Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardige menselijke endotheelcellen te isoleren en deze te gebruiken om de mechanismen die de transmigratie van neutrofielen reguleren onder underflow-condities te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst menselijke navelstrengvene-endotheelcellen te isoleren en uit te platen. De tweede stap is het splitsen van de cellen in IBD-kamers.

Vervolgens worden vers geïsoleerde menselijke neutrofielen over geactiveerde endotheelcellen verspreid, wat resulteert in het rollen, de stevige adhesie en de transmigratie van neutrofielen. De laatste stap is het kwantificeren van de transmigratie met behulp van videomicroscopie. Uiteindelijk kunnen fluorescentie- en brightfieldmicroscopie worden gebruikt om de transmigratie van neutrofielen over geactiveerde endotheelcellen te evalueren.

Het isoleren van endotheelcellen is eenvoudig te beschrijven, maar moeilijk te leren, mede omdat cruciale stappen de visualisatie van de navelstreng vereisen. Om deze reden is een visuele demonstratie van deze methode essentieel. Deze methode zal ons helpen om kernvragen binnen het vakgebied van ontstekingen te beantwoorden, zoals de wijze waarop de rekrutering van leukocyten plaatsvindt onder stromingscondities, en zorgt voor een beter begrip van hoe endotheelcellen zich gedragen onder stromingscondities.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de rekrutering van neutrofielen tijdens ontsteking, kan deze ook worden toegepast op zeldzame leukocytenpopulaties zoals natural killer-cellen en eosinofielen. Hong Jang, een technicus in mijn laboratorium, demonstreert deze procedure samen met Ritu Sharma. Minstens één uur voor de procedure moet een T 75-fles met gelatine bij 37 °C worden geprepareerd en vervolgens worden geïncubeerd.

Begin vervolgens de procedure voor de isolatie van endotheliale cellen in de laminaire flowkast door met een schaar een navelstreng van een placenta af te knippen. Trek steriele handschoenen aan, inspecteer de navelstreng zorgvuldig en verwijder alle delen die bloedstolsels bevatten of beschadigd zijn door het afklemmen van de navelstreng tijdens de bevalling. Identificeer vervolgens de twee arteriën en de enkele vene in de navelstreng.

Voer vervolgens voorzichtig een canule met een bevestigde tweewegkraan in één uiteinde van de ader in, en plaats daarna een klem rond de canule om deze stevig op zijn plaats te houden. Een van de lastigste delen van de procedure is de perfusie van de navelstreng. Om te garanderen dat dit succesvol gebeurt, wordt de streng geperfundeerd met een overmaat buffer; observeer de doorstroming totdat deze helder is.

Perfuseer de ader met navelstrengbuffer totdat de doorstroming helder is en klem vervolgens het uiteinde van de navelstreng af. Tijdens de perfusie komt er af en toe een klein gaatje aan het licht omdat artsen navelstrengbloed uit de navelstreng hebben verwijderd. In dergelijke situaties kunnen hemostaten worden gebruikt om het gaatje te blokkeren, zodat de perfusie kan worden voortgezet terwijl de endotheelcellen worden geïsoleerd.

Het is van cruciaal belang om de behandeling met collagenase nauwkeurig te timen. Bij een te korte duur worden er onvoldoende endotheelcellen geoogst; bij een te lange duur kunnen contaminatie door gladde spiercellen of schade aan de endotheelcellen optreden. Perfuseer de ader vervolgens met vers bereid warm collagenase.

Sluit de stopkraan en incubeer de navelstreng in een bekerglas met warme cordbuffer. Verwijder de navelstreng na 10 minuten en masseer deze voorzichtig om de endotheelcellen los te maken van het lumen van de ader. Giet de oplossing in een buis met vijf milliliters endotheelcelmedium of ECM, waarbij de navelstreng tweemaal wordt gespoeld met cordbuffer om alle resterende cellen te verwijderen.

Centrifuge de cellen nu 10 minuten bij 350 ×g. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant en resuspendeer vervolgens het pellet. Breng de cellen over naar een met gelatine gecoate T 75-fles in 10 milliliters endotheelcelmedium en kweek de endotheelcellen overnight bij 37 °C en 5% CO2. Schud de fles de volgende dag voorzichtig om eventuele rode bloedcellen los te maken.

Verwijder vervolgens het supernatant en was de endotheelcelcultuur met warm HBSS. Na het verwijderen van het HBSS worden de cellen gevoed met 10 milliliters warm ECM. Onderzoek vervolgens de cellen onder de microscoop om te controleren of de rode bloedcellen zijn verwijderd en om de mate van confluentie en de morfologie van de endotheelcellen te evalueren.

Vervang het medium elke drie dagen totdat de cellen confluentie bereiken. Splits de cellen op dat punt met behulp van een trypsine- en EDTA-oplossing. Oogst vervolgens de losgekomen cellen en resuspendeer deze in ECM.

Coat tenslotte elke put van een IBD-kamer met gelatine. Verwijder het overtollige gelatine en voeg vervolgens 1,5 × 10⁶ per milliliter van de endotheelcel-suspensie toe aan elke put van de kamer. Begin met het induceren van de upregulatie van de expressie van adhesie- en activeringsmoleculen op het celoppervlak door de endotheelcellen te incuberen met een geschikte stimulant terwijl de endotheelcellen worden geactiveerd.

Isoleer neutrofielen uit het perifeer bloed van gezonde menselijke vrijwilligers via dichtheidscentrifugatie zoals eerder gepubliceerd, en suspendeer de cellen vervolgens op een concentratie van 1 × 10⁶ per milliliter in HBSS plus humaan albumine. Nadat de microscoop is ingesteld, bevestigt u de IBD-kamer met de gestimuleerde endotheelcellen aan de slang van de microscoop. Selecteer het 10x fasecontrastobjectief en stel de spuitpomp vervolgens in om te trekken en de stroom van HBSS bij de gewenste schuifspanning te starten.

Stop de stroom kortstondig door de driewegkraan aan de uitlaatzijde naar de uit-stand te draaien en de inlaatlijn om te schakelen van HBSS naar geïsoleerde neutrofielen. Start de stroom opnieuw door de kraan terug te draaien naar de aan-stand. Begin vervolgens met het opnemen met behulp van een CCD-camera die is aangesloten op een DVD-recorder.

Start de timer. Wanneer de neutrofielen na vier minuten de kamer binnengaan, schakelt u terug naar HBSS om de aanhechting van nieuwe neutrofielen te voorkomen. Indien gegevens over het totaal aantal interacties, rollende adhesie en stevige adhesie gewenst zijn, gebruikt u een 10 x fasecontrast.

Gebruik een objectief om zes willekeurige velden gedurende elk 10 seconden te beelden tussen minuut vier en vijf. Schakel vervolgens over naar een 40 x objectief en registreer één enkel gezichtsveld op het tijdstip van belang. Verzamel na de neutrofielenperfusie bij 10 minuten tussen de vijf en 10 willekeurige gezichtsvelden.

Niet-gestimuleerde endotheelcellen ondersteunen de rekrutering van neutrofielen niet. Daarom tonen de volgende figuren neutrofielen die interageren met TNF alpha-gestimuleerde endotheelcellen. Let op de adherente neutrofiel, aangegeven door de gele pijlpunt, en de transmigrerende neutrofiel, aangeduid door de witte pijlpunt.

Neutrofielentransmigratie kan plaatsvinden bij celverbindingen of via de endotheelcellen zelf. Om onderscheid te maken tussen deze twee condities, werden de endotheelcellen gelabeld met een anti-VE-coherent antilichaam. Zoals hier in het rood te zien is, wordt de transmigratie gescoord als paracellulair of transcellulair.

In dit model is vrijwel alle transmigratie paracellulair, zoals aangetoond door deze figuur waarin de overlay van de twee voorgaande figuren wordt getoond. In deze eerste van de drie grafieken werden interacties van neutrofielen onderzocht en gemeten met behulp van ImageJ-software. Merk op dat er significant meer interacties tussen neutrofielen en endotheelcellen plaatsvonden bij neutrofielen en met TNF-alpha geactiveerde endotheelcellen dan bij de controlegroep met ongestimuleerde endotheelcellen.

De totale aantal interagerende cellen werden verder gekarakteriseerd als rollend, stevig adherent of transmigrerend, zoals voorheen. Er vond significant meer neutrofiele transmigratie plaats in de wells met geactiveerde endotheelcellen na de isolatie van de endotheelcellen. Andere methoden zoals western blotting, real-time PCR en endotheelresistentie kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen met betrekking tot de biologie van endotheelcellen na ontwikkeling te beantwoorden.

Deze methode helpt onderzoekers op het gebied van inflammatie en vasculaire biologie te begrijpen hoe de rekrutering van leukocyten plaatsvindt onder stroomcondities in een menselijk modelsysteem. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe menselijke navelvene-endotheelcellen kunnen worden geïsoleerd en hoe deze kunnen worden gebruikt om neutrofielen-transmigratie onder stroomcondities te bestuderen met behulp van een ity-kamer.