Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer
19 juni 2012
We beschrijven hier een techniek die nu standaard wordt gebruikt om stabiel gebonden ribosoom ontluikende keten complexen (RNC) te isoleren. Deze techniek maakt gebruik van de ontdekking dat een 17 aminozuur lange SecM "arrestatie sequentie" kan vertaling rek halt toe te roepen in een prokaryotische ( E. coli) Systeem, wanneer ze in (of gefuseerd met de C-terminus) van vrijwel elke eiwit.
Het algemene doel van deze procedure is om SEC TED 70 s ribosoom gebonden, beginnende ketencomplexen of RNC's te isoleren die tijdens translatie in een in vitro celvrij systeem worden geproduceerd. Dit wordt bereikt door eerst een 17 aminozuren lange SEC M stallingsequentie te introduceren aan het C-terminale uiteinde van het gen van belang en dit stroomafwaarts van de T zeven transcriptionele promotor te klonen. Vervolgens wordt het mRNA getranscriseerd met behulp van een in vitro transcriptiereactie en vervolgens gezuiverd.
Vervolgens wordt het gezuiverde mRNA vertaald in een S 30 E coli extract systeem met radioactieve aminozuren om het gesynthetiseerde eiwit of beginnende polypepeptide te labelen. Ten slotte worden de tweede Mr.Ed ribosoom gebonden beginnende ketencomplexen geïsoleerd door sucrose, gradiënt, centrifugatie en fractievorming. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat beginnende ketens stabiel zijn gebonden aan het 70 s ribosoom door middel van gelelektroforeseanalyse van de gelabelde polypeptiden die zijn geïsoleerd uit de gradiëntfracties.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals het gebruik van mRNA dat geen stock codon mist, is dat het met hoge efficiëntie de hechting van het beginnende polypepeptide aan het 70 s ribosoom tijdens translatie en de daaropvolgende centrifugatiestap verzekert. Bovendien, in tegenstelling tot no stop cordon technologie, kan deze methode met bijna gelijke efficiëntie worden gebruikt tijdens zowel in vitro als in vivo systeem. Deze methode kan helpen om sleutelvraagstukken op het gebied van translationele eiwitvouwing te beantwoorden, zoals hoe vroeg tijdens de translatie verschillende translationele vouwingstussenproducten kunnen worden gevormd en verder helpen bij het analyseren van hun structuur met behulp van directe of indirecte structuur.
Proberings- en bepalingsaanpakken Deze techniek kan ons helpen om de weg van eiwitvouwing op het ribosoom te ontcijferen. In dit protocol hebben we de isolatie van 70 s ribosoom gebonden volledige lengte bine gamma B kristallijne beginnende ketens beschreven. Maar deze techniek kan worden gebruikt voor de isolatie van vari disese van vrijwel elk eiwit van belang.
Deze strategie kan ook worden toegepast om verkortte natin polypeptideketens van de derm Es te isoleren. Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn in deze methode worstelen tijdens de sucrose gradiënt centrifugatie stap. Echter, voor ervaren mensen zou dit geen probleem moeten zijn. We besloten om de tweede stallingsequentie te gebruiken om gamma B kristallijne beginnende polypeptiden te isoleren die gebonden zijn aan 70 s ribosoom na aanvankelijke, minder succesvolle pogingen die het gebruik van mRNA zonder stop cordon inhielden.
De laatste techniek kon de stabiliteit van RNC's tijdens de daaropvolgende centrifugatie stappen niet met dezelfde efficiëntie waarborgen als de techniek die het gebruik van SECM arrestatiesequentie inhoudt. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen die betrekking hebben op de voorbereiding van de gradiënt en de scheiding van RNC moeilijk te leren kunnen zijn en het vereist een bepaald niveau van expertise om reproduceerbare resultaten te garanderen. Het demonstreren van de houding zal een afgestudeerde student zijn uit mijn laboratorium Om in vitro transcriptie en translatie uit te voeren. Begin met een gen van belang dat is gekloond in een T zeven en/of SP zes gebaseerd plasmide om ribosoom beginnende ketencomplexen of RNC's te genereren.
Verleng het C-uiteinde van het doelpolypepeptide door de arrestatie-inducerende sequentie van M toe te voegen om ervoor te zorgen dat het polypeptidefragment uit de ribosoomtunnel zal worden uitgestoten. Voeg een flexibele glycine Syrië-rijke linker toe tussen het eiwit en de SEC M arrestatiesequentie om voor te bereiden op in vitro transcriptie, gebruik restrictie-enzym dat stroomafwaarts van het open leesraam zal snijden om de template DNA te lineariseren, draai AROS gelelektroforese om volledige vertering van het monster te verifiëren. Na verificatie van de optimale DNA-concentratie, gebruik een hoog opbrengst transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant om messenger RNA te synthetiseren.
Gebruik lithiumchloride precipitatie om het mRNA te zuiveren. Voer vervolgens een monster uit op een acrylamide of aros gel om de zuiverheid ervan te verifiëren. Voor in vitro translatie.
Gebruik een e coli systeem in nuclease-vrij water, voeg een een millimolair aminozuurmengsel minus methionine toe, 10 eenheden ribonuclease remmer, 20 microcuries van 35 s methionine, 20 microliter reactiemengsel, 24 microliter reconstitutiebuffer en 24 microliter e coli.Lysaat. Verwarm de reactie door deze gedurende vijf minuten op 30 graden Celsius te incuberen. Voeg vervolgens een tot twee microgram mRNA toe en incubeer gedurende een extra 10 tot 15 minuten bij 30 graden Celsius.
Stop de reactie door het op ijs te plaatsen om 70 s ribosoom gebonden beginnende ketencomplexen of nc's te isoleren. Plaats de translatiereactie bovenop 4,5 milliliter van een vijf tot 30% sucrose gradiënt in 20 millimolair heaps. Kaliumhydroxide pH 7,5 15 millimolair magnesium, 100 millimolair kaliumacetaat en één millimolair DTT centrifugeer bij 41.000 RPM gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Na centrifugatie, fractievorm de sucrose gradiënt met behulp van een programmeerbaar dichtheidsgradiëntsysteem en een absorptiometer ingesteld op 254 nanometer.
Verzamel de fracties die 70 s ribosomen bevatten voor verdere analyse om te bepalen of het SEC M verlengde eiwit nog aan het 70 s ribosoom is gehecht. Precipiteer het eiwit in elke gradiëntfractie door trichloroazijnzuur toe te voegen. Incubeer de monsters gedurende een nacht bij vier graden Celsius, centrifugeer de monsters de volgende dag bij 14.000 keer G gedurende 15 minuten om het eiwit te pelletten, was de pellets in een vier tot één verhouding van aceton tot één millimolair tris, HCL pH 7,6.
Laat de pellets drogen en suspendeer ze vervolgens in SDS page laadbuffer. Los de monsters op door tris Trice SDS page, bevestig vervolgens en droog de gels en onderwerp ze aan autoradiografie en fosfo-imaging zoals hier getoond. Na in vitro translatie werden de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een techniek voor het isoleren van stabiel gebonden ribosoom-nascente ketting complexen (RNC's) met behulp van een 17 aminozuur SecM arrest sequentie. De methode is toepasbaar in een prokaryotisch E. coli systeem en is cruciaal voor het bestuderen van translatie-elongatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Moleculair Biologie
- Translatie Mechanismen
Achtergrond
- Ribosoom-nascente ketting complexen (RNC's) zijn essentieel voor het begrijpen van eiwitsynthese.
- De SecM stalling sequentie stopt de translatie-elongatie, waardoor het bestuderen van nascente ketens mogelijk wordt.
- Deze techniek kan worden toegepast op verschillende eiwitten door de stalling sequentie aan hun C-terminus te fuseren.
- Isolatie van RNC's geeft inzicht in de dynamiek van translatie in een gecontroleerde omgeving.
Doel van studie
- Om SEC TED 70S ribosoom gebonden nascente ketting complexen tijdens translatie te isoleren.
- Om een in vitro celvrij systeem te gebruiken voor het bestuderen van translatieprocessen.
- Om de stabiliteit van nascente ketens gebonden aan ribosomen te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Introductie van een 17 aminozuur lange SecM stalling sequentie aan het C-terminale uiteinde van het gen van belang.
- Klonen van het gemodificeerde gen stroomafwaarts van de T7 transcriptionele promotor.
- Transcriberen van mRNA met behulp van een in vitro transcriptie reactie.
- Vertalen van het gezuiverde mRNA in een S30 E. coli extract systeem met radioactieve aminozuren.
- Isoleren van ribosoom gebonden nascente ketting complexen door sucrose gradiënt centrifugatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van nascente ketens stabiel gebonden aan het 70S ribosoom.
- Verificatie van resultaten door middel van gelelektroforese analyse van gelabelde polypeptiden.
- Demonstratie van de effectiviteit van de SecM stalling sequentie in het stoppen van translatie.
- Inzichten in de dynamiek van ribosoom-nascente ketting interacties.
Conclusies
- De beschreven techniek is effectief voor het isoleren van RNC's in een prokaryotisch systeem.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende eiwitten om translatiedynamiek te bestuderen.
- Begrip van RNC's draagt bij aan de bredere kennis van eiwitsynthese mechanismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation of ribosome-bound nascent chain complexes (RNCs) using the SecM arrest sequence enables precise interrogation of co-translational protein folding pathways, a critical challenge in early discovery. This approach provides mechanistic clarity on folding intermediates, supporting predictive confidence in target validation and de-risking of protein-based therapeutic strategies. The method's adaptability across diverse proteins positions it as a reusable capability for structural and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct capture of folding intermediates for mechanistic de-risking of protein targets.
- Supports functional target validation by isolating nascent chains at defined translation stages.
- Facilitates predictive assessment of folding pathways relevant to therapeutic protein design.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RNCs for downstream structural and functional assays.
- Ensures reproducibility and standardization by stably arresting translation at precise points.
- Enables quantitative analysis of nascent chain properties for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural interrogation of nascent chains with disease-relevant protein folding questions.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of protein therapeutics.
- Reduces translational risk by clarifying folding outcomes at the ribosome interface.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and structural biology, bridging hypothesis-driven target validation with preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on co-translational folding and pathway elucidation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNC preparations for comparative analysis.
- Analytics: Provides labeled, ribosome-bound polypeptides for direct structural and functional readouts.
- Translational Research: Enables mechanistic insights that inform preclinical protein engineering and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to virtually any protein of interest, supporting broad portfolio applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein folding and target validation.
- Operational Value: Standardizes RNC isolation for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying folding liabilities early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of protein-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, in vitro transcription/translation, and gradient centrifugation.
- Demands access to analytical infrastructure for sucrose gradient fractionation and radiolabel detection.
- Necessitates rigorous RNase-free technique to maintain translational efficiency and RNC stability.
- Adaptable across diverse protein targets but may require optimization for specific constructs.
- Radioactive labeling steps require specialized safety protocols and regulatory compliance.
