Name: Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer de isolatie van humane navelstreng endotheelcellen en hun toepassing bij het bestuderen van neutrofielen-transmigratie onder stroomtoestanden. Deze methode maakt live-cell fluorescentiebeeldvorming mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr Pina Colarusso en de live cell imaging faciliteit voor hun hulp bij beeldvorming en beeldanalyse, mevrouw Lailey voor haar technische bijstand, en eenheid 51 aan de voet Hospital in Calgary, AB voor het verstrekken van de menselijke navelstrengen. Dr KD Patel is een Alberta innoveert: Health Solutions Scientist. Dit werk werd ondersteund door een exploitatiesubsidie ​​van de Canadese Institutes for Health Research en uitrusting en infrastructuur subsidies van de Canadese Stichting voor Innovatie en de Alberta Wetenschap en Onderzoek Autoriteit.

1. Isolatie en onderhoud van de Mens vasculaire endotheelcellen <ol><li> Niveau 2 bioveiligheid procedures moeten worden gebruikt bij het werken met menselijk bloed en weefsel. Met een schaar knippen de stekker uit de placenta en dan nauw aan het snoer te onderzoeken voor de vorming van bloedstolsels en schade veroorzaakt door het klemmen van het snoer tijdens de bevalling. Knip en gooi deze gedeelten van het snoer. </li><li> Bereid collagenase oplossing bij 1 mg / ml door het gieten van 50 ml warme snoer buffer in een buis die 50 mg collagenase bevat. </li><li> Verander in steriele handschoenen en open een geautoclaveerd instrument lade met gesteriliseerd stompe canules, koord klemmen, scharen, drie-weg stop-hanen en gaas in een laminaire stroming kap. </li><li> Identificeer de twee slagaders en de gemeenschappelijke ader in de kabel. De slagaders zijn kleiner en hebben de neiging om strak ingesnoerd, terwijl de ader is groot en makkelijk te canule. Om het bloed te spoelen uit de ader, leg deze dan zachtjes een canule met een twee-weg kraantje in bijlage aan het iNTO het ene uiteinde van de ader en plaats een klem rond canule te stevig vasthoudt op zijn plaats. Perfuseren koord buffer door de ader. Herhaal dit totdat de stroom door helder is en vervolgens vast te klemmen aan het einde van het snoer. </li><li> Perfuseren collagenase in de ader, sluit de kraan, plaatst u de stekker in een bekerglas met warm snoer buffer en incubeer gedurende 10 minuten. Na 10 minuten, verwijder het snoer en zachtjes masseren van de kabel aan endotheelcellen los te maken van het lumen van de ader. Giet de oplossing in de buis met endotheelcellen media (ECM). Spoel met koord buffer twee keer om de resterende cellen te verwijderen. Giet de oplossing in dezelfde buis. </li><li> Centrifugeer de cellen op 350 xg gedurende 10 minuten tot pellet de endotheelcellen. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 10 ml van ECM aan de pellet. Voorzichtig de cellen opnieuw in suspensie in ECM, vervolgens over de cellen van een T75 fles pre-coated met 0,2% gelatine. Pre-coating met gelatine is gedaan ten minste 1 uur bij 37 ° C. Groei de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> De volgende dag, schud de kolf te verjagen alle rode bloedcellen dan het supernatans verwijderen en wassen met gebalanceerde zoutoplossing warme Hank&#39;s (HBSS). Verwijder HBSS en voeden de cellen met 10 ml warm ECM. Onderzoek van de cellen onder de microscoop dat de rode bloedcellen werden verwijderd. Evalueer de mate van samenloop en de morfologie van de endotheelcellen. Endotheelcellen dit stadium worden verlengd met geen spoor van vacuolen. </li><li> Ga verder naar de media te veranderen om de drie dagen tot cellen te bereiken confluentie, dan splitsen cellen met behulp van een 0,08% oplossing van trypsine met 1 mM EDTA. Plaat endotheelcellen gewenste schotels vooraf bekleed met 0,2% gelatine. De cellen moeten komen samenvloeiing in 3-6 dagen. </li><li> Bij gebruik ibidi kamers, voorlaag elke kamer met 0,2% gelatine. Verwijder het teveel aan gelatine en fibronectine en voeg dan 1,5 x 10 6 / ml van endotheliale cellen gesuspendeerd in ECM in de kamer. Wijzig de media om de andere dag tot confluent. De cellen moeten confluerende in 2-3 dagen, afhankelijk van het snoer. </li></ol> 2. Voorbereiding van Neutrofielen <ol><li> Neutrofielen werden geïsoleerd uit het perifere bloed van gezonde vrijwilligers met dichtheid centrifugeren. Een gedetailleerd protocol met een visuele demonstratie voor neutrofielen isolatie zijn te vinden in de eerder nummer van dit tijdschrift 6. Eenmaal geïsoleerd hersuspenderen neutrofielen in een concentratie van 1x10 6 / ml in HBSS met 0,5% menselijk albumine. </li></ol> 3. Het instellen van de Ibidi Kamer <ol><li> Groei endotheelcellen in een gelatine beklede ibidi kamer. Onderzoek ze elke dag met behulp van fase-contrast-microscopie tot ze stevig confluent. </li><li> Stimuleren endotheelcellen de expressie van adhesie en activering moleculen te verhogen. Voor de toepassing van dit protocol werden endotheelcellen gestimuleerd met 10 ng / ml recombinant TNF-α gedurende vier uur bij 37 ° C en 5% CO <sub&gt; 2 voorafgaand aan het instellen van de ibidi kamer voor beeldvorming onder stromingscondities. </li><li> Bereid de microscoop, en spuit pomp als visueel beschreven door Wiese en collega&#39;s 11 met gebruik van een lege ibidi kamer. </li><li> Belangrijkste verschillen tussen dit protocol en de Wiese procedure onder meer het vooraf invullen van de slang om de blootstelling van de endotheelcellen aan de lucht te voorkomen, het handhaven van de buffer bij 37 ° C met behulp van een waterbad, met behulp van PharMed slang aan op de buffer te houden van het verliezen van de temperatuur en het gebruik van verschillende doelstellingen met betrekking tot de microscoop, afhankelijk van de vraag of beeldvorming met fase-contrast of fluorescentie. </li><li> Zodra de microscoop is ingesteld en de slang is gevuld met HBSS, sluit u alle kranen en verwijder de lege ibidi kamer. </li><li> Sluit de ibidi kamer met TNF-α endotheelcellen gestimuleerd om de slang. </li></ol> 4. Neutrofielen Werving en Transmigratie <ol><li> Visualiseer de endotheelcellen monolaag in de Microscopa met een 10x fasecontrast doelstelling. </li><li> Stel de spuitpomp te trekken en beginnen de stroom van HBSS op de gewenste schuifspanning (typisch tussen 0,5 tot 2 dyn / cm 2). </li><li> Aan de inlaatzijde, overstap van HBSS naar geïsoleerde neutrofielen (1x10 6 / ml) door te draaien aan de drie-weg stop-pik. </li><li> Begin met opnemen met behulp van een CCD-camera ofwel aangesloten op een DVD-recorder of rechtstreeks aangesloten op de computer. Start de timer als neutrofielen in te voeren de kamer. Perfuseren neutrofielen gedurende vier minuten. Een totaal van 3 ml van de neutrofielen vering is voldoende voor een enkel experiment. </li><li> Na vier minuten, ga terug naar HBSS naar de bijlage van nieuwe neutrofielen te voorkomen. Indien gegevens voor de totale interactie, rollen en stevige adhesie gewenst zijn, afbeelding 6 willekeurige velden voor 10 seconden met een 10x fase-contrast tussen objectieve minuten 4 en 5. </li><li> Schakel over naar een 40x objectief en neem een ​​gezichtsveld tussen de 5 en 10 minuten. Op 10 minuten, het verzamelen vantussen 5 en 10 willekeurig gezichtsveld. </li><li> Stop de stroom en ga naar de volgende kamer. </li></ol> 5. TL-beeldvorming onder Flow omstandigheden met behulp van een Ibidi Kamer <ol><li> Label een endotheelcellen of neutrofielen een fluorescerende van belang. Bijvoorbeeld kan een anti-VE-cadherine antilichaam geconjugeerd aan Alexa-[547] worden gebruikt endotheelcellen knooppunten visualiseren. </li><li> Monteer ibidi kamer op een microscoop met differentieel interferentie contrast (DIC) en fluorescerende mogelijkheden. We gebruiken een FluoView 1000 confocale (Olympus) met een klimaatkamer. Focus volgens een objectieve ontworpen DIC en fluorescerende werk. </li><li> Acquire gelijktijdige DIC en tl-beelden met behulp van software van leverancier, terwijl na het tijdsverloop beschreven in hoofdstuk 4. </li></ol> 6. Analyse van de neutrofielen Recruitment <ol><li> Analyse van de rol-en interactie-cellen wordt beschreven door Wiese et al. 11. </li&gt; <li> Het percentage neutrofielen rollen op endotheel monolaag tellen van het aantal neutrofielen meer dan een celdiameter zijn verplaatst in een periode van 5 seconden gemeten. Deel dit getal door het totaal aantal witte bloedcellen in het veld om het percentage van het rollend cellen te bepalen. Bij uitbreiding, worden de resterende cellen beschouwd stevig aanhanger. </li><li> Meet het rollen snelheid van neutrofielen door het berekenen van de afstand die de neutrofielen aflegt in een bepaalde periode en dan delen door dat de tijd in seconden. </li><li> Transmigratie wordt bepaald door het aantal van neutrofielen die veranderd vorm en migreren onder de monolaag 10. Deze neutrofielen worden geïdentificeerd door het feit dat zij veranderen van fase helder wanneer op de monolaag op dat fase donker wanneer onder de monolaag 10. Het aantal transmigrated cellen uitgedrukt als percentage van de totale cellen in het beeldveld of als grondstof verdoofder van transmigrated cellen per oppervlakte-eenheid. In dit model systeem typisch 50% van neutrofielen transmigreren na 10 minuten. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Ongestimuleerde endotheelcellen bieden geen ondersteuning voor neutrofielen rekrutering. In tegenstelling, het stimuleren van endotheelcellen met TNF-α resulteert in neutrofielen rollende, stevige adhesie en transmigratie. Een voorbeeld van deze gegevens in de figuren 1 en 2. Figuur 1A toont neutrofielen interactie met TNF-α-gestimuleerde endotheelcellen. Deze interacties worden gekwantificeerd, waaruit het aantal neutrofielen interactie met de endotheelcellen en het aantal rollen neutrofielen, stevig aanhanger of transmigrated (figuur 2). Neutrofiel transmigratie kan op cel kruispunten of via de endotheelcellen zelf. Om onderscheid tussen deze twee voorwaarden worden endotheelcellen voorzien van een anti-VE-c<html> adherin antilichaam en transmigratie wordt gescoord als zich paracellularly of transcellularly (Figuur 1B en C). In dit model vrijwel alle transmigratie is paracellulaire 7. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig1.jpg" /> Figuur 1. Gelijktijdig DIC en fluorescentie beeldvorming onder stromingscondities met behulp van een ibidi kamer. (A) DIC beeld vers geïsoleerde menselijke neutrofielen migreren over humane navelstreng endotheelcellen. De gele pijl toont een aanhanger neutrofielen, de witte pijlpunt toont een verhuizende neutrofielen. (B) endotheelceldichtheid verbindingen werden gekleurd met een anti-VE-cadherine antilichaam geconjugeerd aan Alexa-[547] en afgebeeld. (C) Toont overlay van kanaal A en B waaruit blijkt dat vrijwel alle verhuizende in dit model paracellulaire is. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4032/4032fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . _content &quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4032/4032fig2.jpg" /> Figuur 2. Endotheelcellen werden ongestimuleerd gelaten of gestimuleerd werden met 10 ng / ml TNF-α. Na 4 uur werd een parallel flow chamber plaat gemonteerd en neutrofielen werden geperfuseerd over op een dyn / cm 2. (A) Neutrophil interacties werden onderzocht en gemeten met behulp van ImageJ software van NIH. De totale interactie cellen werden gekarakteriseerd als (B) rollen, goed hechtende of (C) verhuizende. Gegevens stellen het gemiddelde + SEM van 3 tot 5 experimenten. Het verschil tussen de controle en TNF in panelen A en C was significant (p &lt;0,001).

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li>
<li>Diacovo, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+rolling%2C+arrest%2C+and+transmigration+across+activated%2C+surface-adherent+platelets+via+sequential+action+of+P-selectin+and+the+beta+2-integrin+CD11b%2FCD18%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18.</a> Blood. 88, 146-157 (1996).</li>
<li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Petri, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+LSP1+is+involved+in+endothelial+dome+formation%2C+minimizing+vascular+permeability+changes+during+neutrophil+transmigration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo.</a> Blood. 117, 942-952 (2011).</li>
<li>Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+junctional+adhesion+molecule-C+promotes+neutrophil+transendothelial+migration+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+Protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation Protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745(2008).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+leukocyte+transmigration%3A+cell+surface+interactions+and+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events.</a> J. Immunol. 172, 7-13 (2004).</li>
<li>Alcaide, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+under+shear+flow%3A+it%27s+all+about+endothelial+cell+rings+and+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps.</a> Microcirculation. 16, 43-57 (2009).</li>
<li>Jutila, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+neutrophil+adhesion+under+conditions+mimicking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neutrophil+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow.</a> Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).</li>
<li>Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+rolling+and+adhesion+in+vitro+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions.</a> Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).</li>
<li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Physiologic+E-Selectin-Mediated+Leukocyte+Rolling+on+Microvascular+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium.</a> J. Vis. Exp. (24), e1009(2009).</li>
<li>Petzelbauer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li>
<li>Bonder, C. S., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+leukocyte+recruitment+to+splanchnic+organs+to+reduce+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Phys+-+Gastrointestinal+and+Liver+Phys%22%5BJournal%5D)">Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation.</a> Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).</li>
<li>Cuvelier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+adhesion+under+flow+conditions+activates+mechanosensitive+signaling+pathways+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells.</a> J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).</li>
<li>Massia, S. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cell+interactions+with+surface-coupled+adhesion+peptides+on+a+nonadhesive+glass+substrate+and+two+polymeric+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mat.+Res%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials.</a> J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

<html> Onderzoekers hebben routinematig gebruikt endotheelcellen van verschillende vasculaire bedden tot neutrofielen werving en transmigratie te bestuderen. Voorbeelden omvatten, maar zijn niet beperkt tot, dermale microvasculaire endotheliale cellen 12, lever sinusoïdale endotheelcellen 13 en endotheelcellen van humane umbilicale ader 10. Onder hen HUVEC opgedaan grote populariteit vanwege hun relatieve gemak van isolatie en beschikbaarheid. HUVEC zijn een krachtig in vitro mod...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens en Apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Collagenase type 1 </td><td> Worthington </td><td> 4197 </td><td></td></tr><tr><td> Cord buffer </td><td></td><td></td><td> Samenstelling: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1 mM NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 buffer bij pH 7,4 </td></tr><tr><td> Endotheelcellen Media (ECM) </td><td></td><td></td><td> M199 aangevuld met Eagle zouten met 16% humaan serum met 100 eenheden penicilline 100 mg streptomycine en 0,3 mg L-glutamine/ml </td></tr><tr><td> M199 </td><td> GIBCO </td><td> 31100-035 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline Streptomycine glutamaat (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Ibidi kamers </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td><td></td></tr><tr><td> TNF-α </td><td> PrePro Tech </td><td> 300 01A </td><td></td></tr><tr><td> Menselijke albumine 20% oplossing </td><td> Gemini Bioproducts </td><td> 800120050 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS zonder Ca2 + en Mg2 + </td><td> Sigma </td><td> H2487-10X </td><td></td></tr><tr><td> HBSS met Ca2 + en Mg2 + </td><td> Sigma </td><td> H1387-10X </td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrofielen zijn de meest voorkomende type witte bloedcel. Ze vormen een belangrijk deel van het aangeboren immuunsysteem 1. Tijdens de acute ontsteking van de neutrofielen, zijn de eerste inflammatoire cellen om te migreren naar de plaats van verwonding. Aanwerving van neutrofielen een blessure site is een stapsgewijs proces dat eerste, verwijding van de bloedvaten om de bloedstroom te verhogen omvat, ten tweede, microvasculaire structurele veranderingen en te ontsnappen van de plasma-eiwitten uit de bloedbaan, ten derde, walsen, adhesie en transmigratie van de neutrofielen over de endotheel en vierde accumulatie van neutrofielen op de plaats van schade 2,3. Een breed scala van in vivo en in vitro-methoden heeft ontwikkeld tot de studie van deze processen 4 mogelijk te maken. Deze methode richt zich op neutrofielen transmigratie in humane endotheelcellen. Een populaire methode voor de behandeling van de moleculaire processen die betrokken zijn bij neutrofielen transmigratie maakt gebruik van de menselijke neutrophils interactie met primaire humane umbilicale ader endotheel cellen (HUVEC) 5. Neutrofielen isolatie is visueel elders 6 beschreven; dus dit artikel zal de methode aan te tonen voor isolatie van HUVEC. Eenmaal geïsoleerd en gekweekt tot confluentie worden endotheelcellen geactiveerd waardoor de regulatie van adhesie en activering moleculen. Bijvoorbeeld activering van endotheelcellen met cytokines, zoals TNF-α resulteert in hogere E-selectine en IL-8 expressie 7. E-selectine bemiddelt vangen en rolling van neutrofielen en IL-8 bemiddelt activering en stevige hechting van neutrofielen. Na hechting neutrofielen transmigreren. Transmigratie kan paracellularly voorkomen (door middel van endotheelcellen knooppunten) of transcellularly (via de endotheelcellen zelf). In de meeste gevallen zijn deze interacties plaatsvinden onder stroom staat in het vaatstelsel 7,8. De parallelle plaat flow kamer is een veel gebruikt systeem dat mimics de hydrodynamische schuifspanningen gevonden in vivo en in staat stelt de studie van de neutrofielen rekrutering onder stroom staat in vitro 9,10. Verschillende bedrijven produceren parallelle plaat flow kamers en hebben elk voor-en nadelen. Als fluorescerende beeldvorming nodig is glas of een soortgelijk optisch polymeer moet worden gebruikt. Endotheelcellen niet goed groeien op glas. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle methode voor fase-contrast, DIC en fluorescerende beeldvorming van neutrofielen transmigratie het gebruik van een laag volume ibidi kanaal glijbaan van een polymeer die ondersteuning biedt voor de snelle hechting en de groei van menselijke endotheelcellen en heeft optische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met glas. In deze methode werden endotheelcellen gekweekt en gestimuleerd een ibidi μslide. Neutrofielen werden geïntroduceerd onder stromingscondities en transmigratie werd beoordeeld. Fluorescerende beeldvorming van de knooppunten in staat real-time bepaling van de omvang van paracellulaire versustranscellulair transmigratie.

In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Neutrofielen zijn het meest voorkomende type witte bloedcel. Ze vormen een essentieel onderdeel van het aangeborene immuunsysteem1. Tijdens een acute ontsteking, ...

Het algemene doel van deze procedure is om hoogwaardige menselijke endotheelcellen te isoleren en deze te gebruiken om de mechanismen die de transmigratie van neutrofielen onder underflow-condities reguleren te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst menselijke endotheelcellen uit de navelstrengvene te isoleren en uit te platen. De tweede stap is het splitsen van de cellen naar IBD-kamers.Vervolgens worden vers geïsoleerde menselijke neutrofielen over geactiveerde endotheelcellen verspreid, wat resulteert in rollen, stevige adhesie en transmigratie van de neutrofielen. De laatste stap is het kwantificeren van de transmigratie met behulp van videomicroscopie. Uiteindelijk kan fluorescentie- en lichtveldmicroscopie worden gebruikt om de transmigratie van neutrofielen over geactiveerde endotheelcellen te evalueren.De isolatie van endotheelcellen is eenvoudig te beschrijven, maar moeilijk aan te leren, mede omdat cruciale stappen de visualisatie van de navelstreng vereisen. Om deze reden is een visuele demonstratie van deze methode essentieel. Deze methode zal ons helpen om kernvragen binnen het vakgebied van ontstekingen te beantwoorden, zoals de wijze waarop leukocytenrekrutering pl

isolation-human-umbilical-vein-endothelial-cells-their-use-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video protocol illustreert de isolatie en de cultuur van humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) van menselijke navelstreng. Eenmaal geïsoleerd deze cellen kunnen worden gebruikt voor in-vitro angiogenese assays, zoals de Optimized fibrinegel Bead Assay ook aangetoond door de Hughes lab.

Isolatie van de Mens navelstreng endotheel cellen (HUVEC)

The video demonstrates a method for investigating the impact of stromal cells on leukocyte recruitment. In a parallel plate flow chamber model, pro-inflammatory cytokines induce the expression of adhesion receptors by endothelial cells, facilitating neutrophil recruitment and migration. The cross-talk between stromal cells and endothelial cells diminishes neutrophil recruitment to the endothelial cells.

An In Vitro Flow Investigation of the Effect of Stromal Cells on Leukocyte Recruitment

Werkwijze voor het kwantificeren neutrofieladhesie gerapporteerd. Deze methode een dynamisch omgeving vergelijkbaar met die aangetroffen in een bloedvat. Het maakt het onderzoek neutrofieladhesie ofwel gezuiverd adhesiemoleculen (ligand) of endotheelcel substraat (HUVEC) in een context vergelijkbaar met de in vivo omgeving met afschuifspanning.

Human Neutrophil Flow Kamer adhesietest

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Protocollen voor de kweek van humane navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC), tijdelijke transfectie van fluorescerend gelabelde markers van microtubulusgroei, beeldvorming van levende cellen en geautomatiseerde analyse van interfase-microtubulusgroeidynamiek worden gedetailleerd beschreven.

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Hier presenteren we een geïntegreerde protocol die maatregelen monocyt subpopulatie mensenhandel onder stroom in vitro door gebruik van specifieke oppervlakte markers en confocal fluorescentie microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt om te verkennen sequentiële werving stappen ook over andere subtypen van de leukocyten met behulp van andere specifieke oppervlakte markers profile.

Gelijktijdige studie van de aanwerving van monocyt subpopulaties onder stroom In Vitro

Hoewel uitdagend, is de isolatie van pulmonale endotheelcellen essentieel voor studies naar longontsteking. Dit protocol beschrijft een procedure voor de hoogproductieve, zeer zuivere isolatie van macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen.

Microvasculaire en macrovasculaire endotheliale celisolatie en zuivering van longmonsters

De huidige studie beschrijft een protocol om de veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's) tijdens virale infectie te volgen met behulp van een real-time celanalysesysteem (RTCA).

Monitoring van veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader bij virale infectie met behulp van op impedantie gebaseerde real-time celanalyse

Leer de isolatie van humane navelstreng endotheelcellen en hun toepassing bij het bestuderen van neutrofielen-transmigratie onder stroomtoestanden. Deze methode maakt live-cell fluorescentiebeeldvorming mogelijk.

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden (Video) | JoVE Journal

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Meer video's verkennen