie om de effecten van regulerende T-cellen op de proliferatie en differentiatie van effector T-cellen te onderzoeken.

In vitro Functionele analyse van regulerende T-cellen: Focus op proliferatie en differentiatie

Deze video toont twee werkwijzen voor het bereiden en het plaatsen van kralen, die zijn bekleed met groeifactor, op explantaten van de zich ontwikkelende cerebrale cortex. Deze kralen kunnen gebruikt worden om ruimtelijk beperkte genexpressie te induceren op het ontwikkelen van zenuwweefsel, zoals voorhersenen explantaten. Methoden worden gegeven voor gebruik van zowel Affi-Gel kralen en heparine acryl kralen.

Growth Factor-Coated Bead Plaatsing op Dorsale voorhersenen Explantaten

Leer de bereiding van T-cel groeifactor uit rattensplenocyten voor immunologisch onderzoek. Deze methode stimuleert mononucleaire cellen met concanavaline A om cytokineproductie te induceren voor T-celcultuur.

Voorbereiden van T-cel groeifactor van Rat Splenocyten

Meer video's verkennen