Name: Inductie van Adhesie-afhankelijke signalen met behulp van lage-intensiteit ultrageluid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer hoe laag-intensieve gepulseerde ultrasoon fibroblasten stimuleert om focale adhesievorming en Rac1-activering te induceren. Deze methode helpt onderzoekers fysieke manipulatie van cellen te verkennen als vervanging voor chemische stimuli.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Wellcome Trust subsidie ​​088.419 aan MDB en sponsoring door Smith &amp; Nephew Verenigd Koninkrijk Ltd

1. Coating Oppervlakken met Matrix Ligand <ol><li> Ultrasound worden toegepast om cellen in 3,5 cm putten, als individuele schotels of een 6-wells plaat. Voor biochemische assays, jas ligand direct op het plastic. Voor immunofluorescentie, kook dekglaasjes drie keer in MilliQ water en plaats 4 dekglaasjes in de bodem van elk putje. </li><li> Glazen oppervlakken moeten gederivatiseerd efficiënte ligand coating garanderen. Los sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester in PBS met 1 mM. 2 ml in elk putje en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de gederivatiseerd oppervlakken 3 maal met PBS. </li><li> Laag of gederivatiseerde glas of kunststof met onbehandelde integrine ligand. Breng 2 ml van 10 ug / ml integrine ligand9, opgelost in PBS met Ca2 + en Mg2 + in elk putje en incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Bereid monoparticulate BSA door verhitting 1% BSA, opgelost in PBS, tot 85 ° C gedurende 13 minuten. Toestaanafkoelen; passeren door een 0,45 pm-filter. </li><li> Was ligand gecoate oppervlakken 3 maal met PBS en blok met monoparticulate BSA voor 30 minuten. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Cellen <ol><li> Om de matrix milieu tijdens het experiment te controleren, eiwitsynthese geblokkeerd door toevoeging van 25 ug / ml cycloheximide 80% confluent fibroblasten 2 uur. </li><li> Spoel cycloheximide-behandelde cellen met PBS en los te maken van de cultuur fles met behulp van 0,5 mg / ml trypsine / EDTA. </li><li> Harvest vrijstaande cellen door centrifugeren bij 500x g gedurende 5 minuten. </li><li> Hersuspenderen cellen in DMEM/25 mM HEPES, 25 ug / ml cycloheximide. </li><li> Tel celdichtheid van de suspensie met een hemocytometer en verdun tot 105 ml-1. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 20 minuten oppervlakte integrine herstellen. </li><li> Spoel ligand beklede, BSA-geblokkeerde putjes drie keer met PBS. </li><li> Zaad 2 ml van de celsuspensie in elk putje. </li><li> Allow cellen gedurende 2 uur verdeeld bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> 3. Echografie Stimulatie <ol><li> Verwarm de ultrasone zender array en koppeling gel tot 37 ° C. </li><li> Breng een grootte van een erwt klodder gel koppelen aan elke zender. </li><li> Test dat elke zender functioneel is met behulp van een echo-indicator diode detector. </li><li> Plaats de putten op de zender array. Terug array 37 ° C, 5% CO2 en laat de temperatuur tot evenwicht 10 minuten. </li><li> Schakel de ultrasone signaal. </li><li> De ultrasone signaal uit te schakelen na 20 minuten, het nabootsen van de therapeutische regime. Als kortere tijden stimulatie vereist zijn, moet platen worden verwijderd uit de matrix op het juiste tijdstippen. In alle gevallen gebruik ongestimuleerde platen als negatieve controle. </li></ol> 4. Focal adhesion Analyse door Immunofluorescentie <ol><li> Voor de analyse van focale adhesie vorming, gelden de 20-minuten echo-signaalen laat structuren een verdere 40 minuten ontwikkelen handhaven cellen bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Zuig media en vast cellen door toepassing van 2 ml 4% paraformaldehyde in PBS. Incubeer gedurende 14 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig paraformaldehyde en spoel drie keer met PBS, waarbij de PBS voorzichtig langs de rand van de put generatie afschuifkrachten te voorkomen. </li><li> Overdracht elk dekglaasje van de 3,5 cm en een 24-wells plaat voor latere immunofluorescentie kleuring. </li><li> Doof resterende paraformaldehyde door toepassing 0,5 ml 0,1 M glycine in PBS elk van de 24 putjes. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig glycine en spoel drie keer met PBS. </li><li> Permeabilise cellen door toepassing van 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w / v) in PBS. Incubeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig Triton X-100 en spoelen drie keer met PBS. </li><li> Blok door toepassing 0,5 ml 3% (w / v) BSA in PBS. Incubeer overnacht bij 4 &amp; dbv; C. </li><li> Stain vinculine-bevattende focal adhesion met hVIN-1 antilichaam verdund 1:400 in BSA blok. Incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel drie keer met PBS. </li><li> Breng fluorofoor (DyLight 488)-geconjugeerd secundair antilichaam (verdund 1:200) en de vlek actine met TRITC-geconjugeerde phalloidin (verdund 1:200) in BSA blok. Gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel drie keer met PBS, en een keer met water. </li><li> Monteer op een glasplaatje in een omgekeerde positie met behulp van Verleng Gold inbedmiddel. </li></ol> 5. Kwantificering van Rac1 Activering door Pull-down test <ol><li> Voor analyse van Rac1 activering toepassen 20 minuten ultrasoon signaal cellen bij 37 ° C, 5% CO2. Bij de beoordeling responstijden langer dan 20 minuten, de ultrasone signaal op 20 minuten bij 37 cellen handhaven ° C, 5% CO2 gedurende de resterende tijd om de reactie te ontwikkelen. </li><li> Zuig media en plaats goeds op ijs. Spoel putten met 2 ml koude PBS en aspiratie. Zorg ervoor dat alle resterende PBS wordt verwijderd door het verlaten van putten gekanteld gedurende 1 minuut, gevolgd door een grondige aspiratie. </li><li> Lyseren cellen op ijs en 35 ul lysisbuffer (10% glycerol, 20 mM Hepes, pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 x volledige protease inhibitor) per well. In dit voorbeeld worden 6 wells die per tijdstip 210 pi cellysaat genereren. Meer of minder uitsparingen kunnen worden gebruikt, maar totaal lysaat volume moet totale ~ 200 pi. </li><li> Schraap cellen grondig met celschraper om volledige cellysis te garanderen en putten laten kantelen gedurende 1 minuut, zodat lysaat te bundelen. </li><li> Overdracht lysaat een ijskoude 1,5-ml microfugebuis (pooling lysaten van dezelfde behandeling regime) en de spin op 21000 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C tot pellet cellulaire puin. </li><li> Breng 180 ul van lysaat aan ijskoude 1,5-ml microfugebuisje buizen met 130 pl van lysis buffer en 25 pi PAK-glutathione agarose parels 10. Houd resterende ruwe lysaat bij -20 ° C voor latere gel gescheiden. </li><li> Leg actief Rac1 op de PAK-glutathion agarose parels door het draaien van buizen gedurende 40 minuten bij 4 ° C. </li><li> Oogst agarose kraal conjugaten door centrifugatie bij 2000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C. </li><li> Was de kraal conjugaten drie keer met 500 ul lysis buffer, het oogsten van kralen door centrifugeren bij 2000 x g en de teruggooi supernatant na elke wasbeurt. Verwijder voorzichtig het resterende lysis wasbuffer met een 200 ul pipet. </li><li> Elueren elk monster door toevoeging 35 pl SDS-PAGE laadbuffer en incuberen bij 85 ° C op een schudden verwarmingsblok gedurende 5 minuten. Verwijder de kralen door centrifugatie bij 21.000 xg gedurende 1 minuut. </li><li> Los kraal eluaat door SDS-PAGE, overdracht naar nitrocellulose en peil Rac1. </li></ol> 6. Representatieve resultaten In dit protocol beschrijven we de inductie van vinculine-vleked focale adhesies en Rac1 activiteit door echografie. Voor de focal hechting experiment de uitgangspositie dat fibroblasten uitgespreid op een ligand van α 5 β 1 integrine niet vinculine bevattende adhesies (Fig. 3A) vormen, tenzij een tweede fibronectine receptor, syndecan-4, die door toevoeging van oplosbare ligand (Fig. 3B) 3,4. Echter, stimulatie met echografie induceert focal adhesion vorming in dezelfde mate als engagement van syndecan-4 (fig. 3C), wat aangeeft dat echografie stimulatie kan vervangen voor bepaalde onderdelen van de fibronectine-afhankelijke signaalweg 5. De sleutel hindernis met dit protocol is het verwijderen van focal adhesion vorming in de afwezigheid van stimulerende middelen. Onvolledige remming van de eiwitsynthese door cycloheximide zal matrix depositie die voldoende is om de cellen te automatisch stimuleren. Overbevolking van de cellen kan ook leiden tot low-level focal adhesion FORMATIEn en een slechte reactie op echografie als overspraak tussen de cel-cel en cel-matrix contacten zullen bemoeilijken een experiment dat is ontworpen om een ​​stimulans te isoleren. Als een ontwikkeling van de basis assay tonen we hetzelfde experiment herhaald met fibroblasten ontbreekt syndecan-4 (Fig. 4). Deze fibroblasten nog steeds reageren op de echografie (fig. 4C), maar niet om te reageren op syndecan-4 ligand (Fig. 4B). Het experiment met behulp van Sdc4 - / - fibroblasten laat zien dat echografie inderdaad omzeilen de behoefte aan bepaalde fibronectine-receptoren, en illustreert hoe de eenvoudige protocol kan worden ontwikkeld om extra informatie over de signaalweg te krijgen. Voor de biochemische experiment tonen we aan dat echografie kan de activering van Rac1 induceren, met behulp van een pull-down test, die een aanpassing van de methode beschreven door Del Pozo et al.. 10. Precipitatie van actieve Rac1 0, 10, 30 en 60 minuten na inidifferentiatie van ultrageluid stimulatie blijkt dat Rac1 activiteit pieken op 10-30 minuten, voordat hij terugkeerde naar de basislijn (afb. 5). Blotting ruwe lysaten voor vinculine zorgt voor gelijkwaardige belasting tussen de tijdstippen. Het resultaat lijkt op activering van Rac1 door inschakeling van syndecan-4 3, maar is iets langduriger dan activering door fibronectine. Daarom 8-10 herhalingen normaal nodig is om significante gegevens plaatsvindt. Activering van Rac1 is verantwoordelijk voor de inzet van cellen om focale adhesie vorming en opkomende focale adhesies beginnen te vormen op 10-30 minuten, die samenviel met Rac1 activering. Eenmaal in gang wordt de adhesie verder groeien tot grote adhesie plaques de figuren 3 en 4. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> Figuur 1. Echo golfvorm. Echografie bestaat uit een onderbroken 1,5 MHz signaal dat door de lage amplitude (30 mW / cm &lt;sup&gt; 2, ruimtelijke gemiddelde, temporele gemiddelde) heeft geen verwarming effect. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische weergave van de workflow voor de voorbereiding en het stimuleren van de cellen met echografie. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> Figuur 3. Ultrasound inductie van focale adhesie vorming in fibroblasten. Fibroblasten uitgestreken op de integrine-bindende fragment van fibronectine (A) voor stimulatie met syndecan-4-bindend fragment van fibronectine (B) of ultrasoon (C). Na 60 minuten stimulatie werden de cellen gefixeerd, gekleurd vinculine en actine, en afgebeeld op epifluorescente. Bar = 10 urn. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> Figuur 4. Ultrasound inductie van focale adhesie vorming in fibroblasten ontbreekt syndecan-4. <em&gt; Sdc4 - / - fibroblasten uitgestreken op de integrine-bindende fragment van fibronectine (A) voor stimulatie met syndecan-4-bindend fragment van fibronectine (B) of ultrasoon (C). Na 60 minuten stimulatie werden de cellen gefixeerd, gekleurd vinculine en actine, en afgebeeld op epifluorescente. Hoewel Sdc4 - / - fibroblasten waren fibronectine-ongevoelig, echografie nog steeds veroorzaakt focal adhesion formatie, waaruit blijkt dat echografie omzeilt matrix receptor engagement. Bar = 10 urn. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> Figuur 5. Activering van Rac1 door echografie. Cellen werden gestimuleerd 0, 10, 30 en 60 minuten met 6 putjes gebruikt per tijdstip. De hoeveelheid GTP-Rac1 in monsters uit een Rac1 pull-down assay tijdsverloop werd gevisualiseerd door incubatie met anti-Rac1 antilichaam op een Western blot (bovenste afbeelding). Kwantificering van de band intensiteit (gemiddelde van 8-10 herhalingen) blijkt verhoogd Rac1 eenctivity als gevolg van echo-signaal op 10 en 30 minuten, voordat hij terugkeerde naar de uitgangswaarden na 60 minuten (grafiek). Error bars geven sem

<ol><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li>
<li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li>
<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li>
<li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li>
<li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li>
<li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li>
<li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive%2C+low-intensity+pulsed+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li>
<li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific%2C+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter%2C+prospective%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li>
<li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li>
<li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII%2FIIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li>
</ol>

Andrew Harrison is een medewerker van Smith &amp; Nephew Britse Limited.

In dit protocol beschrijven we de wijze waarop een behandeling die gewoonlijk wordt gebruikt voor humane patiënten kunnen worden gebruikt in cel-gebaseerde experimenten. Het uiteindelijke doel is om het moleculaire mechanisme van ultrasound actie te begrijpen, zodat de therapie kan worden verfijnd. In dit protocol gebruiken we muis embryonale fibroblasten (MEF) als een model mobiele systeem, maar echografie is ook gevonden effectief te zijn in primaire menselijke voorhuid fibroblasten 5, mesenchymale stamcellen, osteoblasten en chondrocyten 6. We gebruiken Rac1 activering voorbeeld biochemische assay, maar de werkwijze kan worden gebruikt zowel voor regeling van eiwitfosforylering of vorming van eiwit-complexen door immunoprecipitatie testen. Voor de immunofluorescentie voorbeeld tonen we een effect ultrageluid op focal adhesion vorming, maar herverdeling van elk molecuul kunnen worden onderzocht. Zo kon men de aanwerving van cytosolische factoren te toetsen aan de plasmamembraan, colocalisation van proteins in de handel blaasjes of onderzoeken van het effect van ultrageluid op mitotische spindel organisatie. Tot nu toe hebben we ons beperkt tot fibronectine afhankelijke trajecten testen door de werking van ultrageluid op cellen op collageen, of in aanwezigheid van groeifactoren kunnen worden getest het opbouwen van een beeld van ultrageluid invloed celgedrag in een complexe omgeving meer veel lijkt op een in vivo situatie. Een grotere uitdaging zal zijn om het effect van ultrageluid met behulp van time-lapse imaging, waar de aanwezigheid van de zender het lichtpad en trillingen het blokkeren van de echografie huidige aanvullende technische obstakels te testen. Echter, het feit dat de therapeutische toepassing op slechts 20 minuten van de stimulatie per dag in beslag suggereert dat analyse van cel gedrag na een uitbarsting van stimulatie kan ook productief te zijn.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> sulfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide ester </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> 25 mM bestanden in water opgelost worden opgeslagen bij -20 ° C </td></tr><tr><td> 6-well weefselkweek plaat </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td> Plastic van andere bedrijven kan jas slecht </td></tr><tr><td> 13-mm glas dekglaasje </td><td> Scientific Laboratory Supplies Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> Glas van andere bedrijven kan jas slecht </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Ca2 + Mg2 + </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K integrine ligand (fibronectine fragment) </td><td> Construct beschrijving en prebereiding van 9, 11 </td><td></td><td> Alternatief matrix liganden kunnen worden gebruikt om andere routes ondervragen </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma </td><td> C7698 </td><td> Kunnen worden opgeslagen als 10mg/ml voorraad in het water </td></tr><tr><td> DMEM/25 mM HEPES </td><td> Sigma </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Exogene 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Echografie koppeling gel </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS indicator </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Sigma </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-geconjugeerd anti-muis </td><td> Stratech Wetenschappelijk </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-gelabelde phalloidin &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Verleng Gold antifade reagens </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> volledige protease-remmer (EDTA gratis) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × voorraad opgebouwd uit tablet bewaard bij -20 ° C </td></tr><tr><td> PAK-glutathion agarose parels </td><td> Construct beschrijving en de voorbereiding op de 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Visser </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Apollo Scientific </td><td> BI8181 </td><td> Maak 1M voorraad en pH tot 7,4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Visser </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Sigma </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdeoxycholaat </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

inductie van adhesie-afhankelijke signalen met behulp van lage-intensiteit ultrageluid

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

In meercellige organismen, wordt cel gedrag bepaald door interacties met de extracellulaire matrix. Gevolgen van matrix-betrokkenheid variëren van regulatie van cel-migratie en proliferatie, om afscheiding en zelfs differentiatie. De signalen onderliggende elk van deze complexe voortkomen uit de moleculaire interacties van extracellulaire matrix receptoren op het oppervlak van de cel. Integrinen zijn de prototypische receptoren en een mechanische koppeling tussen extracellulaire matrix en het cytoskelet, en het initiëren enkele hechting afhankelijk signaleringscascades. Wordt echter steeds duidelijker dat extra transmembraanreceptoren functioneren naast de integrinen zowel de integrine zelf en signalen stroomafwaarts regelen. De meest elegante van deze voorbeelden is de transmembraan proteoglycanen, syndecan-4, die met α 5 β 1-integrine werkt tijdens de hechting aan fibronectine. In vivo modellen demonstraten het belang van syndecan-4 signalering, zoals syndecan-4-knockout muizen vertonen genezing vertraging te wijten aan inefficiënte fibroblast migratie 1,2. In de wild-type dieren, wordt de migratie van fibroblasten in de richting van een wond veroorzaakt door de verschijning van fibronectine die lekken uit de beschadigde haarvaten en wordt afgezet door macrofagen in beschadigd weefsel. Daarom is er grote belangstelling voor het ontdekken van strategieën die fibronectine-afhankelijke signalering te verbeteren en te versnellen kunnen herstelprocessen. De integrine gemedieerde en syndecan-4-gemedieerde componenten van fibronectine afhankelijke signalering kan worden gescheiden door het stimuleren van cellen met recombinante fibronectine fragmenten. Hoewel integrine betrokkenheid is essentieel voor celadhesie, worden bepaalde fibronectine-afhankelijke signalen gereguleerd door syndecan-4. Syndecan-4 activeert het Rac1 stuwend signaal 3, zorgt ervoor dat integrine herverdeling 1, triggers werving van het cytoskelet moleculen, zoals vinculine, aan focaladhesies 4 en veroorzaakt daarbij richting migratie 3. We hebben gezocht naar alternatieve strategieën voor het activeren van deze signalen en vond dat een lage intensiteit gepulseerd ultrageluid (LIPUS) kunnen de effecten van syndecan-4 betrokkenheid 5 na te bootsen. In dit protocol beschrijven we de wijze waarop 30 mW / cm 2, 1,5 MHz ultrageluid gepulseerd bij 1 kHz (fig. 1) kan worden toegepast fibroblasten in kweek (fig. 2) Rac1 activering en focal adhesievorming induceren. Ultrasound stimulatie wordt toegepast maximaal 20 minuten, de combinatie van parameters is gevonden het meest doeltreffend voor het versnellen van klinische breuk reparatie 6. De methode maakt gebruik van recombinante fibronectine fragmenten aan α 5 β 1-integrine, gaan zonder engagement van syndecan-4, en vereist remming van de eiwitsynthese door cycloheximide tot afzetting van extra matrix te blokkeren door de fibroblasten., Het positieve effect of ultrageluid op herstelmechanismen is goed gedocumenteerd 7,8, en door het begrijpen van de moleculaire werking van ultrageluid in de cultuur moeten we in staat zijn om de therapeutische techniek te verfijnen om de klinische resultaten te verbeteren.

Dit protocol beschrijft de stimulatie van de gekweekte fibroblasten met een lage-intensiteit gepulseerd ultrageluid, die focal adhesion vorming en Rac1 activering door het nabootsen van betrokkenheid van de transmembraan-receptor matrix, syndecan-4-drives. Deze benadering maakt het onderzoek van een succesvolle klinische techniek op cellulair niveau, waardoor het bieden van mogelijkheden voor verfijning van de therapie.

Inductie van Adhesie-afhankelijke signalen met behulp van lage-intensiteit ultrageluid

In meercellige organismen wordt het celgedrag bepaald door interacties met de extracellulaire matrix. De gevolgen van matrixbinding variëren van ...

Het algemene doel van deze procedure is het begrijpen van de moleculaire mechanismen waarmee laagintensieve gepulseerde echografie of lipo de celmigratie beïnvloedt en daarmee weefselherstel versnelt. Dit wordt bereikt door de cellen eerst twee uur te behandelen met cycloheximide om de novo eiwitexpressie en daarmee de autostimulatie van cellen te voorkomen. De tweede stap van de procedure is het uitplaten van losgekoppelde cellen gedurende twee uur op oppervlakken die zijn gecoat met een zorgvuldig gedefinieerd matrixligand.De derde stap is het stimuleren van de cellen met ultrasone golven door de celkweekplaten via een gelkoppeling te verbinden met de ultrasone emitters. De resultaten kunnen veranderingen in de vorming van focale adhesies tonen als gevolg van ultrasone stimulatie via het kleuren van cellen voor culline en actine, evenals temporele veranderingen in de activatie van RAC1 via een actieve RAC1 pull-down assay en daaropvolgende western blotting. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van adhesiesignalering, zoals de vraag of fysieke manipulatie van cellen een alternatief kan bieden voor chemische stimuli zoals groeifactoren of fibrinegenine.En hoe initieert die fysieke manipulatie de celmigratie? De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van chronische wonden, omdat we door het begrijpen van de manier waarop ultrasone geluiden het celgedrag kunnen beïnvloeden, in staat kunnen zijn om behandelingen te verfijnen om de wondsluiting te versnellen bij personen met wondgenezingsdefecten, zoals oudere of diabetische patiënten. Voor biochemische assays worden de wells van plastic platen van 3,5 centimeter direct gecoat met integrine-ligand.Kook voor immunofluorescentie glazen dekglasjes drie keer in Milli-Q water. Plaats vervolgens vier dekglasjes in elke plaat van 3,5 centimeter. Derivatiseer de glazen dekglasjes om een efficiënte ligandcoating te waarborgen door twee milliliter 1 millimolair sulfa-MBS aan elke well toe te voegen; laat de reactie 30 minuten lang verlopen bij kamertemperatuur en was de gederivatiseerde oppervlakken daarna drie keer met PBS. Coat de gederivatiseerde glazen nu met twee milliliter integrine-ligand.Voeg het ligand toe aan elke well en incubeer de platen een nacht bij vier graden Celsius. Bereid de volgende dag monoparticulaire BSA door 1% BSA, opgelost in PBS, 13 minuten lang te verhitten tot 85 graden Celsius. Laat dit afkoelen en filtreer het vervolgens door een 0,45 micron filter. Was eerst de met ligand gecoate oppervlakken drie keer met PBS en blokkeer vervolgens de oppervlakken gedurende 30 minuten met de bereide monoparticulaire BSA.Om de matrixomgeving gedurende het experiment te beheersen, moet de eiwitsynthese worden geblokkeerd door de toevoeging van 25 µg/mL cycloheximide aan 80% conflvente fibroblasten gedurende twee uur. Spoel de met cycloheximide behandelde cellen met PBS, tel de cellen en centrifugeer de cellen tot een pellet. Resuspendeer de cellen in A-D-M-E-M-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 10.000 cellen/mL met behulp van een hemocytometer.Incubeer de geresuspendeerde cellen nu gedurende 20 minuten bij 37 °C. Spoel de plaatjes vervolgens drie keer met PBS voordat u 2 mL van de celsuspensie in elk plaatje aanbrengt. Laat de cellen twee uur lang uitspreiden bij 37 °C, 5% CO2. Begin vervolgens met het voorverwarmen van de ultrasone emitter-array en de koppelingsgel.Zodra deze zijn opgewarmd, brengt u een erwtgroot druppeltje koppelingsgel aan op elke emitter om te testen of elke emitter functioneel is. Gebruik een diode-detector voor ultrasone indicatie en laat de gel de emitter met de detector koppelen. Als de emitter functioneel is, zal de DDE oplichten.Het apparaat heeft vaste instellingen en levert ultrasone golven van 1,5 megahertz gepulseerd op één kilohertz, met een intensiteit van 30 milliwatt per vierkante centimeter. Het apparaat schakelt na 20 minuten automatisch uit. Plaats de wells op de emitterarray, plaats de array terug in een incubator en laat de temperatuur 10 minuten equilibreren; schakel vervolgens het ultrasone signaal in bij de stroomvoorziening.Het ultrasone signaal wordt na 20 minuten gedeactiveerd. Boots het therapeutische regime na als kortere stimulatietijden vereist zijn. Platen kunnen op het juiste tijdstip uit de array worden verwijderd.Voor langere stimulatietijden moeten de platen op de array blijven staan om zich te kunnen ontwikkelen. De emitter zou opnieuw kunnen worden opgestart, maar we hebben geen aanvullend voordeel geconstateerd wanneer we dit hebben gedaan. In alle gevallen moeten ongestimuleerde platen als negatieve controle worden gebruikt.Pas voor de analyse van de vorming van focale adhesies gedurende 20 minuten een ultrasoon signaal toe op met S gecoate dekglasplaatjes, en incubeer deze vervolgens nog 40 minuten bij 37 °C. Dit geeft de focale adhesies de tijd om zich te ontwikkelen. Aspireer daarna het medium weg.Voeg twee milliliters fixatief toe en wacht 14 minuten. Verwijder het fixatief door aspiratie en spoel de cellen voorzichtig drie keer met PBS. Breng de PBS langs de rand van het welltje aan en laat de oplossing voorzichtig verspreiden.Nadat ze schoon zijn gespoeld, wordt elk dekglas vanuit het well van 3,5 centimeter overgebracht naar een 24-well plaat voor daaropvolgende immunofluorescentiekleuring. Na de gewenste stimulatieperiode wordt het medium afgezogen en worden de cellen gespoeld met PBS op ijs en gelyseerd in de passende lysisbuffer voor de door u gekozen biochemische assay. Wij analyseren typically één activatie via een effector pull-down assay.In het bijzonder kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van elke signaleringsroute. In dit protocol beschrijven we de inductie van vinky en gekleurde focale adhesies en RAC one-activiteit door middel van ultrasone golven voor de experimenten met focale adhesies. De uitgangspositie is dat fibroblasten die zijn verspreid op een ligand van alpha vijf beta one integrine geen finkel-bevattende adhesies vormen, tenzij een tweede fibroïne-verbindende receptor syndicate vier wordt geactiveerd door toevoeging van een oplosbaar ligand.Stimulatie met ultrasone golven induceert echter de vorming van focale adhesies in dezelfde mate als de activering van syncom four, wat aangeeft dat ultrasone stimulatie een vervanging kan zijn voor bepaalde componenten van de fibrin neck independence-signaalroute. Als uitbreiding van de basisassay tonen we hetzelfde experiment dat is herhaald met fibroblasten waarin INDICUM four ontbreekt. Deze fibroblasten reageren nog steeds op ultrasone golven, maar reageren niet op het INDICUM four-ligand.Dit toont aan dat ultrasone golven inderdaad de noodzaak voor bepaalde vezel- en receptorbindingen kunnen omzeilen. Voor het biochemische experiment tonen we aan dat ultrasone golven de activatie van RAC1 kunnen induceren met behulp van een pull-down assay; precipitatie van actief RAC1 na 0, 10, 30 en 60 minuten na aanvang van de ultrasone stimulatie onthult dat de RAC1-activiteit piekt tussen 10 en 30 minuten voordat deze terugkeert naar de basislijn. Blotting van ruwe lysaten voor culline waarborgt een gelijkmatige belading tussen de tijdspunten.Het resultaat vertoont gelijkenissen met de activatie van RAC one door betrokkenheid van syndicate four, maar is iets langduriger dan activatie door fibronectine. Daarom zijn doorgaans acht tot 10 herhalingen nodig om significante gegevens te verkrijgen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om extra stimuli uit te sluiten door de eiwitsynthese volledig te blokkeren met cyclo heide, verontreiniging van het cultuurmedium in het experiment te voorkomen en overbevolking van cellen te vermijden die leiden tot cel-celcontacten na deze procedure.Andere methoden, zoals scratch-woundassays, kunnen worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: hoe initieert ultrasone behandeling celmigratie?

induction-of-adhesion-dependent-signals-using-low-intensity-ultrasound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Insonation van microbellen is een veelbelovende strategie voor tumor ablatie op kortere gemiddelde akoestische bevoegdheden, alsmede voor de gerichte toediening van geneesmiddelen. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van low duty cycle echografie pulserende strategieën en nanocarriers aan niet-thermische microvasculair ablatie en laadvermogen levering aan subcutane C6 glioma te maximaliseren.

Contrast Echografie doelgerichte behandeling van gliomen in Muizen via Drug-Bearing Nanodeeltje Levering en microvasculaire Ablation

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

Selectieve schade aan menselijke leukemiecellen kan worden bereikt door middel van een nieuwe aanpak van het toepassen van laagfrequente echografie, zowel met als zonder chemotherapeutische voorbehandeling van leukemische en normale hematopoietische cellen.

Generatie en kwantitatieve analyse van Pulsed Low Frequency Ultrasound om de Sonic Gevoeligheid van Onbehandelde Bepaal en behandeld neoplastische cellen

Dit protocol blijkt de controleerbaar nucleatie van cavitatie in gel fantomen, door middel van gelijktijdige blootstelling aan zowel de nabij-infrarood gepulste laser licht en de hoge intensiteit geconcentreerd ultrageluid (HIFU). De activiteit van cavitatie kan vervolgens worden gebruikt voor het verbeteren van de beeldvorming en/of therapeutische toepassingen van HIFU.

Beheersbare nucleatie van cavitatie van Enterprise gouden nanodeeltjes voor het verbeteren van hoge intensiteit gericht echografie toepassingen

Dynamische wrijvingscoëfficiënt van immune cellen aan de vaatwand is een voorwaarde voor gut homing. Hier presenteren we een protocol voor een functionele in vitro assay voor de analyse van de impact van anti-integrine antilichamen, chemokines of andere factoren op de dynamische cel adhesie van menselijke cellen, met addressin beklede haarvaten.

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Low-Intensity Pulsed echografie stimulatie (LIPUS) is een modaliteit voor niet-invasieve mechanische stimulatie van endogene of gemanipuleerde cellen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. In dit artikel wordt beschreven hoe implementeren van LIPUS om een epi-fluorescentie Microscoop en minimaliseren van akoestische impedantie mismatch langs het pad van de echografie om te voorkomen dat ongewenste mechanische artefacten.

Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie

Het gepresenteerde experimentele protocol kan worden gebruikt om real-time metingen uit te voeren van cavitatieactiviteit in een celkweekapparaat met als doel onderzoek mogelijk te maken naar de voorwaarden die nodig zijn voor een succesvolle medicijnafgifte en/of andere bio-effecten.

Cavitatie verbeterde therapie bestuderen

Een snelle en betrouwbare techniek wordt voorgesteld om de vormoscillaties van een enkele, gevangen akoestische bel te regelen die is gebaseerd op coalescentietechniek tussen twee bellen. De steady-state, symmetrie-gecontroleerde bubbelvormoscillaties maken analyse mogelijk van de vloeistofstroom die wordt gegenereerd in de buurt van de belinterface.

Inductie van microstreaming door niet-bolvormige bubbeloscillaties in een akoestisch levitatiesysteem

Near-UV-lithografie en tractiekrachtmicroscopie worden gecombineerd om cellulaire krachten op microgepatterde hydrogels te meten. De gerichte licht-geïnduceerde afgifte van enkele cellen maakt een groot aantal metingen op hetzelfde monster mogelijk.

Controle van celhechting met behulp van Hydrogel-patroontechnieken voor toepassingen in tractiekrachtmicroscopie

Verstoring van de bloed-ruggenmergbarrière (BSCB) kan met succes worden bereikt met de intraveneuze toediening van microbellen en de toepassing van gefocusseerde echografie met lage intensiteit (LIFU). Dit protocol beschrijft de opening van de BSCB met behulp van LIFU in een knaagdiermodel, inclusief het opzetten van apparatuur, injectie van microbellen, lokalisatie van het doelwit en visualisatie van BSCB-verstoringen.

Verstoring van de bloed-ruggenmergbarrière met behulp van gefocusseerde echografie met lage intensiteit in een rattenmodel

Dit protocol beschrijft een fixatiesysteem voor ultrasone transducers dat speciaal is ontworpen voor ultrasone stimulatie van het ruggenmerg bij wakkere muizen. De methode maakt gebruik van een fixatiesysteem om een nauwkeurige positionering van de ultrasone transducer te garanderen en tegelijkertijd de proefpersonen vrij te laten bewegen zonder de precisie van de stimulatie in gevaar te brengen.

Fixatie van ultrasone transducers voor neuromodulatie van het ruggenmerg bij muizen

Leer hoe laag-intensieve gepulseerde ultrasoon fibroblasten stimuleert om focale adhesievorming en Rac1-activering te induceren. Deze methode helpt onderzoekers fysieke manipulatie van cellen te verkennen als vervanging voor chemische stimuli.

Inductie van Adhesie-afhankelijke signalen met behulp van lage-intensiteit ultrageluid

Meer video's verkennen