Name: Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden In vitro Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Leer hoe u ribosoomgebonden nascente polypeptiden isoleert om translationele pauzeplaatsen op mRNA te identificeren met behulp van in vitro-translatie en SDS-PAGE-analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door Human Frontier Science Program subsidie ​​RGP0024.

1. DNA Template Voorbereiding en in vitro transcriptie <ol><li> Het gen van belang wordt gekloneerd onder T7 en / of bijvoorbeeld SP6 transcriptionele promoter. </li><li> Voor in vitro transcriptie het template-DNA wordt gelineariseerd met een geschikte restrictie-enzym snijden achter het stopcodon ORF en / of mRNA 3 &#39;uiteinde. Men moet volledig linearisatie van het plasmide DNA te controleren door uitvoering van de restrictiedigestie product agarosegelelektroforese. </li><li> De gelineariseerde plasmide wordt gebruikt voor in vitro transcriptie reactie. Verschillende concentraties van template DNA kan worden getest om optimale DNA vereiste concentratie in vitro transcriptie identificeren. Algemeen met MEGAscript hoog rendement Ambion de transcriptiekit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 pg lineair DNA geeft 40-60 ug mRNA. In vitro transcriptie plaats volgens instructies van de fabrikant (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> Naar aanleiding van in vitro transcriptie het mRNA wordt gezuiverd door middel van lithium chloride neerslag volgens de fabrikant instructie (MEGAscript High Ambion het rendement Transcription Kit). </li><li> mRNA integriteit verder onderzocht door elektroforese op acrylamide of agarose gels. </li></ol> 2. In vitro Cell Vertaling Voor de in vitro translatie met R abbit R eticulocyte Lysate, RRL (Promega, Madison, WI) Volg de onderstaande stappen: <ol><li> Bereid 100 pi in het instructieboek van vitro translatie reactie na de fabrikant. Kortom, toe te voegen in nuclease gratis water 2 pl aminozuurmengsel min methionine (1 mm), 10 eenheden van RNase-remmer (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 pCi van radioactieve [35 S]-methionine (MP Biomedicals, Solon, OH), 70 pi van konijn reticulocyten lysaat (Promega, Madison, WI). </li><li> Incubeer ee reactie bij 30 ° C gedurende 5 min warm de vertaling reactie vooraf. Voeg 2 ug mRNA de vertaling reactie en incuberen bij 30 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Stop de reactie door plaatsen van de vertaling reactie op ijs. </li></ol> 3. Isolatie van Nascent Polypeptiden van in vitro translatie Reaction <ol><li> Op beginnende polypeptide gebonden aan ribosomen (polysoompeptiden) isoleren wordt vertaling reactie lagen op 4,5 ml 30% glycerol in 10 mM Tris-HCl buffer pH 7,6, bevattende 100 mM KCl, 10 mM MgCI 2 en gecentrifugeerd bij 100.000 x g een TLA-110 rotor (Beekman Coulter, Inc Brea, CA) gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> De supernatant wordt verder zorgvuldig verwijderd. </li><li> De polysomal pellet met nascent Polypeptiden wordt geresuspendeerd in een volume (10-15 ul) van 1 mM Tris-HCl buffer pH 7,6, 0,5 mg / ml ribonuclease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) en geïncubeerd 30 min bij 37 ° C. Omde hydrolyse van de peptidyl-tRNA esterbinding vergroten wordt NaOH toegevoegd tot een eindconcentratie van 10 mM en de incubatie wordt gedurende nog eens 30 minuten. </li></ol> In vitro translatie reactie gemonteerd zonder mRNA en bij dezelfde omstandigheden (gevolgd door isolatie van opkomende peptiden zoals beschreven) zou vormen een belangrijke controle. Behandeling van de vertaling reactie (s) vóór het onderwerpen van het puromycine extract dichtheid gradiënt centrifugatie kunnen dienen als extra controle. 4. Het oplossen van de ontluikende polypeptide op Tris-tricine SDS-PAGE <ol><li> De geïsoleerde ontluikende Polypeptiden worden opgelost en geanalyseerd op Tris-tricine SDS-PAGE. Let op: de hoeveelheid van het materiaal geladen op de gel zal afhankelijk van de efficiëntie van eiwitten etikettering, de efficiëntie op eiwit vertaling en vele andere parameters. De hoeveelheid geladen materiaal moet empirisch worden aangepast aan de bes zodatt visualisatie en de scheiding van de individuele ontluikende polypeptide ketens. </li><li> Na elektroforese gels zijn bevestigd, gedroogd onder vacuüm gel verver en aan autoradiografie. De verdeling van de ontluikende Polypeptiden worden waargenomen met behulp van phosphoimaging. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Bovine Gamma-B crystalline vertaald in Rabbit reticulocyten lysaat en in E. coli S30 Extract Systems (Promega, Madison, WI), gevolgd door isolatie van opkomende polypeptideketens. Figuur 1 toont stappen los van ribosoom gebonden beginnende ketens. In deze studie was het doel te testen als veranderende milieu van vertaling ie repertoire van tRNA (bekend onder zeer uiteenlopende in zoogdieren (RRL) en prokaryotische (E. coli) systemen gevolg zijn van verschillen in codon voorkeur tussen organismen) kan veranderen ribosoom beweging langs mRNA en hebben effect op de verdeling van de vertaling pauze sites.Gewijzigde ribosoom beweging moet leiden tot veranderingen in de verdeling van de grootte van opkomende Polypeptiden accumuleren in vertaling alsmede de relatieve intensiteit. Relatieve intensiteit van de banden door de duur van de pauze. De opkomende Polypeptiden werden geïsoleerd en opgelost in 16,5% T, 6% C Tris-tricine SDS PAGE (figuur 2). Gamma-B crystalline een 20 kDa eiwit. De waarneming van ontluikende Polypeptiden van niet-identieke lengte en intensiteit in RRL en E. coli systemen geeft aan dat de beweging van ribosomen langs mRNA in beide systemen verschillende vertaling kinetiek volgt. Zo zagen we een prominente band van 17,7 kDa in E. coli lysaat en niet RRL systeem, wat suggereert dat er een extra translatie pauze site in het 3&#39;-uiteinde regio mRNA (codering C-terminale gebied van Gamma B crystalline), wanneer deze vertaling in E. coli systeem. Wij merken op dat Gamma-B crystalline havens tandem Arg codons (AGG 153 en AGA 154) die frequent in zoogdiersystemen, maar staan ​​bekend als zeer zeldzaam langzaam vertaald in E. coli. Een nieuwe groeiend peptide dat zich in E. coli-systeem (~ 17,7 kDa figuur 2.2) wordt waarschijnlijk veroorzaakt door ribosoom te pauzeren op deze tandem zeldzame codons. Let geen banden worden waargenomen in de afwezigheid van mRNA (figuur 2.3) en puromycine behandeling verwijdert meeste opkomende kettingen polysomen (figuur 2.3). Langdurige behandeling met puromycine (&gt; 15 min) verwijderen de ontluikende ketens (gegevens niet getoond). Dit bevestigt dat de waargenomen polypeptide producten zijn ribosoom bijbehorende ontluikende kettingen, in plaats van mRNPs cosedimenting met polysomen. Zoals hierboven vermeld, codon bias organisme en weefselspecifiek. Het representatief voorbeeld hier beschreven, geeft duidelijk aan dat het veranderen van de omgeving van de vertaling wil zeggen repertoire van tRNA&#39;s / codonvertekening kan leiden tot een verandering beweging van ribosoom langs het mRNA. Uiteraard kunnen deze eenvoudige techniek niet alleen mogelijk de identificatie van de translationele pauze plaatsen langs mRNA, maar maakt ook snelle vergelijking van de vertaling pauze plaatsen tussen verschillende systemen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische over de stappen die betrokken zijn bij het ​​isoleren van ribosoom gebonden ontluikende Polypeptiden. Bovine Gamma-B crystalline ORF volgorde (528 baseparen) is stroomafwaarts van T7-promotor gekloneerd in pBSKS +. Voor in vitro transcriptie de template DNA werd gelineariseerd door behandeling met EcoRI. Lineair template werd gebruikt voor in vitro transcriptie. T7 promoter in DNA-template herkend door T7-RNA-polymerase dat stroomafwaarts Gamma-B crystalline gen overschrijft. mRNA wordt gezuiverd met lithiumchloride precipitatie. Het gezuiverde mRNA wordt gebruikt voor in vitro translatie. Volgendincubatie vertaling reactie lagen op 30% glycerol oplossing en gecentrifugeerd gedurende 1 uur bij 4 ° C bij 100.000 x g om ribosoom gebonden opkomende Polypeptiden geïsoleerd. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4026/4026fig2.jpg" /> Figuur 2. Isolatie van Bovine Gamma-B-crystalline ontluikende Polypeptiden vertaald in Rabbit reticulocytentelling Lysate (RRL) en E. coli lysaat. 2 ug mRNA werd gemengd met 100 pi reactiemengsel RRL of E. coli S30 Extract System (Promega, Madison, WI) volgens de instructies van instructies van 20 pCi [35S]-methionine en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 5 minuten. Na incubatie vertaling reactie lagen op 4,5 ml 30% glycerol in 10 mM Tris-HCl buffer pH 7,6, bevattende 100 mM KCl, 10 mM MgCI 2 en gecentrifugeerd gedurende 1 uur bij 4 ° C en 100.000 x g in een TLA-110 rotor (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA). De geïsoleerde polyribosome pellet was resubesteedde in 20 pi 1 mM Tris-HCl pH 7,6, 0,5 mg / ml ribonuclease A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) gevolgd door behandeling met NaOH (zoals beschreven in het protocol sectie). Ontluikende polypeptiden werden opgelost op 16,5% T, 6% C Tris-Tricine SDS PAGE gel. De gel werd gedroogd en blootgesteld autoradiografie. Na blootstelling van de gel werd gescand met behulp van Typhoon Imaging GE Healthcare&#39;s Scanner. In figuur 2.1 is de gel met ontluikende Polypeptiden geïsoleerd en opgelost na vertaling reacties op twee verschillende systemen (RRL en E. coli). Figuur 2.2 De gel werd geanalyseerd door Image Quant TL ., v2005 software en hier gebruikt als voorbeeld om aan te tonen dat de moleculaire gewicht en de intensiteit van de ontluikende Polypeptiden zich ophopen in twee systemen kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd en vergeleken met Figuur 2.3 toont twee sets van de controles: ontluikende Polypeptiden geïsoleerd en opgelost op SDS-PAGE na vertaling reacties werden verzameldzonder mRNA en / of na de vertaling reacties werden behandeld met puromycine (5 min laatste conc. 1 mM) voor de reactie werd onderworpen aan centrifugeren.

<ol><li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli%2C+Bacillus+subtilis%2C+Saccharomyces+cerevisiae%2C+Schizosaccharomyces+pombe%2C+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens%3B+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221(2006).</li>
<li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li>
<li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides%2C+evidence+for+pause+localization+sites%2C+and+a+cotranslational+protein-folding+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li>
<li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li>
<li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+translation+of+%CE%B3+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system%3A+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li>
<li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth%2C+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li>
<li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li>
<li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22silent%22+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498(2011).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Voor reproduceerbare resultaten kwaliteit en de concentratie van de componenten die in vitro transcriptie en translatie reacties kritisch zijn. In de huidige studie hebben we gebruik hebben gemaakt van commercieel verkrijgbare kits en extracten die zeer reproduceerbare gegevens te verstrekken, indien zorgvuldig behandeld. Echter, vertaling-competent extracten worden bereid uit de cel van een keuze, indien nodig. Kwaliteit van mRNA kan invloed hebben op de vertaling, dus het is van het grootste belang om de inte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / Kit </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 High yield transcriptiekit </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> Ribonucleaseremmer </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Ribonuclease-A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091 </td></tr><tr><td> Konijn reticulocytentelling Lysate System, Nuclease behandeld </td><td> Promega </td><td> L4960 </td></tr><tr><td> E. coli S30 Extract System voor lineaire Templates </td><td> Promega </td><td> L1030 </td></tr><tr><td> Centrifugeren </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima TLX Ultracentrifuge </td></tr><tr><td> Opslag fosfor autoradiogramy </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 variabele modus imager </td></tr><tr><td> Software voor ontluikende polypeptide-analyse </td><td> GE Healthcare </td><td> Image Quant TL, v2005 </td></tr></tbody></table>

isolatie van ribosoom bound nascent polypeptiden<em&gt; in vitro</em&gt; om translationeel pauze plaatsen langs mrna identificeren

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

De snelheid van translationeel rek is niet uniform. mRNA secundaire structuur, codongebruik en mRNA bijbehorende eiwitten kunnen ribosoom beweging te wijzigen op het bericht voor review zie 1. Echter, het is nu algemeen aanvaard dat synoniem codon-gebruik is de belangrijkste oorzaak van niet-uniforme translationeel rek tarieven 1. Synoniem codons worden niet gebruikt met dezelfde frequentie. Een voorkeur bestaat in het gebruik van synoniem codons enkele codons vaker gebruikt dan andere twee. Codon bias is organisme en weefsel-specifieke 2,3. Bovendien frequentie codongebruik is recht evenredig met de concentratie van verwante tRNA 4. Zo zal een veel gebruikte codon hogere massa overeenkomstige tRNA, die verder betekent dat vaak codon harder dan een zeldzame een vertaald. Zo zal de regio&#39;s op mRNA verrijkt met zeldzame codons (potentiële pauze sites) te vertragen in de regel naar beneden ribosoom beweging op de Message en de oorzaak accumulatie van ontluikende peptiden van de respectievelijke maten 5-8. Deze pauze sites kunnen functionele impact hebben op de eiwitexpressie hebben, mRNA stabiliteit en het vouwen van eiwitten voor review zie 9. Er werd aangetoond dat het verlichten van deze pauze sites ribosoom beweging te wijzigen op mRNA en vervolgens kan de efficiëntie van co-translationele (in vivo) eiwitvouwing 1,7,10,11 beïnvloeden. Om het proces van eiwitvouwing in vivo begrijpen in de cel, die uiteindelijk is gekoppeld met de werkwijze van de eiwitsynthese is het noodzakelijk volledig inzicht in het effect van codongebruik / tRNA inhoud van de beweging van ribosomen langs mRNA tijdens translatie elongatie . Beschrijven we een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om grote vertaling onderbreken plaatsen voor een bepaalde mRNA vertaald in verschillende celvrije systemen 6-8 vinden. Deze procedure is gebaseerd op de isolatie van ontluikende Polypeptiden accumulating van ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA. De reden is dat bij lage frequenties codons, de toename van de verblijftijd van de ribosomen resultaten in grotere hoeveelheden beginnende peptiden van de overeenkomstige afmetingen. In vitro getranscribeerde mRNA gebruikt voor in vitro translatie reacties in aanwezigheid van radioactief gemerkt aminozuren de detectie van de beginnende ketens mogelijk. Om ribosoom gebonden beginnende polypeptide complexen isoleren vertaling reactie lagen op 30% glycerol oplossing gevolgd door centrifugatie. Nascent Polypeptiden in polysomal pellet verder behandeld wordt met ribonuclease A en opgelost door SDS-PAGE. Deze techniek kan eventueel worden gebruikt voor een eiwit en laat analyse van ribosoom beweging langs mRNA en de detectie van de grote pauze sites. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan factoren en omstandigheden die ribosoom beweging kan dus veranderen en mogelijk kan ook veranderen e bestuderene functie / conformatie van het eiwit.

Een techniek om translationeel pauze sites op mRNA te identificeren wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op isolatie van beginnende Polypeptiden ophopen op ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA, gevolgd door de grootte analyse van de ontluikende ketens met een denaturerende gelelektroforese.

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

De snelheid van translationele elongatie is niet uniform. De secundaire structuur van het mRNA, het codongebruik en mRNA-geassocieerde eiwitten kunnen de beweging van het ribosoom op het ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren en lokaliseren van belangrijke translationele pauzesites voor een mRNA dat is vertaald in een celvrij translatiesysteem. Dit wordt bereikt door eerst het gen van belang te kloneren onder controle van een T7-transcriptionele promotor. Vervolgens wordt het mRNA getranscribeerd en gezuiverd.Vervolgens wordt in vitro translatie uitgevoerd in aanwezigheid van mRNA en radioactieve aminozuren om het gesynthetiseerde eiwit en de nascente polypeptiden te labelen. Ten slotte worden de polysomen geïsoleerd middels sedimentatiesnelheidscentrifugatie, waarna de geïsoleerde nascente ketens worden gescheiden via gelelektroforese. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via Tristine SDS-page en autoradiografie nascente polypeptiden van verschillende lengtes aantonen, wat wijst op de aanwezigheid van pauzesites langs het betreffende mRNA.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals de micro cocal nucleus protection assay, is dat deze extreem eenvoudig, snel en efficiënt is, en het mogelijk maakt om de belangrijkste translatie-postsites langs elk mRNA in een bepaald cel-riscosysteem

isolation-ribosome-bound-nascent-polypeptides-vitro-to-identify

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een belangrijke belemmering voor de biochemische analyses van de ribosomen met ontluikende peptidyl-tRNA's is de aanwezigheid van andere ribosomen zijn in dezelfde monsters, ribosomen niet betrokken bij de vertaling van de specifieke mRNA-sequentie worden geanalyseerd. We ontwikkelden een eenvoudige methode om uitsluitend te zuiveren,, de ribosomen met de ontluikende peptidyl-tRNA van belang.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA&#39;s voor functionele en structurele analyses

We beschrijven hier een techniek die nu standaard wordt gebruikt om stabiel gebonden ribosoom ontluikende keten complexen (RNC) te isoleren. Deze techniek maakt gebruik van de ontdekking dat een 17 aminozuur lange SecM "arrestatie sequentie" kan vertaling rek halt toe te roepen in een prokaryotische...

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Hier beschrijven we een werkwijze veranderingen in de initiatie van mRNA translatie van eukaryote cellen in reactie stresssituaties analyseren. Deze methode is gebaseerd op de snelheid scheiding op sucrosegradiënten vertalen ribosomen van niet-translating ribosomen.

Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling

Dit protocol illustreert wezenlijke modificaties van polyribosome fractionering om de translatome in vivo CZS monsters te bestuderen. Het maakt het mogelijk globale beoordeling van vertaling en transcriptie regulatie door de isolatie en vergelijking van de totale RNA gebonden RNA fracties ribosoom.

In vivo Ondervraging van het centrale zenuwstelsel Translatome door Polyribosome Fractionation

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Het vermogen van cellen om zich aan stress aan te passen is cruciaal voor hun overleven. Regulatie van mRNA-translatie is een van deze aanpassingsstrategieën, die zorgt voor een snelle regulering van het proteoom. Hier bieden we een gestandaardiseerd polysoomprofileringsprotocol om specifieke mRNA's te identificeren die selectief worden getransleerd onder stressomstandigheden.

Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Dit manuscript beschrijft een methode om te visualiseren en te kwantificeren van gelokaliseerde vertaling gebeurtenissen in subcellular compartimenten. De in dit manuscript voorgestelde benadering is vereist van een basissysteem voor confocal beeldvorming en reagentia en snelle en kostenefficiënte.

Kwantitatieve immunofluorescentie te meten Global gelokaliseerd vertaling

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Leer hoe u ribosoomgebonden nascente polypeptiden isoleert om translationele pauzeplaatsen op mRNA te identificeren met behulp van in vitro-translatie en SDS-PAGE-analyse.

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden

Meer video's verkennen