Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardige menselijke endotheelcellen te isoleren en deze te gebruiken om de mechanismen die de transmigratie van neutrofielen onder underflow-condities reguleren te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst menselijke endotheelcellen uit de navelstrengvene te isoleren en uit te platen. De tweede stap is het splitsen van de cellen naar IBD-kamers.

Vervolgens worden vers geïsoleerde menselijke neutrofielen over geactiveerde endotheelcellen verspreid, wat resulteert in rollen, stevige adhesie en transmigratie van de neutrofielen. De laatste stap is het kwantificeren van de transmigratie met behulp van videomicroscopie. Uiteindelijk kan fluorescentie- en lichtveldmicroscopie worden gebruikt om de transmigratie van neutrofielen over geactiveerde endotheelcellen te evalueren.

De isolatie van endotheelcellen is eenvoudig te beschrijven, maar moeilijk aan te leren, mede omdat cruciale stappen de visualisatie van de navelstreng vereisen. Om deze reden is een visuele demonstratie van deze methode essentieel. Deze methode zal ons helpen om kernvragen binnen het vakgebied van ontstekingen te beantwoorden, zoals de wijze waarop leukocytenrekrutering plaatsvindt onder stromingscondities, en zal zorgen voor een beter begrip van hoe endotheelcellen zich gedragen onder stromingscondities.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in de rekrutering van neutrofielen tijdens inflammatie, kan deze ook worden toegepast op zeldzame leukocytenpopulaties, zoals natural killer-cellen en eosinofielen. Hong Jang, een laborant in mijn laboratorium, demonstreert deze procedure samen met Ritu Sharma. Minstens één uur voor de procedure moet een T 75-fles met gelatine bij 37 °C worden geïncubeerd.

Begin vervolgens met de procedure voor de isolatie van endotheelcellen in de laminaire flowkast door met een schaar een navelstreng van een placenta af te knippen. Trek na het aantrekken van steriele handschoenen de streng nauwkeurig na en verwijder alle delen die bloedstolsels bevatten of beschadigd zijn door het afklemmen van de streng tijdens de bevalling. Identificeer daarna de twee arteriën en de enkele vene in de streng.

Voeg vervolgens voorzichtig een canule met een bevestigde tweewegstopkraan in één uiteinde van de ader in, en plaats daarna een klem rond de canule om deze stevig op zijn plaats te houden. Een van de moeilijkste onderdelen van de procedure is de perfusie van de navelstreng. Om te garanderen dat dit succesvol gebeurt, perfuseert u de streng met een overmaat aan buffer en volgt u de stroom tot deze helder is.

Perfuseer de ader met navelstrengbuffer tot de doorstroom helder is en klem vervolgens het uiteinde van de navelstreng af. Tijdens de perfusie wordt er af en toe een klein gaatje zichtbaar doordat artsen navelstrengbloed uit de navelstreng hebben verwijderd. In deze situaties kunnen hemostaten worden gebruikt om het gat te blokkeren, zodat de perfusie kan worden voortgezet terwijl de endotheelcellen worden geïsoleerd.

Het is van cruciaal belang om de behandeling met collagenase nauwkeurig te timen. Bij een te korte tijd worden er onvoldoende endotheelcellen geoogst; bij een te lange tijd kunnen contaminatie door gladde spiercellen of beschadiging van de endotheelcellen optreden. Perfuseer vervolgens de vene met vers bereide warme collagenase.

Sluit de stopkraan en incubeer het navelstrengfragment in een bekerglas met warme navelstrengbuffer. Verwijder het fragment na 10 minuten en masseer het voorzichtig om de endotheelcellen los te maken van het lumen van de ader. Laat de oplossing in een buis met vijf milliliter endotheelcelmedium of ECM lopen, waarbij het navelstrengfragment tweemaal met navelstrengbuffer wordt doegespoeld om eventuele resterende cellen te verwijderen.

Centrifuge de cellen nu 10 minuten bij 3 x 50 g. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant en resuspendeer vervolgens het pellet. Breng de cellen in 10 milliliters endotheelcelmedium over naar de met gelatine gecoate T 75-fles en kweek de endotheelcellen een nacht bij 37 °C en 5% CO2. Schud de volgende dag de fles voorzichtig om eventuele rode bloedcellen los te maken.

Verwijder vervolgens het supernatant en was de endotheelcelcultuur met warme HBSS. Na het verwijderen van de HBSS worden de cellen gevoed met 10 milliliters warme ECM. Inspecteer vervolgens de cellen onder de microscoop om te controleren of de rode bloedcellen zijn verwijderd en om de mate van confluentie en de morfologie van de endotheelcellen te evalueren.

Vervang elke drie dagen het medium totdat de cellen confluent zijn. Splits op dat moment de cellen met behulp van een trypsin- en EDTA-oplossing. Oogst vervolgens de losgekomen cellen en resuspendeer deze in ECM.

Coat ten slotte elke put van een IBD-kamer met gelatine. Verwijder de overtollige gelatine en voeg vervolgens 1,5 × 10⁶ per milliliter van de endotheelcel-suspensie toe aan elke put van de kamer. Begin met het induceren van de upregulatie van de expressie van adhesie- en activatiemoleculen op het celoppervlak door de endotheelcellen te incuberen met een passende stimulant terwijl de endotheelcellen worden geactiveerd.

Isoleer neutrofielen uit het perifere bloed van gezonde menselijke vrijwilligers via dichtheidsgradientcentrifugatie zoals eerder gepubliceerd, en suspendeer de cellen vervolgens in HBSS met humaan albumine in een concentratie van 1 x 10⁶ per milliliter. Nadat de microscoop is ingesteld, wordt de IBD-kamer met de gestimuleerde endotheelcellen aan de slang van de microscoop bevestigd. Selecteer het 10x fasecontrastobjectief en stel de spuitpomp vervolgens in om HBSS te trekken en de stroming bij de gewenste schuifspanning te starten.

Stop de stroom kortstondig door de driewegkraan aan de uitlaatzijde naar de uit-stand te draaien en de inlaatlijn om te schakelen van HBSS naar geïsoleerde neutrofielen. Start de stroom opnieuw door de kraan terug naar de aan-stand te draaien. Begin vervolgens met het opnemen met een CCD-camera die is aangesloten op een DVD-recorder.

Start de timer. Wanneer de neutrofielen na vier minuten de kamer binnenkomen, wordt er teruggeschakeld naar HBSS om de aanhechting van nieuwe neutrofielen te voorkomen. Indien gegevens voor het totaal aantal interacties, rollende adhesie en stevige adhesie gewenst zijn, dient een 10x fasecontrastobjectief te worden gebruikt.

Gebruik een objectief om zes willekeurige velden gedurende elk 10 seconden te beelden tussen minuut vier en vijf. Schakel vervolgens over naar een 40 x objectief en leg op het tijdstip van belang één enkel gezichtsveld vast. Verzamel na de neutrofielenperfusie bij 10 minuten tussen de vijf en 10 willekeurige gezichtsvelden.

Niet-gestimuleerde endotheelcellen ondersteunen geen rekrutering van neutrofielen. Daarom tonen de volgende figuren neutrofielen die interageren met TNF alpha-gestimuleerde endotheelcellen. Let op de adharente neutrofiel, aangegeven door de gele pijlspunt, en de transmigrerende neutrofiel, aangeduid door de witte pijlspunt.

Neutrofieltransmigratie kan plaatsvinden bij celverbindingen of via de endotheelcellen zelf. Om onderscheid te maken tussen deze twee condities, werden de endotheelcellen gelabeld met een anti-VE-coherent antilichaam. Zoals hier in het rood te zien is, wordt transmigratie gescoord als paracellulair of transcellulair.

In dit model is vrijwel alle transmigratie paracellulair, zoals aangetoond door deze figuur waarin de vorige twee figuren over elkaar zijn gelegd. In de eerste van de drie grafieken werden neutrofiel-interacties onderzocht en gemeten met behulp van Image J-software. Let op dat er significant meer interacties tussen neutrofielen en endotheelcellen plaatsvonden bij TNF alpha-geactiveerde endotheelcellen dan bij de controle-ongestimuleerde endotheelcellen.

De totale hoeveelheid interagerende cellen werd verder gekarakteriseerd als rollend, stevig adherent of transmigrerend, zoals voorheen beschreven. Er trad significant meer neutrofielentransmigratie op in de putjes die geactiveerde endotheelcellen bevatten na isolatie van de endotheelcellen. Andere methoden, zoals western blotting, real-time PCR en endotheelresistentie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking aan de biologie van endotheelcellen na ontwikkeling.

Deze methode helpt onderzoekers op het gebied van ontsteking en vasculaire biologie te begrijpen hoe leukocytenrekrutering plaatsvindt onder stroomcondities in een menselijk modelsysteem. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe menselijke navelstrengader-endotheelcellen te isoleren en hoe deze te gebruiken om neutrofielentransmigratie onder stroomcondities te bestuderen met behulp van een ity-kamer.