Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen
3 juni 2012
Influenza virussen repliceren hun RNA genoom in samenwerking met gastheer-cel chromatine. Hier we een methode intact viraal ribonucleoproteïne complexen zuiveren van chromatine van geïnfecteerde cellen. Gezuiverd virale complexen kunnen worden geanalyseerd door zowel Western blot en primer extension eiwit en RNA inhoud respectievelijk.
Lyco negatieve streng, RNA-virussen. Het genoom van influenzavirussen is verpakt in de vorm van virale rib nucleaire eiwitcomplexen, of VR np's waarin het enkelstrengse genoom is ingekapseld door het nucleaire eiwit en geassocieerd met het curcumine polymerase complex bestaande uit de PA PB een en PB twee subeenheden om intacte complexen te zuiveren uit geïnfecteerde zoogdiercellen. Hela-cellen worden geïncubeerd met recombinant strep-gelabeld influenzavirus.
Zodra het virus de cellen binnenkomt, wordt het virale RNA gesynthetiseerd in de kern na infectie, worden de cellen gesneden om een detergens te gebruiken en gefractioneerd in cytoplasmatische nucleaire en chromatinefracties met behulp van centrifugatie en aanval-gebaseerde chromatinefractieprotocol. Ten slotte worden de strep-gelabelde VRP's affiniteitsgezuiverd uit elke fractie. Analyse van de eiwit- en RNA-samenstelling van gezuiverde VR NPS door zilverkleuring demonstreert dat het gebruik van dit protocol zelfs stevig is, chromatine gebonden VRP's kunnen worden geïsoleerd.Intact. Dus een van de belangrijkste voordelen van ons protocol in vergelijking met standaardmethoden voor het affiniteitszuiveren van influenzavirus rib nucleaire eiwitcomplexen is dat door het gebruik van onze methode, het mogelijk is om VR NPS van de chromatine van geïnfecteerde cellen te zuiveren, wat bekend staat als de plaats van influenzavirus mRNA-synthese.
Dus onze methode zou kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden over de regulatie van virale replicatie en transcriptie, zoals, bijvoorbeeld, welke virale of cellulaire factoren, maar ook welke post-translationele modificaties vereist zijn voor, bijvoorbeeld, virale mRNA-synthese of ook virale genomische RNA-synthese. Dus onderzoekers die nieuw zijn in deze methode kunnen enige moeilijkheden ondervinden omdat subnucleaire fractionering erg gevoelig is voor biochemische omstandigheden en het kan ook sterk variëren tussen verschillende cellijnen. Begin dit protocol met Hela-cellen die zijn geïnfecteerd met influenzavirus, RWSN PB twee strep, die een strep-label heeft dat genetisch gefuseerd is met het C-uiteinde van de PB twee-subeenheid bij een infectiemultipliciteit van drie.
Was de cellen eenmaal met koud PBS, voeg dan 12 milliliter koud PBS toe en verwijder ze uit de schaal. Gebruik een rubberen schraper. Breng de cellen over naar een 50 milliliter conische buis en pellet ze door centrifugatie.
Het moeilijkste aspect van deze procedure is het celfractioneringsprotocol. Celkernen zijn erg gevoelig voor homogenisatie en mengprocedures, en als het verkeerd wordt uitgevoerd, kan het gemakkelijk een chromatine-extract beschadigen. Het is dus erg belangrijk om niet alleen de homogenisatietechnieken te volgen, maar ook de algemene omgang met lysaten zoals we hier laten zien.
Volg de spin als aspirate, de PBS en Resus, suspendeert de celpellet in 10 milliliter koude sucrose buffer. Bevestig een 200 microliter pipette tip aan een 10 milliliter kunststof serum pipette en passeer de cellen erdoor om celklonten te breken. Incubeer de suspensie gedurende 10 minuten op ijs.
Periodiek de cellen voorzichtig omkeren om ze opnieuw te suspenderen. Voeg vervolgens niet IET P 40 toe tot een eindconcentratie van 0,5% en vortex met hoge snelheid gedurende 15 seconden. Onmiddellijk centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3.500 keer G bij vier graden Celsius in een tafelcentrifuge. Na het spinnen verwijdert u het supernatant en brengt u het over in een 15 milliliter conische buis.
Bewaar het supernatant bij vier graden Celsius. Dit is een cytoplasmatische fractie. De pellet zou kleiner en witter moeten zijn dan de oorspronkelijke celpellet zoals hier getoond.
Als het protocol later wordt voltooid, bewaar de celpellet bij vier graden Celsius. Anders, ga verder door de pellet te wassen in vijf milliliter koud sucrose, buffer en centrifugeer zoals eerder. Zodra het spinnen is voltooid, gooit u het supernatant weg en suspendeert u de pellet opnieuw, die de kernen bevat in 1,5 milliliter koud nucleair plasmisch extractiebuffer.
Breng de opgeschorte pellet over naar een gekoelde vier milliliter danshomogenisator met een goed passend stamper en homogeniseer de kernen met 20 slagen. Vermijd schuimvorming, de weerstand zou na ongeveer 10 slagen moeten toenemen. Om efficiënte homogenisatie te bevestigen, onderzoekt u het monster onder een fasecontrastmicroscoop.
De kernen zouden niet langer rond moeten zijn, maar onregelmatige vormen moeten hebben en lijken alsof ze zijn gebarsten. Zodra de kernen zijn gehomogeniseerd, brengt u ze over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Incubeer het homogenaat op een roterend wiel bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten.
Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 16.000 keer G in een microcentrifuge bij vier graden Celsius. Na het spinnen brengt u het supernatant over, dat de nucleaire plasmische fractie is, naar een 1,5 milliliter buis en bewaart u het bij vier graden Celsius. Hersuspendeer vervolgens het pellet in 1,5 milliliter verteringsbuffer, voorverwarmd tot 37 graden Celsius.
Incubeer vervolgens de fractie gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 42 microliters vijf molair natriumchloride toe om de uiteindelijke concentratie natriumchloride op 150 millimolair te brengen en incubeer vervolgens gedurende 20 minuten op ijs. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 16.000 keer G in een microcentrifuge bij vier graden Celsius.
Na het spinnen verwijdert u het supernatant en bewaart u het bij vier graden Celsius. Dit is de CH een 50-fractie. Hersuspendeer het pellet in 1,5 milliliter koud hoge zoutbuffer en incubeer gedurende 20 minuten op ijs.
Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 16.000 keer G in een microcentrifuge bij vier graden Celsius. Na het spinnen verwijdert u het supernatant en bewaart u het bij vier graden Celsius. Dit is de CH 500-fractie.
Haal de fracties die zijn opgeslagen tijdens het fractioneringsprotocol eruit en plaats ze op ijs. Voeg vervolgens 300 microliters vijf molair natriumchloride toe aan de cytoplasmatische fractie. Breng vervolgens 100 microliters gepakte strep T in Sphero-beads per fractie over naar een 15 milliliter conische buis.
Voeg 10 volumes
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het zuiveren van intacte virale ribonucleoproteïnecomplexen (VRNP's) uit het chromatine van met influenzavirus geïnfecteerde cellen. Het protocol maakt de analyse mogelijk van zowel het eiwit- als het RNA-gehalte van deze complexen, die cruciaal zijn voor het begrijpen van de virale replicatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Virologie
- Celbiologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Influenzavirussen repliceren hun RNA-genoom in associatie met het chromatine van de gastheercel.
- Virale ribonucleoproteïnecomplexen (VRNP's) zijn essentieel voor de synthese van viraal RNA.
- Standaardmethoden voor het zuiveren van VRNP's isoleren complexen mogelijk niet effectief van chromatine.
- Inzicht in de samenstelling van VRNP's kan leiden tot nieuwe inzichten in virale mechanismen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het zuiveren van VRNP's uit het chromatine van geïnfecteerde cellen.
- Het mogelijk maken van gedetailleerde analyse van de eiwit- en RNA-componenten van deze complexen.
- Het verbeteren van bestaande methoden voor het isoleren van VRNP's.
Gebruikte methoden
- Infecteerde HeLa-cellen met recombinant streptavidine-gelabeld influenzavirus.
- Fractioneerde cellen in cytoplasmatische, nucleaire en chromatinefracties.
- Gebruikte detergentlyse en centrifugatie voor fractionering.
- Zuiverde streptavidine-gelabelde VRNP's uit elke fractie via affiniteitszuivering.
Belangrijkste resultaten
- VRNP's succesvol geïsoleerd uit chromatine-gebonden fracties.
- De effectiviteit van het zuiveringsprotocol aangetoond via zilverkleuring.
- Aangetoond dat strak aan chromatine gebonden VRNP's geanalyseerd kunnen worden.
- Een betrouwbare methode geleverd voor het bestuderen van de samenstelling van virale complexen.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol maakt de zuivering van VRNP's uit chromatine mogelijk, wat de studie naar de biologie van het influenzavirus verbetert.
- Deze methode kan worden toegepast om mechanismen van virale RNA-synthese te onderzoeken.
- Toekomstige studies kunnen deze benadering gebruiken om andere aspecten van interacties tussen virus en gastheer te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Deze methode maakt de isolatie mogelijk van aan chromatine gebonden ribonucleoproteïnecomplexen van het influenzavirus (vRNPs) uit geïnfecteerde cellen, waarmee een belangrijke beperking bij het bestuderen van mechanismen van virale RNA-synthese wordt opgeheven. Door de extractie-efficiëntie van nucleaire vRNPs te verbeteren, ondersteunt deze methode het mechanistische de-risking bij de validatie van antivirale targets en de ontwikkeling van assays. De benadering biedt een ziekterelevante systeem voor het onderzoeken van gastheer-virusinteracties die cruciaal zijn voor de functie van de influenzapolymerase.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om interacties tussen virale polymerase en chromatine te onderzoeken om therapeutische doelwitten die betrokken zijn bij virale mRNA-synthese te valideren.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare workflow voor het isoleren van functionele vRNP-complexen uit chromatine voor studies naar target engagement.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gezuiverde vRNP's uit gedefinieerde subcellulaire fracties ter ondersteuning van biochemische assays voor het meten van polymerase-activiteit of inhibitor-binding.
- Operationele waarde: Standardiseert de preparatie van chromatine-geassocieerde vRNP's voor schaalbare screeningscampagnes die kwantitatieve read-outs vereisen.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de analyse van vRNP-exportcomplexen die op chromatine worden gevormd, wat inzicht geeft in de mechanismen van viraal ribonucleoproteïne-transport die relevant zijn voor pathogenese.
- Operationele waarde: Maakt vergelijking van de vRNP-samenstelling over verschillende infectiestadia mogelijk ter ondersteuning van de risicogebaseerde ontwikkeling van antivirale kandidaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows door chromatine-gezuiverde vRNP's te leveren voor downstream biochemische en biofysische karakterisering, wat de identificatie van lead-verbindingen ondersteunt via mechanistisch inzicht in de functie van het influenzapolymerase.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van gastheerfactoren die virale RNA-synthese reguleren door de isolatie van chromatine-geassocieerde vRNP's mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare vRNP-preparaten uit cytoplasmatische, nucleoplasmatische en chromatinefracties voor het screenen van verbindingen tegen virale complexen.
- Analyses: Maakt Western blot- en primer-extensieanalyse van gezuiverde vRNP's mogelijk om eiwit- en RNA-componenten onder gedefinieerde omstandigheden te kwantificeren.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de isolatie van chromatine-gebonden vRNP's met preklinische studies naar mechanismen van virale RNA-synthese en gastheer-gerichte antivirale strategieën.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor subcellulaire fractionering en affiniteitszuivering dat toepasbaar is op andere in de kern replicerende virussen.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door de studie van authentieke aan chromatine gebonden vRNP's die betrokken zijn bij virale transcriptie mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en opbrengst van vRNP-zuivering door stapsgewijze chromatine-extractie, waardoor de variabiliteit in downstream-analyses wordt verminderd.
- Strategische waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar influenza-polymeraseremming door toegang te bieden tot fysiologisch relevante complexen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door structuur-functie-relaties van virale ribonucleoproteïnen in ziekterelateerde contexten te verduidelijken.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in subcellulaire fractionering en chromatinbiochemie om de nucleaire integriteit tijdens de verwerking te behouden.
- Afhankelijk van toegang tot ultracentrifuges, microcentrifuges en chromatographiesystemen voor de fractionerings- en affiniteitszuiveringsstappen.
- Vereist gestandaardiseerde buffercondities en temperatuurbeheersing om dissociatie of degradatie van vRNP tijdens de zuivering te voorkomen.
- Vereist aanpassing van de zoutextractiecondities bij toepassing op verschillende cellijnen of virusstammen vanwege variabiliteit in chromatinbinding.
- Beperkt door de noodzaak van inperking op biosafety level 2 bij het werken met infectieus influenzavirus, wat de aanpassing voor high-throughput toepassingen beperkt.
