Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren en lokaliseren van belangrijke translationele pauzesites voor een mRNA dat is vertaald in een celvrij translatiesysteem. Dit wordt bereikt door eerst het gen van belang te kloneren onder controle van een T7-transcriptionele promotor. Vervolgens wordt het mRNA getranscribeerd en gezuiverd.

Vervolgens wordt in vitro translatie uitgevoerd in aanwezigheid van mRNA en radioactieve aminozuren om het gesynthetiseerde eiwit en de nascente polypeptiden te labelen. Ten slotte worden de polysomen geïsoleerd middels sedimentatiesnelheidscentrifugatie, waarna de geïsoleerde nascente ketens worden gescheiden via gelelektroforese. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via Tristine SDS-page en autoradiografie nascente polypeptiden van verschillende lengtes aantonen, wat wijst op de aanwezigheid van pauzesites langs het betreffende mRNA.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals de micro cocal nucleus protection assay, is dat deze extreem eenvoudig, snel en efficiënt is, en het mogelijk maakt om de belangrijkste translatie-postsites langs elk mRNA in een bepaald cel-riscosysteem te bepalen en te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele kernvragen op het gebied van translatie en translationele eiwitvouwing, zoals de wijze waarop factoren zoals codongebruik, mRNA-overvloed en/of de mRNA-secundaire structuur de kinetiek van de translatie kunnen beïnvloeden. Deze methode kan bovendien ons begrip vergroten van de relaties tussen de kinetiek van de translatie en de cruciale stappen in het pad van code-translatie en eiwitvouwing.

De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot het begrijpen van het proces van eiwitvouwing in vivo, waarvan algemeen wordt aangenomen dat dit co-translationeel plaatsvindt tijdens de translatie op het ribosoom, hoewel de huidige studie celvrije translatie van gamma-crystalline betreft met gebruik van een commercieel verkrijgbaar celextract. Deze techniek kan ook worden toegepast om translationele IDE's te identificeren in potentieel elk eiwit, door gebruik te maken van een translatiecompetent extract bereid uit elke willekeurige cellulaire bron. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben met twee cruciale stappen van het protocol.

Ten eerste is er het vaststellen van de totale tijd die nodig is voor het translatie-reactieproces, om ervoor te zorgen dat de meeste nascente polypeptiden gebonden blijven aan het ribosoom. Ten tweede is er het vinden van een geschikt zuiveringssysteem om de meerderheid van de nascente polypeptiden te isoleren; de keuze van het zuiveringssysteem hangt af van de grootte van het bestudeerde eiwit. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we midden in de jaren tachtig besloten de translationele kinetiek van globine-moleculen te onderzoeken in relatie tot het voorgestelde model van de COT-translatie-vouwing van globine.

De niet-uniformiteit van de globine-translatie werd voor het eerst opgemerkt door PRO en Maurice in 1974 bij het gebruik van grootte-uitsluitings-CLO-chromatografie van de globine NAS-ketens. Hun analyse beschikte echter niet over de gewenste precisie; Pro en Maurice observeerden vier belangrijke translatie-pauzesites tijdens de translatie van het globine. Vervolgens stelde onze analyse ons in staat om ongeveer 10 aanvullende pauzesites te onthullen en een gedetailleerd model van de translationele globine-vouwing op te stellen. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de hier beschreven techniek de isolatie van polysomen en de analyse van nascente polypeptiden met behulp van Tri S Ds page-gel omvat.

Beide stappen zijn cruciaal voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige en reproduceerbare resultaten. De demonstratie van het protocol zal worden uitgevoerd door een promovendus van het laboratorium van Sujata voor in vitro transcriptie van messenger RNA. Begin met een gen van belang dat is gekloond onder een T7- en/of een SP6-promotor; lineariseer het DNA-sjabloon met een geschikt restrictie-enzym stroomafwaarts van het stopcodon en/of het 3'-uiteinde van het mRNA.

Een monster van de restrictiedigestie wordt onderworpen aan gelelektroforese om te verifiëren dat het DNA volledig is gelineariseerd. Nadat de optimale DNA-templateconcentratie is bepaald, wordt een transcriptiekit gebruikt om messenger RNA in vitro te transcriberen volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik vervolgens lithiumchloride-precipitatie om het mRNA te zuiveren.

Gebruik vervolgens acrylamide- of agarosegelelektroforese om de zuiverheid ervan te verifiëren. Bereid een in vitro translatie-reactie van 100 µL voor in nucleasevrij water door een mengsel van 1 mM aminozuren zonder methionine, 10 units RNA-remmer, 20 µCi radioactief 35 S methionine en konijnreticulocytlysaat toe te voegen. Warm de reactie vervolgens voor door deze vijf minuten te incuberen bij 30 °C.

Voeg vervolgens 2 µg mRNA toe en incubeer vijf minuten bij 30 °C om de reactie te stoppen; plaats het mengsel op ijs om de aan de ribosomen gebonden nascente polypeptiden te isoleren. Laag de translatie-reactie bovenop 4,5 mL 30% glycerol in Tris-HCl pH 7,6 met kaliumchloride en magnesiumchloride en centrifugeer dit met een TLA 110-rotorcentrifuge bij 100.000 ×g gedurende één uur bij 4 °C. Verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant en resuspendeer het polysomale pellet dat de nascente polypeptiden bevat in een klein volume 1 mM Tris-HCl buffer pH 7,6 met 0,5 mg/mL ribonuclease A en incubeer dit 30 minuten bij 37 °C.

Om de hydrolyse van de peptide-tRNA-esterbinding te versnellen, voegt u natriumhydroxide toe aan de reactie tot een uiteindelijke concentratie van 10 millimolar en incubeert u deze gedurende nog eens 30 minuten. Scheid de ontstane polypeptiden via tris-tris-SDS-PAGE en fixeer en droog vervolgens de gels. Onderwerp de gels aan autoradiografie, gevolgd door fosforimaging voor de detectie van de ontstane polypeptiden.

Veranderde ribosoombeweging, veroorzaakt door wijzigingen in de tRNA-pool, zou moeten leiden tot veranderingen in de distributie van de groottes van nascent polypeptiden die zich tijdens de translatie ophopen, alsoals in hun relatieve intensiteiten, die de duur van de pauze op die positie weerspiegelen. Nascent polypeptiden voor het gamma B-crystalline eiwit werden geïsoleerd en gescheiden via Tristine-SDS-PAGE. De niet-identieke lengtes en intensiteiten van de polypeptiden in de RRL- en E. coli-systemen wijzen erop dat de beweging van ribosomen langs het mRNA in deze twee systemen verschillende translatiekinetiek volgt.

Let bijvoorbeeld op de prominente band van 17,7 kilodalton in het E. coli-lysaat, die niet aanwezig is in het konijn-reticulocytenlysatenstelsel. Gamma-B-kristalline bevat tandem arginine-codons die frequent voorkomen in zoogdierensystemen, maar waarvan bekend is dat ze extreem zeldzaam zijn en traag worden vertaald in E. coli; dit suggereert dat deze band wordt veroorzaakt door ribosoompauzes bij deze tandem zeldzame codons, zoals hier wordt getoond.

Er kunnen geen banden worden waargenomen bij afwezigheid van mRNA en behandeling met puromycine verwijdert de meeste nascente ketens uit het polysoom. Bovendien verwijdert langdurige behandeling met puromycine alle nascente ketens, wat bevestigt dat de waargenomen polypeptideproducten ribosoom-geassocieerde nascente ketens zijn en geen MRP's die co-sedimenteren met het polysoom. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één tot twee dagen worden uitgevoerd. De duur van de procedure hangt voornamelijk af van de duur van de centrifugatiestap en de stap van gel-elektroforese van de nascente peptiden.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de translatie-reactie onmiddellijk na de incubatietijd te stoppen. Om te voorkomen dat het beginnende polypeptide van het ribosoom wordt losgelaten, is het cruciaal om RNA-contaminatie in elke stap te vermijden. RNA-contaminatie kan de translatie-efficiëntie van het extract beïnvloeden en leiden tot het loslaten van het beginnende polypeptide van het ribosoom na het volgen van deze procedure.

Andere doelen, zoals bijvoorbeeld de effecten van mRNA-bindende eiwitten op de efficiëntie van de ribosoombeweging op een bepaald bericht, kunnen na de ontwikkeling ook worden getest. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van eivouwplooiing om de rol van translationele pauzes, veroorzaakt door de aanwezigheid van zeldzame codons, in translationele eiwitvouwing te onderzoeken. Deze techniek is eerder gebruikt om de rol van kaon-substituties op de ribosoombeweging op een bericht en op translationele eiwitvouwing te testen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u translationele actieve sites in gepresenteerd mRNA kunt identificeren door nascent polypeptiden die aan ribosomen gebonden zijn te isoleren. Vergeet niet dat het werken met radioactieve isotopen en gelabelde aminozuren, zoals bijvoorbeeld [35S]-methionine, speciale voorzorgsmaatregelen vereist en dat deze altijd in acht moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.