Name: Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Leer hoe je ribosoomgebonden polypeptiden isoleert met de SecM-arrestatiesequentie in een E. coli-systeem. Deze methode maakt stabiele isolatie van nascente ketens mogelijk voor onderzoek naar translatiedynamiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door Human Frontier Science Program subsidie ​​RGP0024.

1. DNA Template Voorbereiding en in vitro transcriptie <ol><li> Het gen van belang wordt gekloneerd in een T7 en / of bijvoorbeeld SP6 promotor gebaseerd plasmide. Om RNC van belang te verkrijgen, wordt de C-terminus van het doel polypeptide uitgebreid met arrestatie induceren reeks SecM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. Om de polypeptide fragment van belang zal extruderen van de ribosomale tunnel, de C-terminale deel van het doelwit eiwit te verlengen ten minste 30 aminozuren 12-14. Een flexibele Glycine-serine-rijke linker worden geïntroduceerd tussen het eiwit en de SecM arrestatie sequentie eventuele conformationele beperkingen voorkomen. </li><li> Voor in vitro transcriptie moet template DNA worden gelineariseerd met restrictie-enzym snijden achter het ORF. Men moet volledig linearisatie van het plasmide DNA te controleren door uitvoering van de restrictiedigestie product agarosegelelektroforese. </li><li> Het gelineariseerde plasmaid wordt verder gebruikt voor in vitro transcriptie reactie. Verschillende concentraties van template DNA kan worden getest om optimale DNA vereiste concentratie in vitro transcriptie identificeren. Over het algemeen met MEGAscript High yield Ambion&#39;s Transcription Kit (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 pg gelineariseerd DNA levert 40-60 microgram mRNA. In vitro transcriptie is gedaan volgens instructies van de fabrikant (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) . </li><li> Naar aanleiding van in vitro transcriptie, wordt mRNA gezuiverd door middel van lithium chloride neerslag volgens de fabrikant instructie (MEGAscript High Ambion het rendement transcriptiekit, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> mRNA integriteit verder geverifieerd door elektroforese met acrylamide of agarose gels. </li></ol> 2. In vitro translatie Voor de in vitro translatie met behulp van de RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD) Volg de onderstaande stappen: <ol><li> Bereid 100 pi van het onderwijs in vitro translatie reactie na de fabrikant. Kortom, toe te voegen in nuclease gratis water 24 ul aminozuurmengsel min methionine (1 mm), 10 eenheden van ribonucleaseremmer (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 pCi van radioactieve [35 S]-methionine (MP Biomedicals, Solon, OH), 20 ul Reactie mix, 24 ul Reconstitutie buffer en 24 pi E. coli lysaat. </li><li> Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 5 min warm de vertaling reactie vooraf. Voeg 1-2 pg van mRNA de vertaling reactie en incuberen bij 30 ° C gedurende 10-15 minuten. </li><li> Stop de reactie door plaatsen van de vertaling reactie op ijs. </li></ol> 3. Isolatie van Nascent polypeptide van in vitro translatie Reaction <ol><li> Om RNC isoleren wordt de vertaling reactie lagen op 4,5 ml van 5-30% sucrose gradiënt in 20 mM HEPES pH 7 KOH0.5, 15 mM MgCl2, 100 mM kalium-acetaat, 1 mM DTT en gecentrifugeerd met Beckman SW55 Ti-rotor bij 41.000 rpm, 4 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Na centrifugeren, sucrose gradiënt gefractioneerd verschillende ribosomale populaties en bijbehorende opkomende ketens isoleren. Scheiding wordt gecontroleerd met behulp van de ISCO Programmable dichtheidsgradiënt systeem met continu-opname op 254 nm met behulp van een ISCO UA-6 absorptie detector. </li><li> De fractie (s) met 70S ribosomen worden verzameld en geanalyseerd verder afhankelijk van het doel van het experiment. </li></ol> 4. Observatie van eiwit gebonden aan ribosoom met Tris-tricine SDS-PAGE Om te controleren of de SecM verlengde eiwit blijft aan de 70S ribosoom werden gradiënt fracties verzameld en als volgt behandeld: <ol><li> Eiwit in elke fractie werd geprecipiteerd door toevoeging trichloorazijnzuur (TCA) tot een eindconcentratie van 10% en geïncubeerd bij 4 ° C overnight. </li><li> Na overnacht incubatie werden de monsters gecentrifugeerd bij 14.000 x g gedurende 15 minuten tot pellet het eiwit. Na centrifugeren supernatant werd verwijderd en de pellet werd tweemaal gewassen met een oplossing bevattende aceton: 1 mM Tris-HCl pH 7,6 (4:1). Pellet is verder lucht gedroogd en opgelost in SDS-PAGE loading buffer. </li><li> De behandelde monster werd opgelost en geanalyseerd door Tris-tricine SDS-PAGE. </li><li> Na elektroforese gels werden vastgesteld, gedroogd onder vacuüm gel verver en aan autoradiografie. De verdeling van de ontluikende polypeptiden werden waargenomen met behulp van phosphoimaging. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Hier geven een experiment waarin de isolatie van de volledige lengte bovine Gamma-B crystalline stabiel gebonden aan het 70S ribosoom. Figuur 1 toont stappen bij de isolatie van runderen Gamma-B crystalline RNC. De C-terminus van het gamma-B crystalline werd totale verlengd 32 aminozuren to dat volle-lengte proteïne extrudeert van de ribosomale tunnel, dit ook het SecM blokkering sequentie geplaatst het C-terminus van het fusie-polypeptide. Na in vitro translatie werden de 70S ribosomen geïsoleerd door sucrose gradiënt centrifugatie (figuur 2.1). Om de eiwitten blijft stabiel gebonden aan de ribosoom de 70S fracties werden samengebracht, ontzoute, buffer uitgewisseld en onderworpen aan een extra lang sucrose gradiënt centrifugatie (figuur 2.2). Het resultaat weergegeven in figuur 2 blijkt duidelijk dat SecM efficiënt kan veroorzaken translationele arrestatie van de Gamma-B crystalline RNC. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische uitleg van de stappen die betrokken zijn bij de isolatie van RNC&#39;s. C-uiteinde van runderen Gamma-B crystalline werd uitgebreid met 32 aminozuursequentie. Deze uitgebreideC-terminale gebieden ook SecM arrestatie sequentie. Gamma-B crystalline met SecM sequentie werd gekloond in PIVEX 2.3 (T7 based) plasmide. Voor in vitro transcriptie de template DNA werd gelineariseerd met Xbal. Lineair template werd verder gebruikt in vitro transcriptie. De T7 in de DNA-template herkend door T7-RNA-polymerase dat Gamma-B crystalline gen zich stroomafwaarts van de T7 promoter overschrijft. mRNA werd gezuiverd met lithiumchloride precipitatie. Het gezuiverde mRNA werd vervolgens gebruikt voor in vitro translatie. Na incubatie werd het reactiemengsel vertaling lagen op 5-30% sucrose gradiënt en gecentrifugeerd Beckman SW55 Ti-rotor bij 41.000 rpm, 4 ° C gedurende 2 uur. <speen class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig2.jpg" /> Figuur 2. Isolatie van runderen Gamma-B-crystalline RNC stabiel gebonden aan de 70S ribosoom. 1 ug mRNA werd gemengd in 100 ul reactie E. coli S30 Extract systeem zoals vermeld in het protocol gedeelte met 20 pCi [35S]-methionine en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 15 minuten. Na incubatie werd het reactiemengsel vertaling lagen op 5-30% sucrose gradiënt in 20 mM HEPES pH 7,5 KOH, 15 mM MgCl2, 100 mM kalium-acetaat, 1 mM DTT en gecentrifugeerd Beckman SW55 Ti-rotor bij 41.000 rpm, 4 ° C gedurende 2 uur. Na snelheid sedimentatie, werd de gradiënt gelost en het ribosoom pro le verkregen. De gegevens werden geregistreerd door het PeakTrak programma (ISCO gradiënt dichtheidsgradiënt fractionering systeem). Fracties werden verzameld, het eiwit TCA neergeslagen en opgelost in 16,5% T, 6% C Tris-Tricinus PAGE gel 15. De gel werd gedroogd en blootgesteld autoradiografie. Na blootstelling aan de gel werd gescand met behulp van Typhoon 9410 imaging scanner. Figuur 2.1 laat zien dat volledige lengte Gamma-B crystalline aanwezig is in 70S ribosoom fracties. Zo SecM afslaan functie kan de isolatie van de stabiele runderen Gamma-B crystalline RNC. Gegevens in figuur 2.2 duidelijk dat de geïsoleerde RNC inderdaad stabiel. In de huidige experiment 70S fracties na de eerste ronde van sucrose gradiënt centrifugatie werden samengevoegd en saccharose werd verwijderd met Amicon ultra-4 centrifugale filtereenheid (Millipore), gevolgd door buffer uitwisseling oplossing bevattende 20 mM HEPES pH 7,5 KOH, 15 mM MgCl2, 100 mM kalium-acetaat, 1 mM DTT. Dit monster werd verder onderworpen aan een extra lang centrifugatie door 5-30% sucrose gradiënt en gefractioneerd. Elke fractie werd behandeld en geanalyseerd als in figuur 2.1.

<ol><li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li>
<li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li>
<li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing%2C+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li>
<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li>
<li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+monitor%2C+SecM%2C+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.</li>
<li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li>
<li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li>
<li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li>
<li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li>
<li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+of+globin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li>
<li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li>
<li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Voor reproduceerbare resultaten kwaliteit en de concentratie van de componenten die in vitro transcriptie en translatie cruciale zijn. Wij hebben in de handel verkrijgbaar in vitro transcriptie en translatie extracten en geven efficiënte en reproduceerbare resultaten indien zorgvuldig behandeld. Kwaliteit van mRNA kan invloed hebben op de vertaling, dus het is van het grootste belang om de integriteit van mRNA te testen alvorens het te gebruiken voor in vitro vertaling. Incubatietijd in vi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens / Kit </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 High yield transcriptiekit </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> RTS 100 E.coli HY Kit </td><td> 5 Prime </td><td> 2401100 </td></tr><tr><td> Ribonucleaseremmer </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 centrifugaalfilter Unit </td><td> Millipore </td><td> UFC801008 </td></tr><tr><td> Opslag fosfor autoradiografie </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 variabele modus imager </td></tr><tr><td> Dichtheidsgradiënt Fractionering Systems </td><td> Teledyne Isco, Inc </td><td> ISCO Programmeerbare dichtheidsgradiënt System </td></tr><tr><td> Sucrose Gradient Centrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima L-90 K Preparatieve Ultracentrifuge </td></tr></tbody></table>

met behulp van secm arrestatie sequentie als een tool om ribosoom bound polypeptiden isoleer

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Uitgebreid onderzoek heeft voldoende bewijzen waaruit blijkt dat het vouwen van eiwitten in de cel is een co-translationeel proces 1-5. Echter, de exacte pad dat polypeptideketen volgt tijdens de co-translationele vouwen om de functionele vorm te komen is nog steeds een raadsel. Om dit te begrijpen en de exacte conformatie van het co-translationele vouwen tussenproducten bepalen, is het noodzakelijk dat technieken dat de isolatie van RNC die beginnende ketens van voorafbepaalde afmetingen hun verdere structurele analyse mogelijk maken. SecM (secretie monitor) is een 170 aminozuur E. coli-eiwit dat de expressie van de downstream SecA (secretie rijden) ATPase in de secM-seca operon 6 regelt. Nakatogawa Ito oorspronkelijk gevonden dat de 17 aminozuur lange sequentie (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) in de C-terminale gebied van het eiwit SecM nodig en voldoende omleiden tot blokkering van SecM rek bij Gly165, waardoor de productie van peptidyl-glycyl-tRNA stabiel gebonden aan de ribosomale P-site 7-9. Nog belangrijker is vastgesteld dat deze 17 aminozuur lange sequentie kan worden gefuseerd met de C-terminus van vrijwel volledige lengte en / of afgeknotte proteïne waardoor de produktie van RNC die beginnende ketens voorafbepaalde afmetingen 7. Dus, wanneer samengesmolten of ingevoegd in het doeleiwit, SecM blokkering sequentie produceert arrestatie van de polypeptideketen rek stabiel genereerd RNC zowel in vivo in E. coli-cellen en in vitro in een celvrij systeem. Sucrose gradiëntcentrifugering verder benut RNC isoleren. De geïsoleerde RNC&#39;s kan worden gebruikt om structurele en functionele eigenschappen van de co-translationele vouwen tussenproducten te analyseren. Recent is deze techniek met succes gebruikt om inzicht te krijgen in de structuur van de verschillende ribosoom gebonden ontluikende kettingen 10,11. Hier beschrijven we de isolatie van runderen Gamma-B-crystalline RNC gefuseerd met SecM en genereerde in een in vitro translatie-systeem.

We beschrijven hier een techniek die nu standaard wordt gebruikt om stabiel gebonden ribosoom ontluikende keten complexen (RNC) te isoleren. Deze techniek maakt gebruik van de ontdekking dat een 17 aminozuur lange SecM &quot;arrestatie sequentie&quot; kan vertaling rek halt toe te roepen in een prokaryotische (<em&gt; E. coli</em&gt;) Systeem, wanneer ze in (of gefuseerd met de C-terminus) van vrijwel elke eiwit.

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Uit uitgebreid onderzoek is ruimschoots bewijs voortgekomen dat suggereert dat eivitvouwing in de cel een co-translationeel proces is1-5. Echter, het exacte pad ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van SEC TED 70 s ribosoomgebonden, nascente ketencomplexen of RNC's die zijn geproduceerd tijdens translatie in een in vitro celvrij systeem. Dit wordt bereikt door eerst een SEC M-stallingsequens van 17 aminozuren lang toe te voegen aan het C-terminale uiteinde van het gen van belang en dit stroomafwaarts van de T seven transcriptionele promotor te kloneren. Vervolgens wordt het mRNA getranscribeerd middels een in vitro transcriptiereactie en daarna gezuiverd.Vervolgens wordt het gezuiverde mRNA vertaald in een S 30 E. coli-extractsysysteem met radioactieve aminozuren om het gesynthetiseerde eiwit of het nascente polypeptide te labelen. Ten slotte worden de tweede Mr.Ed-ribosoomgebonden nascente ketencomplexen geïsoleerd door middel van sucrosegradiëntcentrifugatie en fractionering. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat nascente ketens stabiel gebonden zijn aan het 70 s-ribosoom via gelelektroforese-analyse van de gelabelde polypeptiden die uit de gradiëntfracties zijn geïsoleerd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van mRNA zonder stopcodon, is dat het met een hoge efficiëntie de binding van de nascente polypeptideketen aan het 70 s ribosoom waarborgt tijdens de translatie en de daaropvolgende centrifugatiestap. Bovendien kan deze methode, in tegenstelling tot de technologie zonder stopcodon, met vrijwel gelijke efficiëntie worden gebruikt in zowel in vitro als in vivo systemen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van translationele eivitsvouwing, zoals hoe vroeg tijdens de translatie verschillende translationele vouwingsintermediairen kunnen worden gevormd, en kan verder helpen bij het analyseren van hun structuur met behulp van directe of indirecte structuurbepaling.Sonderings- en determinatiemethoden Deze techniek kan ons helpen het pad van eiwitvouwing op het ribosoom te ontcijferen. In dit protocol hebben we de isolatie beschreven van volledige bine gamma B kristallijne nascente ketens gebonden aan het 70 s ribosoom. Deze techniek kan echter worden gebruikt voor de isolatie van vrijwel elk eiwit van belang.Deze strategie kan ook worden toegepast om getrunceerde nascente polypeptideketens van derm Es te isoleren. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden tijdens de stap van sucrosegradiëntcentrifugatie. Voor ervaren onderzoekers zou dit echter geen probleem moeten zijn. We hebben besloten om een tweede stalling-sequentie te gebruiken om gamma B-crystalline nascente polypeptiden gebonden aan het 70S ribosoom te isoleren, na initiële, minder succesvolle pogingen waarbij mRNA zonder stopcodon werd gebruikt.De latere techniek kon de stabiliteit van RNC's tijdens opeenvolgende centrifugatiestappen niet met dezelfde efficiëntie waarborgen als de techniek waarbij gebruik werd gemaakt van een SECM-stopsequentie. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor de bereiding van de gradiënt en de scheiding van RNC's moeilijk te leren kunnen zijn en een zeker niveau van expertise vereisen om reproduceerbare resultaten te garanderen. De demonstratie zal worden uitgevoerd door een promovendus uit mijn laboratorium. Voer in vitro transcriptie en translatie uit. Begin met een gen van belang dat is gekloneerd in een willekeurig T7- en/of SP6-gebaseerd plasmide om ribosome nascent chain complexes of RNC's te genereren.Verleng de C-terminus van het doelpolypeptide door de arrest-inducerende sequentie van M toe te voegen, om ervoor te zorgen dat het polypeptidefragment uit de ribosomale tunnel wordt geperst. Voeg een flexibele glycine-rijke linker toe tussen het eiwit en de SEC M-arrestsequentie ter voorbereiding op in vitro transcriptie. Gebruik een restrictie-enzym dat stroomafwaarts van het open leesraam knipt om het template-DNA te lineariseren en voer een agarosegelelektroforese uit om de volledige digestie van het monster te verifiëren. Gebruik na verificatie van de optimale DNA-concentratie een high-yield transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant om messenger-RNA te synthetiseren.Gebruik lithiumchlorideprecipitatie om het mRNA te zuiveren. Voer vervolgens een monster uit op een acrylamide- of agarosegel om de zuiverheid te verifiëren. Voor in vitro translatie.Voeg in een E. coli-systeem in nucleasevrij water een 1 mM aminozuurmengsel zonder methionine, 10 units ribonuclease-remmer, 20 µCi 35S-methionine, 20 µL reactiemix, 24 µL reconstitutiebuffer en 24 µL E. coli-lysaat toe. Voorwarm de reactie door deze vijf minuten te incuberen bij 30 °C. Voeg vervolgens 1 tot 2 µg mRNA toe en incubeer nogmaals 10 tot 15 minuten bij 30 °C.Stop de reactie door deze op ijs te plaatsen om 70 S ribosoomgebonden nascente ketencomplexen of nc's te isoleren. Laag de translatiereactie op 4,5 milliliter van een 5 tot 30% sucrosegradiënt in 20 millimol HEPES, kaliumhydroxide pH 7,5, 15 millimol magnesium, 100 millimol kaliumacetaat en 1 millimol DTT. Centrifugeer 2 uur lang bij 41.000 RPM bij vier graden Celsius. Fractioneer na centrifugatie de sucrosegradiënt met behulp van een programmeerbaar dichtheidsgradiëntsysteem en een absorptiedetector ingesteld op 254 nanometer.Verzamel de fracties die 70 s ribosomen bevatten voor verdere analyse om te bepalen of het verlengde SEC M-eiwit aan het 70 s ribosoom gebonden blijft. Precipiteer het eiwit in elke gradiëntfractie door trichloroacetic acid toe te voegen. Incubeer de monsters overnight bij vier graden Celsius; centrifugeer de monsters de volgende dag bij 14, 000 ×g gedurende 15 minuten om het eiwit te pelletteren en was de pellets in een ratio van vier op één van aceton en één millimolar tris, HCL pH 7.6.Laat de pellets aan de lucht drogen en resuspendeer ze vervolgens in SDS-pageladbuffer. Scheid de monsters via tris-tricine SDS-page, fixeer en droog vervolgens de gels en onderwerp deze aan autoradiografie en fosfo-imaging zoals hier getoond. Na de in vitro translatie werden de 70 S ribosomen geïsoleerd via sucrosegradiëntcentrifugatie en fractionering om te garanderen dat het gamma B kristallijne eiwit stabiel gebonden blijft aan het ribosoom.De fracties die 70 s bevatten, werden samengevoegd, ontzout, onderworpen aan bufferuitwisseling en vervolgens een extra ronde sucrosegradiëntcentrifugatie ondergaan. De hier gepresenteerde resultaten suggereren dat SEC M de translationele arrestatie van de gamma B crystallines RNC's efficiënt kan induceren. Zodra de methode onder controle is, kan deze techniek in één werkdag worden uitgevoerd, met uitzondering van de gelelektroforese-analyse van de nascent chain, die gewoonlijk een overnachtstapsgewijze TCA-precipitatie omvat.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het overduidelijk cruciaal om RNA-contaminatie in elke stap te vermijden. RNA-contaminatie kan de translationele efficiëntie van het extract beïnvloeden en leiden tot het vrijkomen van het nascente polypeptide uit het 70S-ribosoom. Door deze procedure te volgen, kan men, afhankelijk van het uiteindelijke doel, NAST en polypeptiden van een vooraf bepaalde lengte verkrijgen die stabiel gebonden zijn aan het 70S-ribosoom.Deze complexen kunnen voor diverse doeleinden worden gebruikt, zoals het bepalen van de conformatie van ribosoomgebonden nascent chains met behulp van directe en indirecte benaderingen zoals NMR of FRET, of het testen van factor- en ligandbinding na de vorming ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de structurele biologie en eiwitvouwing om de conformatie van volledige eiwitten gebonden aan het ribosoom, alsokmaar cotranslationele vouwingsintermediairen, te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u nascent polypeptide kunt prepareren en isoleren dat stabiel gebonden is aan het 70 s ribosoom, wat vervolgens kan worden gebruikt om diverse vragen in het veld van translationele eiwitvouwing te beantwoorden.Vergeet niet dat het werken met radioactieve isotopen en gelabelde aminozuren, zoals bijvoorbeeld 35S methionine, speciale voorzorgsmaatregelen vereist, welke altijd in acht genomen moeten worden bij het uitvoeren van deze procedure.

using-secm-arrest-sequence-as-tool-to-isolate-ribosome-bound

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

Een belangrijke belemmering voor de biochemische analyses van de ribosomen met ontluikende peptidyl-tRNA's is de aanwezigheid van andere ribosomen zijn in dezelfde monsters, ribosomen niet betrokken bij de vertaling van de specifieke mRNA-sequentie worden geanalyseerd. We ontwikkelden een eenvoudige methode om uitsluitend te zuiveren,, de ribosomen met de ontluikende peptidyl-tRNA van belang.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA&#39;s voor functionele en structurele analyses

Een techniek om translationeel pauze sites op mRNA te identificeren wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op isolatie van beginnende Polypeptiden ophopen op ribosomen tijdens in vitro translatie van een doel-mRNA, gevolgd door de grootte analyse van de ontluikende ketens met een denaturerende gelelektroforese.

Isolatie van Ribosoom Bound Nascent Polypeptiden<em&gt; In vitro</em&gt; Om Translationeel Pauze plaatsen langs mRNA identificeren

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Dit protocol illustreert wezenlijke modificaties van polyribosome fractionering om de translatome in vivo CZS monsters te bestuderen. Het maakt het mogelijk globale beoordeling van vertaling en transcriptie regulatie door de isolatie en vergelijking van de totale RNA gebonden RNA fracties ribosoom.

In vivo Ondervraging van het centrale zenuwstelsel Translatome door Polyribosome Fractionation

Ribosomen spelen een centrale rol in de eiwitsynthese. Polyribosome (polysome) fractionering van sucrose dichtheidsgradiëntcentrifugatie maakt een directe bepaling van de vertaling efficiëntie van de individuele mRNA's op een genoom-brede schaal. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor biochemische analyse van de ribosoom-en-polysome geassocieerde factoren zoals chaperonnes en signaalmoleculen.

Polysome fractionering en analyse van zoogdieren Translatomes op een genoom-brede schaal

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

Hier beschrijven we de stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor RIBO-seq bij bacteriën. Sequencing van de bibliotheken die volgens deze richtlijnen zijn opgesteld, resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat we presenteren is eenvoudig, maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en duurt zeven dagen van lysis tot het verkrijgen van bibliotheken.

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

Dit protocol beschrijft hoe u een polysoomprofiel kunt genereren zonder gebruik te maken van geautomatiseerde gradiëntmakers of gradiëntfractioneringssystemen.

Polysoomprofilering zonder gradiëntmakers of fractioneringssystemen

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Leer hoe je ribosoomgebonden polypeptiden isoleert met de SecM-arrestatiesequentie in een E. coli-systeem. Deze methode maakt stabiele isolatie van nascente ketens mogelijk voor onderzoek naar translatiedynamiek.

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Meer video's verkennen