Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als

Het algemene doel van deze procedure is om een gehomogeniseerde cultuur van geïmmortaliseerde cerebrale endotheelcellen te verkrijgen. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen van neonatale muizen te isoleren en een enkelcellige suspensie te verkrijgen. De tweede stap is om de cellen te immortaliseren met polyoma middle T-antigeen.

Vervolgens groeien de cellen gedurende ongeveer vier weken totdat er een homogene endotheliale monolaag is gevormd. De laatste stap is het karakteriseren van de nieuwe cellijn met technieken zoals immunokleuring, Western blot en Q-Q-P-C-R. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van neuro-inflammatoire of ischemische hersenaandoeningen, aangezien preklinische therapeutische evaluaties en inzichten in de pathofysiologie kunnen worden verkregen.

De procedure wordt gedemonstreerd door Dr. Elaine Salvador, een postdoc uit mijn laboratorium. Nadat de hersenen zijn verwijderd uit een pasgeboren muis van drie tot vijf dagen oud en zijn overgebracht naar een Petrischaal met buffer A, zijn de hersenen van vijf tot 10 muizen nodig voor elke preparatie, waarbij wordt gewerkt in een laminaire flowkast. Verwijder het cerebellum, de hersenstam, de meningen en capillaire fragmenten uit elke hersenpreparatie.

Breng vervolgens de cerebrums over naar een tweede Petrischaal met buffer A. Gebruik een steriel scalpel om de cerebrums in kleine stukjes te snijden en gebruik daarna een pipet van 10 milliliter om het weefsel en de buffer te aspireren en uit te stoten totdat er geen klontjes meer zichtbaar zijn. Breng de suspensie op dit punt over naar een centrifugebuis van 50 milliliter, nadat het hersenweefsel is gecentrifugeerd bij 250 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en los het pellet op in 4,5 milliliter buffer A met 1,5 milliliter 0,75% w/v.

Voeg collagenase toe. Incubeer het weefsel en de collagenase-oplossing gedurende 45 minuten in een waterbad van 37 °C met af en toe agitatie. Bereid ondertussen de weefselkweekplaten voor door vier wells van een 12-well plaat te coaten met een steriele oplossing van 0,1 mg/mL.

Collageen en 50 millimolair azijnzuur zorgen ervoor dat het collageen bij kamertemperatuur gedurende één uur aan de wells hecht. Zodra de incubatieperiode van 45 minuten is verstreken, wordt de digestie van het hersenweefsel gestopt door 15 milliliter buffer A toe te voegen; resuspendeer het pellet grondig in deze oplossing. Centrifugeer vervolgens bij 250 ×g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.

Voeg vervolgens 10 milliliters steriele, 25% gewicht per volume B, s, A, en PBS toe aan het weefsel om myeline uit het preparaat te verwijderen en centrifugeer 20 minuten bij 1000 times G bij vier graden Celsius. Gooi na centrifugatie voorzichtig het supernatant weg, los het pellet vervolgens op in 15 milliliters buffer A en breng dit over naar een nieuwe 50 milliliter centrifugebuis; centrifugeer opnieuw 5 minuten bij 250 times G bij kamertemperatuur. Was ondertussen de met collageen IV gecoate plaat twee keer met PBS.

Laat na de tweede wasbeurt twee van de wells leeg en voeg twee milliliter groeimedium toe aan de andere twee wells. Resuspendeer na het verwijderen van het supernatant het celpellet, dat hoofdzakelijk uit endotheelcellen bestaat, in vier milliliter groeimedium bevatten met vier microgram per milliliter puromycine, en plaatst twee milliliter van de celsuspensie in elk van de twee lege, met collageen gecoate wells; incubeer 45 minuten bij 37 °C om snel hechtende niet-endotheelcellen te doden. Aspireer vervolgens het groeimedium uit de twee wells die geen cellen bevatten en gooi dit weg.

Overbreng vervolgens het medium met de niet-adherente cellen, inclusief de fractie endotheelcellen, naar deze twee putjes. Vul de vorige putjes opnieuw aan met twee milliliters vers medium. Deze putjes bevatten andere celtypen, zoals fibroblasten en astrocyten, en kunnen parallel worden gekweekt en gebruikt worden voor morfologische vergelijkingen.

Incubeer de cellen de volgende dag overnacht in de weefselkweekincubator. Vervang het medium door vers medium en kweek de GPE neo-fibroblasten, die een replicatie-deficiënt virus met het polyoma middle T-oncogen uitscheiden, in met gelatine gecoate flessen met GPE neo-medium. Transfectie met het Polyoma middle T-oncogen zorgt voor een groeivoordeel van endotheelcellen ten opzichte van niet-endotheelcellen, wat leidt tot een homogene monolaag van cellen met een endotheelmorfologie. Na vier tot zes weken kweek; GPE neo-cellen zijn niet commercieel verkrijgbaar en kunnen worden verkregen als gedeeld publiek materiaal.

Nadat de GPE Neo Fiberblast 24 uur zijn gegroeid, verwijdert u 10 milliliter van het medium en voegt u steriele poly brain-oplossing toe tot een eindconcentratie van acht microgram per milliliter. Filtreer het supernatantmengsel door een 0,45 micron filter om eventuele cellulaire fragmenten te verwijderen. Aspireer nu het medium uit de endotheliale celculturen en voeg, na een nacht incuberen, twee milliliter van het supernatant poly brain-mengsel toe aan de wells.

Herhaal deze procedure de volgende dag met een nieuw aliquot van het supernatant poly brain-mengsel. Verwijder het supernatant poly brain-mengsel. Was de cellen tweemaal met PBS en voeg vervolgens vers groeimedium toe.

Vervang elke drie dagen het groeimedium voortaan. Wanneer de cellen confluent worden, worden ze één tot twee keer overgezet op collagen IV-gecoate platen. Stabiele cerebrale endotheelcellijnen worden doorgaans verkregen na vier tot vijf weken opeenvolgende cultuur.

Wanneer een homogene endotheliale monolaag de gehele put vult. Zodra de stabiele cellijnen zijn verkregen, worden de cellen overgebracht naar weefkweekflessen gecoat met collageen IV; passageer de cellen niet vaker dan eens per week met trypsine met drie milliliter trypsine-EDTA en incubatie bij 37 °C gedurende vijf tot 15 minuten totdat de cellaag is gedispergeerd. Na toevoeging van vijf milliliter medium worden de nieuwe flessen gezaaid; vermijd een splitsingsratio hoger dan 1:4.

Zodra er voldoende cellen zijn om een confluente T 75-fles te verkrijgen, kunnen cryo-aliquots van de cellen worden klaargemaakt voor later gebruik. Om dit te doen, worden de cellen zoals voorheen met trypsine geoogst, waarna de celsuspensie vijf minuten lang wordt gecentrifugeerd bij 250 ×g. Bij kamertemperatuur wordt de celpellet geresuspendeerd in zes milliliter vriesmedium, waarna 1,5 milliliter van de celsuspensie in vier cryovials wordt gepipetteerd.

Plaats de cryovials in een Nalgene-vriescontainer gevuld met isopropanol en bewaar deze gedurende één dag bij -80 °C. Bewaar de cryovials vervolgens onder vloeibare stikstof. Ontdooi de cryovials met cellen in een waterbad en breng ze daarna over naar een centrifugebuis van 15 milliliter met 10 milliliter groeimedium.

Verwarm het medium voor tot 37 °C en centrifugeer de buis 5 minuten bij 250 ×g bij kamertemperatuur. Na het aspireren van het medium wordt het pellet resuspenderen in een geschikt volume groeimedium. Breng de celsuspensie over naar een met collageen IV gecoate T25-celkweekfles met voorverwarmd groeimedium.

De celdichtheid voor het uitplaten moet ten minste 1 × 10⁴ cellen per milliliter zijn. Vervang het medium de volgende dag en ga door met het passeren van de cellen zoals voorheen; wanneer de cellen na ongeveer vijf dagen confluentie bereiken, kunnen ze worden uitgeplaatst bij de gewenste dichtheid voor de daaropvolgende experimenten. De C-end-cellen werden gekarakteriseerd door immunokleuring van endotheliale markers en markers voor de bloed-hersenbarrière.

Deze afbeelding toont de morfologie van C- en cellen die immunokleuring ondergingen voor clain vijf. De C- en cellen hebben een morfologie die vergelijkbaar is met primaire culturen van hersen-ECS, met monolagen van dichtgepakte, langgerekte cellen die groeiremming vertoonden. Bij volledige confluentie vertoonden de cellen detecteerbare niveaus van clain.

Hier zijn de C CN-cellen immunogekleurd met een antilichaam tegen occludine. Hier zien we de expressie van VE-cadherine-eiwitten, die gelokaliseerd zijn bij de cel-celverbindingen, eveneens aangetoond via immunofluorescentiekleuring. De transendotheliale elektrische weerstand werd gemeten met een opstelling bestaande uit elektroden voor stroomdoorgang en spanningsmeting.

Uit deze figuur kan worden opgemaakt dat de trans-endotheliale elektrische weerstand van C end-cellen na de ontwikkeling toeneemt met de tijd in cultuur. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappen om cerebrovasculaire aandoeningen in een muismodel te bestuderen.