Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen
3 juni 2012
Influenza virussen repliceren hun RNA genoom in samenwerking met gastheer-cel chromatine. Hier we een methode intact viraal ribonucleoproteïne complexen zuiveren van chromatine van geïnfecteerde cellen. Gezuiverd virale complexen kunnen worden geanalyseerd door zowel Western blot en primer extension eiwit en RNA inhoud respectievelijk.
Lyco negatieve streng, RNA-virussen. Het genoom van influenzavirussen is verpakt in de vorm van virale rib nucleaire eiwitcomplexen, of VR np's waarin het enkelstrengse genoom is ingekapseld door het nucleaire eiwit en geassocieerd met het curcumine polymerase complex bestaande uit de PA PB een en PB twee subeenheden om intacte complexen te zuiveren uit geïnfecteerde zoogdiercellen. Hela-cellen worden geïncubeerd met recombinant strep-gelabeld influenzavirus.
Zodra het virus de cellen binnenkomt, wordt het virale RNA gesynthetiseerd in de kern na infectie, worden de cellen gesneden om een detergens te gebruiken en gefractioneerd in cytoplasmatische nucleaire en chromatinefracties met behulp van centrifugatie en aanval-gebaseerde chromatinefractieprotocol. Ten slotte worden de strep-gelabelde VRP's affiniteitsgezuiverd uit elke fractie. Analyse van de eiwit- en RNA-samenstelling van gezuiverde VR NPS door zilverkleuring demonstreert dat het gebruik van dit protocol zelfs stevig is, chromatine gebonden VRP's kunnen worden geïsoleerd.Intact. Dus een van de belangrijkste voordelen van ons protocol in vergelijking met standaardmethoden voor het affiniteitszuiveren van influenzavirus rib nucleaire eiwitcomplexen is dat door het gebruik van onze methode, het mogelijk is om VR NPS van de chromatine van geïnfecteerde cellen te zuiveren, wat bekend staat als de plaats van influenzavirus mRNA-synthese.
Dus onze methode zou kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden over de regulatie van virale replicatie en transcriptie, zoals, bijvoorbeeld, welke virale of cellulaire factoren, maar ook welke post-translationele modificaties vereist zijn voor, bijvoorbeeld, virale mRNA-synthese of ook virale genomische RNA-synthese. Dus onderzoekers die nieuw zijn in deze methode kunnen enige moeilijkheden ondervinden omdat subnucleaire fractionering erg gevoelig is voor biochemische omstandigheden en het kan ook sterk variëren tussen verschillende cellijnen. Begin dit protocol met Hela-cellen die zijn geïnfecteerd met influenzavirus, RWSN PB twee strep, die een strep-label heeft dat genetisch gefuseerd is met het C-uiteinde van de PB twee-subeenheid bij een infectiemultipliciteit van drie.
Was de cellen eenmaal met koud PBS, voeg dan 12 milliliter koud PBS toe en verwijder ze uit de schaal. Gebruik een rubberen schraper. Breng de cellen over naar een 50 milliliter conische buis en pellet ze door centrifugatie.
Het moeilijkste aspect van deze procedure is het celfractioneringsprotocol. Celkernen zijn erg gevoelig voor homogenisatie en mengprocedures, en als het verkeerd wordt uitgevoerd, kan het gemakkelijk een chromatine-extract beschadigen. Het is dus erg belangrijk om niet alleen de homogenisatietechnieken te volgen, maar ook de algemene omgang met lysaten zoals we hier laten zien.
Volg de spin als aspirate, de PBS en Resus, suspendeert de celpellet in 10 milliliter koude sucrose buffer. Bevestig een 200 microliter pipette tip aan een 10 milliliter kunststof serum pipette en passeer de cellen erdoor om celklonten te breken. Incubeer de suspensie gedurende 10 minuten op ijs.
Periodiek de cellen voorzichtig omkeren om ze opnieuw te suspenderen. Voeg vervolgens niet IET P 40 toe tot een eindconcentratie van 0,5% en vortex met hoge snelheid gedurende 15 seconden. Onmiddellijk centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3.500 keer G bij vier graden Celsius in een tafelcentrifuge. Na het spinnen verwijdert u het supernatant en brengt u het over in een 15 milliliter conische buis.
Bewaar het supernatant bij vier graden Celsius. Dit is een cytoplasmatische fractie. De pellet zou kleiner en witter moeten zijn dan de oorspronkelijke celpellet zoals hier getoond.
Als het protocol later wordt voltooid, bewaar de celpellet bij vier graden Celsius. Anders, ga verder door de pellet te wassen in vijf milliliter koud sucrose, buffer en centrifugeer zoals eerder. Zodra het spinnen is voltooid, gooit u het supernatant weg en suspendeert u de pellet opnieuw, die de kernen bevat in 1,5 milliliter koud nucleair plasmisch extractiebuffer.
Breng de opgeschorte pellet over naar een gekoelde vier milliliter danshomogenisator met een goed passend stamper en homogeniseer de kernen met 20 slagen. Vermijd schuimvorming, de weerstand zou na ongeveer 10 slagen moeten toenemen. Om efficiënte homogenisatie te bevestigen, onderzoekt u het monster onder een fasecontrastmicroscoop.
De kernen zouden niet langer rond moeten zijn, maar onregelmatige vormen moeten hebben en lijken alsof ze zijn gebarsten. Zodra de kernen zijn gehomogeniseerd, brengt u ze over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Incubeer het homogenaat op een roterend wiel bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten.
Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 16.000 keer G in een microcentrifuge bij vier graden Celsius. Na het spinnen brengt u het supernatant over, dat de nucleaire plasmische fractie is, naar een 1,5 milliliter buis en bewaart u het bij vier graden Celsius. Hersuspendeer vervolgens het pellet in 1,5 milliliter verteringsbuffer, voorverwarmd tot 37 graden Celsius.
Incubeer vervolgens de fractie gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 42 microliters vijf molair natriumchloride toe om de uiteindelijke concentratie natriumchloride op 150 millimolair te brengen en incubeer vervolgens gedurende 20 minuten op ijs. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 16.000 keer G in een microcentrifuge bij vier graden Celsius.
Na het spinnen verwijdert u het supernatant en bewaart u het bij vier graden Celsius. Dit is de CH een 50-fractie. Hersuspendeer het pellet in 1,5 milliliter koud hoge zoutbuffer en incubeer gedurende 20 minuten op ijs.
Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 16.000 keer G in een microcentrifuge bij vier graden Celsius. Na het spinnen verwijdert u het supernatant en bewaart u het bij vier graden Celsius. Dit is de CH 500-fractie.
Haal de fracties die zijn opgeslagen tijdens het fractioneringsprotocol eruit en plaats ze op ijs. Voeg vervolgens 300 microliters vijf molair natriumchloride toe aan de cytoplasmatische fractie. Breng vervolgens 100 microliters gepakte strep T in Sphero-beads per fractie over naar een 15 milliliter conische buis.
Voeg 10 volumes
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het zuiveren van intacte virale ribonucleoproteïnecomplexen (VRNP's) uit het chromatine van met influenzavirus geïnfecteerde cellen. Het protocol maakt de analyse van zowel het eiwit- als RNA-gehalte van deze complexen mogelijk, die cruciaal zijn voor het begrijpen van virale replicatie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Celbiologie
- Moleculair biologie
Achtergrond
- Influenzavirussen repliceren hun RNA-genoom in associatie met het chromatine van de gastheercel.
- Virale ribonucleoproteïnecomplexen (VRNP's) zijn essentieel voor virale RNA-synthese.
- Standaardmethoden voor het zuiveren van VRNP's kunnen complexen mogelijk niet effectief isoleren uit chromatine.
- Inzicht in de samenstelling van VRNP's kan inzicht geven in virale mechanismen.
Doel van studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor het zuiveren van VRNP's uit het chromatine van geïnfecteerde cellen.
- Om gedetailleerde analyse van de eiwit- en RNA-componenten van deze complexen mogelijk te maken.
- Om bestaande methoden voor het isoleren van VRNP's te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Geïnfecteerde HeLa-cellen met recombinant streptavidin-gelabeld influenzavirus.
- Cellen gefractioneerd in cytoplasmatische, nucleaire en chromatinefracties.
- Gebruik van detergentlyse en centrifugatie voor fractionering.
- Affiniteitszuivering van streptavidin-gelabelde VRNP's uit elke fractie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van VRNP's uit chromatine-gebonden fracties.
- Aangetoond de effectiviteit van het zuiveringsprotocol door middel van zilverkleuring.
- Getoond dat sterk aan chromatine gebonden VRNP's kunnen worden geanalyseerd.
- Een betrouwbare methode geboden voor het bestuderen van de samenstelling van virale complexen.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol maakt de zuivering van VRNP's uit chromatine mogelijk, wat het onderzoek naar de biologie van influenzavirus verbetert.
- Deze methode kan worden toegepast om virale RNA-synthesemechanismen te onderzoeken.
- Toekomstige studies kunnen deze aanpak gebruiken om andere aspecten van virale-gastheerinteracties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables the isolation of chromatin-bound influenza virus ribonucleoprotein complexes (vRNPs) from infected cells, addressing a key limitation in studying viral RNA synthesis mechanisms. By improving extraction efficiency of nuclear vRNPs, it supports mechanistic de-risking in antiviral target validation and assay development. The approach provides a disease-relevant system for probing host-virus interactions critical to influenza polymerase function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral polymerase-chromatin interactions to validate therapeutic targets involved in viral mRNA synthesis.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow to isolate functional vRNP complexes from chromatin for target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified vRNPs from defined subcellular fractions to support biochemical assays measuring polymerase activity or inhibitor binding.
- Operational Value: Standardizes chromatin-associated vRNP preparation for scalable screening campaigns requiring quantitative readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates analysis of vRNP export complexes formed on chromatin, informing mechanisms of viral ribonucleoprotein trafficking relevant to pathogenesis.
- Operational Value: Enables comparison of vRNP composition across infection stages to support risk-adjusted advancement of antiviral candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows by providing chromatin-purified vRNPs for downstream biochemical and biophysical characterization, supporting lead identification through mechanistic insight into influenza polymerase function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of host factors regulating viral RNA synthesis by enabling isolation of chromatin-associated vRNPs.
- Screening: Delivers assay-ready vRNP preparations from cytoplasmic, nucleoplasmic, and chromatin fractions for compound screening against viral complexes.
- Analytics: Permits Western blot and primer extension analysis of purified vRNPs to quantify protein and RNA components under defined conditions.
- Translational Research: Connects chromatin-bound vRNP isolation to preclinical studies of viral RNA synthesis mechanisms and host-directed antiviral strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable subcellular fractionation and affinity purification platform applicable to other nuclear-replicating viruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target validation by enabling study of authentic chromatin-bound vRNPs implicated in viral transcription.
- Operational Value: Improves reproducibility and yield of vRNP purification through stepwise chromatin extraction, reducing variability in downstream analyses.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in influenza polymerase inhibition studies by providing access to physiologically relevant complexes.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions by clarifying structure-function relationships of viral ribonucleoproteins in disease-relevant contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in subcellular fractionation and chromatin biochemistry to maintain nuclear integrity during processing.
- Dependent on access to ultracentrifuges, microcentrifuges, and chromatography systems for fractionation and affinity purification steps.
- Necessitates standardized buffer conditions and temperature control to prevent vRNP dissociation or degradation during purification.
- Requires adaptation of salt extraction conditions when applying to different cell lines or virus strains due to variability in chromatin binding.
- Limited by the need for biosafety level 2 containment when working with infectious influenza virus, constraining high-throughput adaptation.
