Er zijn twee methoden van Heterokaryon vorming van HCV Beperking Factoren Ontdek

Het doel van deze procedure is om de impact van restrictiefactoren op de voltooiing van de replicatiecyclus van het hepatitis C-virus in een willekeurige cellijn te onderzoeken, gebruikmakend van twee methoden die steunen op de vorming van heca. Begin bij de eerste methode met het kweken van menselijke levercellen alsook heal A- en Hep 56 1D-verpakkingscellen. Transfect vervolgens hepatitis C-virus of HCV-RNA in de levercellen via electroporatie. Fuseer daarna de HCV-replicerende cellijn met de respectievelijke verpakkingscellijn middels polyethyleenglycol in de tweede fusiemethode. De eerste stap is de productie van een HCV-stock met een hoge titer.

Verschillende cellijnen worden vervolgens gecocultiveerd en celversmelting wordt geïnduceerd door transfectie van het prototype foamy virus-glycoproteïne. Vervolgens worden de heterokaryonen geïnfecteerd met HCV. Na beide methoden van heterokaryonvorming wordt fluorescentiemicroscopie uitgevoerd om de versmelting te bevestigen en wordt de productie van infectieuze deeltjes gekwantificeerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze nuttig is voor het screenen van een groot panel van cellijnen en primaire cellen op de expressie van HV-specifieke dominante restrictiefactoren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de soortspecificiteit en normen van HCV. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel om het begrip van de onderliggende concepten van de twee fusiesystemen vóór de inductie van celfusie door polyethyleenglycol te vergemakkelijken.

HUH 7.5-cellen worden getransfecteerd met H-C-V-R-N-A volgens standaardprotocollen en gedurende 24 uur gekweekt bij 37 °C en 5% CO2. Oogst de volgende dag de getransfecteerde HUH 7.5-cellen die het subgenomische replicon bevatten, evenals de heal R- en he 56 1D-packagingscellen. Deze packagingscellen zijn genetisch gemodificeerd om de HCV-eiwitten core, E1, E2, P7 en NS2 ectopisch te expresseren. Resuspendeer de cellen na trypsinisatie in compleet DMEM-medium en verdun de celsuspensies tot de volgende concentraties: HUH 7.5 tot 5 × 10⁵ cellen per mL en heal- en hep 56 1D-cellen tot 2 × 10⁵ cellen per mL.

Bereid vervolgens een zeswellls kweekplaat voor met twee tot drie steriele glazen dekglasjes per well. Voor verdere analyse van de fusie-efficiëntie combineert u één milliliter getransfecteerde HUH 7.5-cellen met één milliliter verpakkingscellen en zaait u deze uit in één well van de zeswells plaat; incubeer dit gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Controleer na 24 uur de celdichtheid.

De celdichtheid moet tussen 60% en 80% confluentie liggen vóór de inductie van celFusie, zodat de cellen dicht genoeg bij elkaar staan om de celmembranen te laten fuseren. Aspireer het medium van de co-gecultiveerde cellen en was één keer met 1 mL PBS. Voeg vervolgens voorzichtig 500 µL voorverwarmd 40% polyethyleenglycol of PEG 1.500 toe. Voeg 500 µL PBS toe aan een andere well met co-gecultiveerde cellen als controle. Incubeer vijf minuten bij 37 °C om de vorming van heterokaryonen te induceren. Aspireer het PEG en voeg voorzichtig 2 mL PBS toe. Aspireer na één minuut het PBS en voeg 2 mL vers PBS toe. Was 3 tot 5 keer met PBS gedurende één minuut per wasbeurt om overtollig PEG te verwijderen.

Voeg ten slotte twee milliliters DMEM, compleet medium, toe aan elke put en incubeer bij 37 degrees Celsius en 5%carbon dioxide gedurende 48 uur. 48 uur na fusie: verzamel elke SNAT en filtreer deze door een 0,45 micron filter. Na het verzamelen van de celcultuur-snat kan de fusie-efficiëntie worden bepaald via immunofluorescentie; was de putten met glazen dekglasplaatjes één keer met één milliliter PBS gedurende één minuut.

Fixeer de cellen met 600 µL 3% paraldehyde in PBS gedurende 15 minuten. Was drie keer met PBS gedurende één minuut per wasbeurt. Gebruik een pincet om de dekglasjes voorzichtig over te brengen naar een 24-well plaat en maak de cellen permeabel met 500 µL 0,5% Triton X 100 in PBS gedurende vijf minuten.

Was vervolgens drie keer met PBS en breng 250 microliters van de primaire antilichaamoplossing aan in elke well. Gebruik anti-NS5a-antilichaam in een concentratie van 0,5 micrograms per milliliter en humaan monoklonaal anti-E2-antilichaam in een concentratie van 6,4 nanograms per milliliter. Incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur; was na 45 minuten drie keer met PBS.

Voeg vervolgens 250 µL secundaire antilichamen toe aan elke put; hiervoor worden secundaire geit anti-muis of geit anti-mens IgG-specifieke antilichamen geconjugeerd aan Alexa Fluor 546 of Alexa Fluor 488 gebruikt in een concentratie van 2 µg/mL. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was na 30 minuten één keer met PBS.

Kleur vervolgens de celkernen met 250 µL DPI, verdund 1:3000 in PBS. Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur in het donker, was vier keer met PBS en één keer met water. Monteer tot slot de dekglasjes ondersteboven op een druppel flora mount op een objectglas en laat deze in het donker drogen.

Om deze procedure te starten, oogst en bereid u enkelcel-suspensies van de volgende cellen: de Luna NA menselijke levercellijn die geen endogene expressie van CD 81 vertoont, He r packaging-cellen en Hep 56 1D-cellen die menselijk CD 81 stabiel tot expressie brengen. Co-cultiveer Luna n-cellen met he r-cellen in een verhouding van een op een en met Hep 56 1D HCD 81-cellen in een verhouding van een op twee, wat resulteert in een totale celdichtheid van 1,5 × 10⁵ cellen per 12.

Incubeer de wells gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% carbon dioxide. Transfect de cellen de volgende dag transiënt met een hoog-expressief PFE-envelopeiwit met behulp van lipofectamine 2000 volgens de instructies van de fabrikant. Inoculeer 30 uur na transfectie met het PFE-glycoproteïne de heterokleuren met 350 µL van een eerder bereide virusvoorraad bij een MOI van ongeveer 2,3.

Incubeer gedurende 12 uur bij 37 °C en 5% CO₂. Was de volgende ochtend één keer met PBS en voeg één milliliter compleet DMEM-medium per well toe. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% CO₂. Oogst na 48 uur het supernatant van de heterokaryonculturen en filter het supernatant door een 0,45 µm filter. Gebruik vervolgens het supernatant om HUH 7.5-cellen te inoculeren, die de dag ervoor in 96-wells platen waren uitgezaaid in een limiting dilution assay. Incubeer gedurende 72 uur voordat de productie van infectieuze nakomelingdeeltjes wordt gekwantificeerd.

De procedure voor het visualiseren van fusiegebeurtenissen moet worden voltooid voordat de co-cultuur wordt gestart. Was de adherente cellen zes uur voor het zaaien eenmaal met 5 mL PBS en voeg vervolgens 4 mL van de geschikte DI-oplossing per 10 cm schaal toe. Incubeer de cellen 45 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Was de cellen eenmaal gedurende één minuut met 5 mL PBS en voeg vervolgens DMEM compleet medium toe. Incubeer zes uur bij 37 °C en 5% CO2 voor het zaaien. Plaats een dekglasje in elke put van de 12-wells plaat; zaai daarna de cellen uit en transfecteer en kleur ze zoals eerder beschreven. Was de cellen 30 uur na transfectie voorzichtig gedurende één minuut met 1 mL PBS en fixeer de cellen vervolgens met 250 µL 3%paraldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Was de cellen één keer gedurende één minuut met 1 mL PBS en kleur ze vervolgens één minuut met dappy; nadat de cellen één keer met PBS en één keer met water zijn gewassen, worden de dekglasjes, zonnebrillen en objectglazen gemonteerd in de eerste benadering om de impact van restrictiefactoren op de voltooiing van de HCV-replicatiecyclus te onderzoeken. In heterokaryonen werden HUH 7.5-cellen eerst transient getransfecteerd met een subgenomische replicon die een luciferase-transgen en HCV-niet-structurele eiwitten tot expressie brengt, en vervolgens gecocultiveerd en gefuseerd met cellijnen die HCV-structurele eiwitten core en accessoire eiwitten tot expressie brengen. Een representatief resultaat is afgebeeld in deze figuur; cellen zijn immunogekleurd met monoclonale antilichamen tegen het E2-structurele eiwit en het NS5A-niet-structurele eiwit.

De afbeeldingen in de bovenste panelen laten zien dat er na behandeling met PEG signalen voor zowel MS five A als D two gelijktijdig in hetzelfde cytoplasma werden gedetecteerd, wat wijst op zelffusie. In contrast hiermee laten de onderste panelen zien dat er geen fusie werd geïnduceerd wanneer de gecocultureerde cellen met PBS werden behandeld. Er werd dus geen colocalisatie van signalen waargenomen om de virale infectiviteit te kwantificeren; supernatanten werden verzameld uit de cocultures op 48 uur na inductie van de fusie en gebruikt om naïeve HUH 7.5-cellen te inoculeren voor daaropvolgende luciferase-assays.

In deze grafiek worden de gemiddelde waarden van drie onafhankelijke experimenten weergegeven. De grijze horizontale balk vertegenwoordigt de achtergrond voor relatieve lichteenheden of RLU, bepaald in niet-geïnfecteerde HUH 7.5-cellen. Opmerkelijk is dat er geen infectiviteit werd gedetecteerd in de kweekvloeistoffen wanneer HUH 7.5-replicantcellen werden gefuseerd met naïeve cellijnen of werden behandeld met PBS als controle.

Wanneer echter celversmelting tussen de HUH 7.5 replicon- en packaging-cellijnen werd geïnduceerd door PEG, werden infectieuze virusdeeltjes afgegeven aan de kweekvloeistoffen. Dit geeft aan dat virusproductie celversmelting en expressie van virale eiwitten in de packaging-cellijnen vereist; opvallend genoeg maakten niet alleen de heterokaryonen van HUH 7.5 menselijke hepatomacellen, maar ook heterokaryonen met menselijke niet-levercellen en muizenlevercellen de afgifte van virussen mogelijk, wat aantoont dat assemblage en afgifte niet dominant worden geremd door mogelijke restrictiefactoren in deze celtypen. In een alternatieve benadering werd somatische celversmelting geïnduceerd door de expressie van een genisch glycoproteïne na cultivatie van de cellen.

Heterokaryonen werden gevisualiseerd door afzonderlijke cellijnen te kleuren met cell tracker-kleurstoffen voorafgaand aan co-cultivatie en transfectie met het genische eiwit; de cellen werden 30 uur na transfectie gefixeerd en gekleurd met DPI, en een representatief resultaat wordt in deze figuur getoond. De fusie van twee celtypen wordt aangegeven door een heterokaryon met homogeen verdeelde kleurstoffen binnen het cytoplasma, zoals hier wordt geïllustreerd. Daarentegen tonen de afbeeldingen in het onderste paneel de afwezigheid van cellen met een dubbel gekleurd cytoplasma, wat wijst op de afwezigheid van celfusie.

Deze laatste grafiek laat zien dat alle HCV-intrefactoren alleen tot expressie komen in hetero-carriers van Luna N-cellen met hela- of Hep 56 1D-cellen die het menselijke CD 81 tot expressie brengen. Hier werden de culturen geïnoculeerd met infectieuze HCV-partikels. De cultuurvloeistoffen werden 48 uur later verzameld en de de novo partikelvrijgave uit hetero-carriers werd bepaald via een limiting dilution assay met gebruik van naïeve HUH 7.5-doelcellen; de gemiddelde waarden van drie onafhankelijke experimenten worden weergegeven en de grijze horizontale balk representeert de detectielimiet van de assay.

Als controle werden lunar N-cellen gefuseerd met lunar N-cellen, wat resulteerde in zeer lage niveaus van infectieus HCV, dicht bij de detectielimiet. Vergelijkbare resultaten werden verkregen toen lunar N-cellen werden gefuseerd met naïeve HEP 56 1D-cellen. In beide gevallen was het menselijke CD 81 afwezig, waardoor HCV de heterokaryonen niet productief kon infecteren.

In tegenstelling hiermee werd de novo productie van infectieuze virale nakomelingen waargenomen, ongeveer tienvoudig boven de achtergrond van de assay, in lunar 10-cellen gefuseerd met heer en in lunar hand-cellen gefuseerd met HEP 56 1D-cellen die menselijk CD 81 tot expressie brachten. Dit geeft aan dat HCV zijn replicatiecyclus in RetroCars succesvol heeft voltooid, waardoor de expressie van dominante restrictiefactoren in deze cellijnen is uitgesloten. Eenmaal beheerst kan de volledige experimentele procedure in één week worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hetero-caryons genereert voor de identificatie van mogelijke HV-restrictiefactoren. Vergeet niet dat werken met het hepatitis C-virus extreem gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals een hoog niveau van biosafety, altijd in acht moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.