Name: Een Menselijke eileider Model voor Onderzoek van C. trachomatis Infecties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Leer een ex vivo infectiemodel met menselijke eileiders om C. trachomatis-pathologie te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers om chlamydia-geïnduceerde celschade en chronische ontstekingsprocessen te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de DFG-Cluster of Excellence &quot;ontsteking op Interfaces&quot; (RA-Als, RA-D). We zijn dankbaar voor de uitstekende technische bijstand van Kristin Wischnat.

1. Voorbereiding van Chlamydia trachomatis serovar D Stock <ol><li> Infect confluerende 175 cm 2 celkweek kolf met HeLa-229 cellen met 4 ml C. trachomatis D in SPG buffer. </li><li> Incubeer gedurende een uur bij 37 ° C gedurende constant schudden. </li><li> 20 ml DMEM met 10% FCS en 240 ul Cycloheximide. </li><li> Incubeer in een bevochtigde incubator gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Voeg 5 ml steriele glazen kralen, sterke schudden verwijderen en te vernietigen C. trachomatis herbergen HeLa-229 cellen. </li><li> Verzamel supernatant en voeg nog een 5 ml steriele glazen kralen. </li><li> Rock drie keer gedurende 1 minuut aan alle HeLa-229-cellen te vernietigen en het vrijkomen C. trachomatis. </li><li> Centrifuge voor 5 min op 1000 RPMI en 4 ° C te ontdoen van celresten. </li><li> Gebruik de bovenstaande vloeistof voor infectie van 8 tot 10 175 cm 2 celkweek flessen samenvloeiende grown met HeLa 229 cellen. </li><li> Incubeer elke kolf met 4 ml SPG buffer en 4 ml supernatant van eerdere infectie gedurende een uur bij 37 ° C met constant schudden. </li><li> Na een uur toegevoegd 15 ml DMEM met 10% FCS en 230 ul cycloheximide gevolgd door 48 uur incubatie bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Voeg 5 ml steriele glazen kralen, schud los te koppelen en te vernietigen C. trachomatis herbergen HeLa-229 cellen. </li><li> Gebruik de bovenstaande vloeistof en voeg nog een 5 ml steriele glazen kralen. </li><li> Rock drie keer gedurende 1 minuut aan alle HeLa-229-cellen te vernietigen en het vrijkomen C. trachomatis. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 min op 1000 RPMI bij 4 ° C om zich te ontdoen van cellulaire puin. </li><li> Gebruik de bovenstaande vloeistof. </li><li> Vul 40 ml van de bovenstaande in 50 ml Falcon buizen, centrifuge voor 99 min met 11.000 RPMI. </li><li> Na het centrifugeren Verwijder de bovenstaande vloeistof af en was het pellet met 1 ml SPG buffer. </li><li> Homogeniseer depellet in 1 ml aliquot manometer en 20 pi in een 1, 5 ml Eppendorf buis bewaren bij -70 ° C tot gebruik. Biologische activiteit van de bereide voorraad werd bevestigd in een gevestigde HeLa-229 cel infectie model. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Mens eileider <ol><li> Store menselijke eileiders (HFT) van vrouwen die een hysterectomie direct na de operatie in RPMI met 5% FCS zonder antibiotica in 4 ° C tot voorbereiding. Het protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Lübeck (09-153). Vrouwen in de studie opgenomen (leeftijd 34 tot 53) had geen voorgeschiedenis van C. trachomatis infectie. Weefsel van de eileiders is verzameld op peripartum sterilisatie op verzoek van de moeder tijdens de keizersnede of tijdens baarmoederverwijdering als gevolg van symptomatische vleesbomen in de luteale fase. Alle HFT zijn negatief getest op C. trachomatis door PCR. </li><li> Ontleden de HFT in een petrischaal met RPMI met5% FCS zonder antibiotica. Gedurende de gehele bewerking het weefsel worden ondergedompeld in media om uitdroging. </li><li> Knip en gooi het bindweefsel en weefsel vernietigd tijdens de operatie. </li><li> Na dissectie voorzichtig open de HFT met een klein scalpel. </li><li> Voor verdere experimenten bereiden stukken weefsel in de grootte van 0,5 cm x 0,5 cm tot 1 cm x 1 cm. </li><li> Voor infectie winkel HFT model in 1 ml RPMI met 5% FCS zonder antibiotica. HFT monsters werden geïnfecteerd met 5.5x10 5 IFU (inclusie eenheden) van C. trachomatis. </li><li> Incubeer HFT monster in 37 ° C, 5% CO2 en 21% O2 en in 37 ° C, 5% CO2 en 2% O 2 gedurende 24 uur. </li><li> Na de incubatie tijd te verzamelen monster en bewaar ze in fixatief Monti&#39;s gedurende ten minste drie dagen bij 4 ° C tot SEM / TEM bereiding. </li></ol> 3. Voorbereiding van de HFT Model voor TEM <ol><li> VoorTEM verwijderen exemplaar uit fixatief Monti&#39;s en snijd 2 x 2 mm tot 4 x 5 mm stukken. De resterende weefsel kan worden gebruikt voor SEM. </li><li> Was stukken met natrium cacodylate buffer, pH 7,35 gedurende 1 uur. </li><li> Incubeer in 1% (w / v) osmiumtetroxide in aqua dest. nachts. </li><li> Verwijder het teveel aan osmiumtetroxide door het wassen van 6x5 min in natrium cacodylate buffer, pH 7,35. </li><li> Verwijder het water door incubatie in toenemende concentraties ethanol in water (v / v) (30% gedurende 2 uur, 40% 2 uur, 50% 2 uur, 60% 2 uur, 70% &#39;s nachts, 80% 2 h, 90% gedurende 1 uur, 95% gedurende 1 uur 100% gedurende 1 uur. </li><li> Spoel ethanol gedurende 2 x 15 min in propyleenoxide en vervolgens naar een mengsel van 50% (v / v) vers bereide Araldite (inclusief alle componenten) propyleen en incubeer overnacht. </li><li> Toevoeging aan vers bereide Araldite (inclusief alle componenten) ten minste een uur. </li><li> Transfer naar platte inbedding mallen en vul deze met Araldite. </li><li> Laat Araldite uithardenten minste 48 uur bij 60 ° C </li><li> Na het trimmen van embedded monster gesneden semi dunne secties (700 nm) op een ultramicrotoom gebruik van glas messen of een histo diamant mes en vlek met Richardson vlek. </li><li> Snij ultra-dunne secties (ca. 70 nm) met behulp van een diamant mes en transfer naar koper roosters (bijv. 150 vierkante mesh). </li><li> Stain ultra-dunne secties met 0,5% (w / v) uranylacetaat in aqua dest. gevolgd door 3% (w / v) loodcitraat in gedestilleerd. in een automatische sectie Stainer. Als alternatief kan delen met de hand worden gekleurd door het verlaten van roosters 15 min. op een verzadigde oplossing van gecentrifugeerd uranylacetaat in aqua dest. gevolgd door 0,3% lood citraat (w / v) in gedestilleerd water. </li></ol> 4. Voorbereiding van de HFT monster voor SEM <ol><li> Voor SEM verwijderen exemplaar uit fixatief Monti, oriënteren met epitheel naar boven op een 1,5 x 1 cm kurk vel en zet positie met behulp van insecten naalden. </li><li> Transfer exemplaar op kurk om geschikte metalen manden enwassen gedurende 30 minuten natrium cacodylate buffer, pH 7.35. </li><li> Verwijder het water door incubatie monster in toenemende concentratie van aceton / water mengsels (v / v) 30% gedurende 6 uur, 40% voor 6 uur, 60% gedurende 8 uur, 70% &#39;s nachts, 80% 2 uur, 90% 2 uur en 100% &#39;s nachts (uiterst voorzichtig te blijven monster continu onder water). </li><li> Transfer naar vers 100% aceton en droog monster met behulp van kritisch punt drogen (temperatuur 40 ° C, druk 80 bar). </li><li> Verwijder de naalden, kurk en lijm exemplaar met het epitheel naar boven op SEM exemplaar mount voorzien van een geleidende koolstof tabblad met behulp van geleidende koolstof cement. Gebruik vloeibare geleidende zilver om de geleidbaarheid tussen de bevestiging en de geleidende koolstof tabblad te verbeteren. </li><li> Bereid een geleidende platina, goud of palladium coating van het monster met een sputter coater. </li></ol> 5. Kleuren van Semi dunne secties met Richardson&#39;s Stain <ol><li> Laat semi dunne delen droog op dia. </li><li> Vlek secties kleuren oplossing bij 60 ° C gedurende 1-2 minuten. </li><li> Was in aqua dest. </li><li> Droge secties en dekglaasje aan. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Binnen de menselijke eileider infectie model dat we in staat waren om verschillen in de epitheliale morfologie tussen de niet-geïnfecteerde controles (figuur 1) en de C. visualiseren trachomatis - geïnfecteerde buizen (figuur 2) onder normoxische staat. Karakteristiek morfologische verschillen impliciet pathogenen geïnduceerde zwelling en lysis van eileider epitheelcellen die niet konden worden gedetecteerd in niet-geïnfecteerde controle. Met behulp van semi-dunne secties en transmissie-elektronenmicroscopie konden we intracellulaire C. te bewijzen trachomatis opname vorming in de ex vivo geïnfecteerd mens eileider weefsel (figuur 3, 5) maar niet in niet-geïnfecteerde controle (figuur 4). Zoals zuurstof concentragen in de vrouwelijke geslachtsorganen zijn al laag onder fysiologische omstandigheden 11 en verdere daling tijdens een inflammatoir proces hebben we ook ons model onderzocht onder hypoxische condities. Voorlopige resultaten geven aan het model is nuttig om chlamydia-groei en de nakomelingen te analyseren onder verschillende zuurstof concentraties. Chlamydia-geïnduceerde epitheliale cellen schade moet worden gescheiden van artefacten die worden bemiddeld door onvoorzichtige voorbereiding en behandeling van de eileiders vóór infectie (figuur 6). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Scanning electronen microscopie (SEM) van een niet-geïnfecteerde menselijke eileiders na een dag incubatie in controle medium (groene pijl aan trilharen cel, blauwe pijl aan niet-trilharen cel). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Scanning elektronen micro&#39;s<html> kopie (SEM) van een ex vivo C. trachomatis infectie menselijke eileider een dag na infectie (witte pijl gescheurde integratie). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Semi dunne secties tonen typische intracellulaire insluitsels (witte pijlen) 1d na infectie van de menselijke eileider met C. trachomatis ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) van een niet-geïnfecteerde humane eileider na een dag incubatie onder controle medium. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) van een ex vivo C. trachomatis infectie menselijke eileider een dag na infectie (witte pijlen geven chlamydia-insluitingen). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Scanning electronen microscopie (SEM) van eileider epitheel beschadigd door onvoorzichtige voorbereiding en behandeling van het monster (witte pijlen merk vernietigd epitheelweefsel).

<ol><li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li>
<li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li>
<li>Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeipert%2C+JF+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 349, 2424-2430 (2003).</li>
<li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubal+factor+infertility%2C+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li>
<li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55(2006).</li>
<li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li>
<li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li>
<li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li>
<li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li>
<li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Visualisatie van pathogenen geïnduceerde schade aan het geïnfecteerde weefsel is zwaar en vaak beperkt tot experimentele procedures bij muizen. We stelden een ex vivo model infectie bij de mens eileiders naar C. te analyseren trachomatis infecties van de bovenste vrouwelijke geslachtsorganen. Door toepassing van deze methode, konden we C. visualiseren trachomatis - geïnduceerde schade aan de eileider epitheel binnen een dag na infectie. Cellulaire zwelling en lysis waren typische morfologische veranderingen die werden waargenomen in C. trachomatis - geïnfecteerde eileiders, maar niet in niet-geïnfecteerde controles. TEM analyses bleek dat Chlamydiae een typische intracellulaire ontwikkelingscyclus te voeren binnen de geïnfecteerde weefsels, met grote insluitsels met re-gesplitste elementaire lichamen, maar ook kleinere insluitsels met vergrote reticulate lichamen die kunnen wijzen op doorzettingsvermogen. Echter, de morfologische beeld alleen niet voldoende zijn om onderscheid te maken tussen replicating en hardnekkige infecties, die worden gekenmerkt door een verminderd metabolisme en een verhoogde weerstand tegen antimicrobiële middelen 10. Vernietiging van het epitheel in geïnfecteerde eileiders is hetzij als gevolg van verstoring van de C. trachomatis - geïnfecteerde epitheelcellen na voltooiing van de intracellulaire ontwikkelingscyclus en het vrijkomen van infectieuze elementaire organen of het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokines 8. Pathogenen geïnduceerde beschadiging van het weefsel en host-geïnduceerde immuunreacties tegen C. trachomatis worden verondersteld de belangrijkste factoren die leiden tot verlies van epitheliale cel functie, fibroblast remodeling en ten slotte de eileiders onvruchtbaarheid in vivo 8,11. Een van de belangrijkste beperkingen van dit model is de afwezigheid van inflammatoire cellen die de analyse van nevenwerkingen belemmert de eerste C. trachomatis infectie van de eileider epitheel. Echter, het model is apEen geschikte aan verschillende milieu-omstandigheden (bijv. zuurstofgehalte) en de eerste host-immuunrespons bij acute C. te onderzoeken trachomatis infecties 8,9. Verdere plannen zijn om een model voor het testen van antimicrobiële middelen tegen C. te stellen trachomatis in gehele menselijke eileiders en de metabole toestanden van de verschillende ontwikkelingsstadia waargenomen in de eileider epitheel door 2-foton laser scanning microscopie karakteriseren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG buffer </td><td> verschillende </td><td></td><td> hieronder zie recept </td></tr><tr><td> Monti&#39;s fixatief </td><td> verschillende </td><td></td><td> hieronder zie recept </td></tr><tr><td> natrium cacodylate buffer </td><td> verschillende </td><td></td><td> hieronder zie recept </td></tr><tr><td> Richardson de vlek </td><td> verschillende </td><td></td><td> hieronder zie recept </td></tr></tbody></table> Recepten: 1. SPG buffer <ol><li> Voeg 75 g sucrose. </li><li> Voeg 2,47 g dinatrium fosfaat. </li><li> Voeg 0,36 g mononatriumfosfaat. </li><li> Voeg 0,72 g glutaminezuur. </li><li> Vul aan tot 1 liter met gedestilleerd water. </li><li> Pas de pH op 7,3. </li></ol> 2. 0,1 M natrium cacodylate buffer, pH 7.35. <ol><li> Voeg 42,80 g dimethylarsenic-natriumzout. </li><li> Voeg 68,46 g sucrose. </li><li> Vul aan tot 1 liter met gedestilleerd water. tot 0,2 M natrium cacodylate buffer te krijgen. </li><li> Voor gebruik verdunde oplossing met gedestilleerd water. gewenste concentratie en de pH 7,35 indien nodig. </li></ol> 3. Monti&#39;s fixatief <ol><li> Voeg 156 ml 0,12 M natrium cacodylate buffer. 3,2 Voeg 25 ml 25% glutaardialdehyde in aqua dest. </li><li> Voeg 19 ml10% paraformaldehyde in aqua dest. </li><li> Voeg 3 ml 3% CaCl 2 in aqua dest. </li><li> Breng de pH op 7,35 en vul deze met gedestilleerd water. tot 312 ml uiteindelijke oplossing. </li></ol> 4. Richardson vlek <ol><li> Meng gelijke delen 1% methyleenblauw in 1% waterige oplossing en borax 1% Azur II in gedestilleerd. </li></ol>

een menselijke eileider model voor onderzoek van<em&gt; c. trachomatis</em&gt; infecties

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Genitale infecties met Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) zijn de meest voorkomende seksueel overdraagbare ziekte bij vrouwen wereldwijd. Inefficiënte klaring of voortduren van de ziekteverwekkers kan leiden tot oplopende infecties van de bovenste genitaal apparaat en worden verondersteld chronische inflammatoire schade aan geïnfecteerde weefsels 1,2 veroorzaken. Als gevolg hiervan kunnen ernstige klinische gevolgen zoals pelvic inflammatory disease (PID), eileiders occlusie en onvruchtbaarheid ontstaan ​​3,4. De meeste onderzoek met C. trachomatis is uitgevoerd in epitheelcellen lijnen (bijvoorbeeld HEp-2 cellen en HeLa-229) of muizen. Echter, zoals met cel-cultuur gebaseerde modellen, hebben ze geen afspiegeling van de fysiologie van de natuurlijke weefsel, noch de pathofysiologie van C. trachomatis genitale infecties in vivo 5. Verder beperkingen door het feit dat centraal signaaltransductiecascades (bijvoorbeeld IFN-γ mediated JAK / STAT signaalweg) die intracellulaire chlamydia-groei te beheersen fundamenteel verschillen tussen muizen en mensen 6,7. Wij en anderen dan ook is een hele orgel eileider model om de directe interacties tussen C. te onderzoeken trachomatis en menselijke eileider cellen ex vivo 8,9. Hiertoe werden humane eileiders van vrouwen die hysterectomie verzameld en geïnfecteerd met C. trachomatis serovar D. Binnen 24 uur na infectie, specimen, geanalyseerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) naar Chlamydia trachomatis opsporen bemiddeld beschadiging van het epitheel en C. trachomatis opnemen vorming in de eileider weefsel.

We beschrijven een<em&gt; Ex vivo infecties</em&gt; Model voor visualisatie van directe interacties van bacteriële pathogenen met menselijke eileider cellen. De hele orgaanweefsel model werd opgericht om te onderzoeken<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Geïnduceerde pathologie aan de vrouwelijke eileider onder &quot;levensechte&quot; voorwaarden.

Een Menselijke eileider Model voor Onderzoek van<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infecties

Genitale tractusinfecties met Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) zijn de meest voorkomende seksueel overdraagbare aandoeningen bij vrouwen wereldwijd. Inefficiënte ...

Chlamydia trachomatis is een gramnegatieve, obligaat intracellulaire bacterie. Er zijn verschillende chlamydiale serovars bekend die infecties van het oog of het genitale stelsel veroorzaken. Infecties van het genitale stelsel door Chlamydia trachomatis zijn wereldwijd de meest voorkomende seksueel overdraagbare aandoeningen.Er is een prevalentie van bijna 3 miljoen gerapporteerde infecties in de Europese Unie tussen 1990 en 2009 vastgesteld. In 2009 werden bijna 400.000 gevallen gerapporteerd. Ondanks de voortdurende verbeteringen in de volksgezondheid en seksuele voorlichting, is er een stijgend aantal nieuwe genitale chlamydiainfecties waargenomen, van 70.000 gevallen in 1990 naar 400.000 gevallen in 2009.75% van alle nieuwe infecties wordt gerapporteerd bij jongeren in de leeftijd van 15 tot 24 jaar. Klinische sequelae treden vermoedelijk op door een inefficiënte klaring van de pathogenen, wat kan leiden tot opstijgende infecties van het lagere naar het bovenste genitale tractus, en vervolgens chronische inflammatoire schade aan het geïnfecteerde weefsel kan veroorzaken. 10 tot 30% van de vrouwen die geïnfecteerd zijn met chlamydia tracheitis ontwikkelen een bekkenontsteking (PID), en tot 50% van de PID-gevallen wordt toegeschreven aan chlamydia tracheitis-infecties.Bijgevolg wordt bij 50% van de patiënten met tubaire infertiliteit en bij 40% van de patiënten met een buitenbaarmoederlijke zwangerschap chlamydia aangetroffen als het veroorzakende pathogeen. Bij een gezonde, niet-geïnfecteerde vrouw migreert de bevruchte eicel via de eileider naar de baarmoeder, waar deze zich ontwikkelt tot de bevalling. Bij geïnfecteerde patiënten kan chlamydia vanuit het lagere genitale stelsel opstijgen naar de eileider, waardoor chronische ontstekingsprocessen worden getriggerd.Pathogeen-geïnduceerde schade aan epitheelcellen en het verlies van centrale epitheliale celfuncties worden verondersteld uiteindelijk tubaire occlusie te veroorzaken, wat resulteert in een verminderd of volledig afgesloten eitransport van de eierstokken naar de baarmoeder. Voor dit doel worden menselijke eileiders verzameld en bewaard van vrouwen die een hysterectomie ondergaan. De buizen worden gedissecteerd en voorzichtig geopend.Volgens de experimentele opzet worden deze in kleine monsters gesneden en gedurende 24 tot 48 uur geïnfecteerd met infectieuze elementary bodies van chlamydia tracheitis op de respectievelijke tijdstippen. De monsters worden gefixeerd met het fixatiemiddel van Monty gedurende ten minste drie dagen tot aan verdere preparatie. Bewaar menselijke eileiders (HFT) van vrouwen die een hysterectomie ondergaan onmiddellijk na de operatie.In RPMI met 5% FCS zonder antibiotica bij vier graden Celsius tot aan de voorbereiding. Disseceer de menselijke eileider in een Petrischaal met RPMI met 5% FCS zonder antibiotica gedurende het gehele proces. De buis moet ondergedompeld blijven in het medium om uitdroging te voorkomen; snijd het bindweefsel en het tijdens de operatie beschadigde weefsel weg en gooi dit weg.Open na dissectie de HFT voorzichtig met een klein scalpel. Vermijd weefselschade door onvoorzichtig gebruik van de pincet en het scalpel. Bereid kleine stukjes weefsel voor met een afmeting van vijf bij vijf millimeter voor infectie; bewaar het HFT-monster in 1 mL RPMI met 5% FCS zonder antibiotica en voeg C track toe.HFT-monsters van OMAS elementaire lichamen worden tot 48 uur geïncubeerd bij 37 °C, 5% CO2 en 20% O2 in een normale incubator of in een zuurstofarme omgeving, minder dan 5% O2 in een hypoxiekamer. Na de respectievelijke incubatietijdstippen worden de monsters verzameld en gedurende ten minste drie dagen bij vier °C bewaard in Monty's Fixative tot aan de SEM- of TEM-preparatie voor transmissie-elektronenmicroscopie. Het gefixeerde weefsel wordt in kleine stukjes gesneden, gewassen en overnacht geïncubeerd met 1% osse en tetroxide.Na verschillende was- en droogstappen worden de gedehydrateerde preparaten overgebracht naar vers bereide aite en 48 uur lang gepolymeriseerd bij 60 °C. Na het trimmen worden halfdunne en ultradunne coupes gesneden en respectievelijk op objectglazen of grids overgebracht. Na kleuring kunnen de halfdunne coupes met een lichtmicroscoop worden onderzocht ter voorbereiding op transmissie-elektronenmicroscopie.Verwijder het preparaat uit het fixeermiddel van Monty en snijd dit in stukjes van maximaal twee bij twee bij vijf millimeter. Na het wassen, incubatie in sodium CCO dilate-buffer, wassen met osmiumtetroxide, dehydratatie met oplopende concentraties ethanol, wordt het preparaat overgebracht naar een mengsel van 50% propyleenoxide en aite voor een nacht. Breng het preparaat de volgende dag voor ten minste één uur over naar vers bereide aite.Breng het geheel vervolgens over in platte mallen, vul deze met resin en laat de resin 48 uur polymeriseren bij 60 °C. Snijd na het trimmen van het ingebedde monster semi-dunne coupes van ongeveer 700 nm of ultradunne coupes van 70 nm met een ultramicrotoom uitgerust met een glazen mes of bij voorkeur een diamantmes. Analyseer het specimen met behulp van licht- en transmissie-elektronenmicroscopie voor de semi-dunne en ultradunne coupes, en met scanning-elektronenmicroscopie.De preparaten worden op kurkplaten gespeld met het epitheel naar boven gericht, gewassen en gedehydrateerd met oplossende concentraties aceton. Na het drogen in een critical point dryer worden de preparaten overgebracht naar een SEM-monsterhouder en gecoat met platina, goud of palladium met behulp van een sputter coater. Vervolgens zijn ze klaar voor analyse in een scanning elektronenmicroscoop voor scanning elektronenmicroscopie.Verwijder het specimen uit het fixatief van Monty en oriënteer het weefselstuk met het epitheel naar boven op een kurkplaat, en fixeer de positie met insectenpennen. Na het wassen met sodium caco dilate buffer en een behandeling met aceton, droog het specimen in een critical point dryer. Na overdracht van het specimen van de kurk naar een SEM-specimenhouder, breng een geleidende coating van platina-goud of palladium aan op het specimen met behulp van een sputter coater; breng het gesputterde specimen vervolgens over naar een scanning elektronenmicroscoop voor verdere analyse.De ongewijzigde hoge incidentie van lumeninfecties bij vrouwen en de enorme klinische gevolgen van opstijgende al-infecties vormen de rationale voor het intensiveren van fundamenteel en translationeel onderzoek in dit gebied. We hebben gebruikgemaakt van een eerder door de groep van St.Perus en anderen vastgesteld ex-vivo weefselmodel van de menselijke eileider om chlamydia-geïnduceerde celschade in de eileider morfologisch te karakteriseren. Door het gebruik van deze methode wordt de vorming van intracellulaire inclusies in verschillende ontwikkelingsstadia waargenomen, waarbij zowel replicerende als persistente infecties zichtbaar zijn.Er is echter nog geen experimenteel bewijs voor de aanwezigheid van persistente chlamydia in menselijk weefsel van de eileiders, wat verdere analyse vereist van chlamydia, nakomelingen en de transcriptionele opregulatie van persistentiegenen. Een van de belangrijkste beperkingen van dit model is de afwezigheid van ontstekingscellen, wat de analyse van secundaire effecten als gevolg van de initiële glaucomateuze KLA-infectie belemmert. Desondanks lijkt dit model geschikt om omgevingsfactoren, zoals het zuurstofgehalte, te analyseren in de context van schade aan de epitheelcellen van de eileider, en om de initiële immuunrespons van de gastheer tegen een acute glaucomateuze infectie te bestuderen.Een van de toekomstige doelstellingen is het opzetten van een uitgebreider model voor MIC-testen van CTU's in het pH-model van menselijk weefsel van de eileider, en om dit model te gebruiken om de verschillende ontwikkelingsstadia van CLI's metabool te definiëren met behulp van de tweefoton-laser-scanning microscopietechniek.

a-human-fallopian-tube-model-for-investigation-c-trachomatis

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De eileider (FT) is in opkomst als een alternatieve site van oorsprong voor de sereuze ovariumcarcinoom (SOC). Dit protocol beschrijft een nieuwe methode voor de isolatie...

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Trichuris Muris-infectie is een intestinale model van de Th2-immuniteit, waar resistente muizen genereren van een beschermende Th2 respons en vatbaar zijn muizen het genereren van een pathologische Th1 respons.

Trichuris Muris Infectie: Een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm

Source: O'Brien, V. P., et. al., Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of scanning electron microscopy to visualize bacterial colonization and host–pathogen interactions in the bladder epithelium of a pre-infected mouse model.

Preparation of Mouse Bladder Tissue for Visualization of Bacterial Infection

This video demonstrates the establishment of uropathogenic Escherichia coli infection in a female mouse bladder through transurethral catheter instillation. The injected bacteria successfully establish a urinary tract infection within the bladder, providing a valuable platform for studying healthcare-associated diseases related to the urinary tract.

Transurethral Catheterization and Bacterial Inoculation to Generate a Urinary Tract Infection Model in Male Mice

Establishment of a Urinary Tract Infection Model in Female Mice

De gevestigde model van transuretrale catheterisatie van muizen kan de studie blaas aandoeningen, met inbegrip van infectie van de urinewegen, maar kan alleen worden uitgevoerd bij vrouwtjes. Een nieuw model van mannelijke transuretrale instillation, gepresenteerde, kan onderzoek op een gebied dat gekenmerkt door sterke klinische en epizoötiologische verschillen tussen de geslachten.

Urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen

We hebben een tubale cytologische methode onderzocht door de eileiders direct na de chirurgische excisie te testen als een instrument voor vroegtijdige detectie van eierstokkanker. Hier presenteren wij een protocol voor het verzamelen van eileiderscellen van vers ontvangen chirurgische specimens.

Tubal Cytology of the Fallopian Tube als een veelbelovend hulpmiddel voor vroegtijdige detectie van eierstokkanker

Een muismodel van uropathogene E. coli (UPEC) transurethrale inenting om latente intracellulaire blaasreservoirs en daaropvolgende blaasblootstelling aan G. vaginalis vast te stellen om terugkerende UPEC-UTI te induceren, wordt aangetoond. Ook aangetoond zijn de opsomming van bacteriën, urinecytologie en in situ blaasfixatie en -verwerking voor scanningelektronenmicroscopie.

Terugkerende Escherichia coli urineweginfectie veroorzaakt door Gardnerella vaginalis blaasblootstelling bij muizen

Dit protocol beschrijft een eendaagse methode voor de isolatie van menselijke eileiderepitheelcellen. Geïsoleerde epitheelcellen kunnen worden geplateerd in 2-dimensionale (2D) cultuur of worden gedissocieerd in eencellige suspensies en worden gebruikt in stroomafwaartse experimenten, waaronder flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing.

Een efficiënte methode voor het extraheren van epitelie van de menselijke eileider voor analyses van één cel

Dit protocol beschrijft een in vitro model van de gekatheteriseerde urinewegen, dat kan worden gebruikt om zowel plankton- als biofilm-geassocieerde bacteriecelpopulaties te bestuderen bij gesimuleerde katheter-geassocieerde urineweginfecties. Dit model kan verder worden gebruikt om de werkzaamheid te bestuderen van antimicrobiële producten die gericht zijn op het beheersen van urineweginfecties.

Een in-vitroblaasmodel van katheter-geassocieerde urineweginfectie

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van hooggradig sereus ovariumcarcinoom (HGSOC) muismodellen in vitro en in vivo. Van de afleiding van muizen eileiderorganoïden, hun genetische modificatie om menselijke HGSOC-genetica samen te vatten, en hun introductie in de eierstokslijmbeurs van syngene muizen voor in vivo ontwikkeling van tumoren.

Ontwikkeling van van muizen afgeleide organoïdelijnen van eileiderepitheelcellen voor modellering van hooggradig sereus ovariumcarcinoom

Leer een ex vivo infectiemodel met menselijke eileiders om C. trachomatis-pathologie te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers om chlamydia-geïnduceerde celschade en chronische ontstekingsprocessen te analyseren.

Een Menselijke eileider Model voor Onderzoek van

Meer video's verkennen