Een Menselijke eileider Model voor Onderzoek van

Chlamydia trachomatis is een gramnegatieve, obligaat intracellulaire bacterie. Er zijn verschillende chlamydiale serovars bekend die infecties van het oog of het genitale stelsel veroorzaken. Infecties van het genitale stelsel door Chlamydia trachomatis zijn wereldwijd de meest voorkomende seksueel overdraagbare aandoeningen.

Er is een prevalentie van bijna 3 miljoen gerapporteerde infecties in de Europese Unie tussen 1990 en 2009 vastgesteld. In 2009 werden bijna 400.000 gevallen gerapporteerd. Ondanks de voortdurende verbeteringen in de volksgezondheid en seksuele voorlichting, is er een stijgend aantal nieuwe genitale chlamydiainfecties waargenomen, van 70.000 gevallen in 1990 naar 400.000 gevallen in 2009.

75% van alle nieuwe infecties wordt gerapporteerd bij jongeren in de leeftijd van 15 tot 24 jaar. Klinische sequelae treden vermoedelijk op door een inefficiënte klaring van de pathogenen, wat kan leiden tot opstijgende infecties van het lagere naar het bovenste genitale tractus, en vervolgens chronische inflammatoire schade aan het geïnfecteerde weefsel kan veroorzaken. 10 tot 30% van de vrouwen die geïnfecteerd zijn met chlamydia tracheitis ontwikkelen een bekkenontsteking (PID), en tot 50% van de PID-gevallen wordt toegeschreven aan chlamydia tracheitis-infecties.

Bijgevolg wordt bij 50% van de patiënten met tubaire infertiliteit en bij 40% van de patiënten met een buitenbaarmoederlijke zwangerschap chlamydia aangetroffen als het veroorzakende pathogeen. Bij een gezonde, niet-geïnfecteerde vrouw migreert de bevruchte eicel via de eileider naar de baarmoeder, waar deze zich ontwikkelt tot de bevalling. Bij geïnfecteerde patiënten kan chlamydia vanuit het lagere genitale stelsel opstijgen naar de eileider, waardoor chronische ontstekingsprocessen worden getriggerd.

Pathogeen-geïnduceerde schade aan epitheelcellen en het verlies van centrale epitheliale celfuncties worden verondersteld uiteindelijk tubaire occlusie te veroorzaken, wat resulteert in een verminderd of volledig afgesloten eitransport van de eierstokken naar de baarmoeder. Voor dit doel worden menselijke eileiders verzameld en bewaard van vrouwen die een hysterectomie ondergaan. De buizen worden gedissecteerd en voorzichtig geopend.

Volgens de experimentele opzet worden deze in kleine monsters gesneden en gedurende 24 tot 48 uur geïnfecteerd met infectieuze elementary bodies van chlamydia tracheitis op de respectievelijke tijdstippen. De monsters worden gefixeerd met het fixatiemiddel van Monty gedurende ten minste drie dagen tot aan verdere preparatie. Bewaar menselijke eileiders (HFT) van vrouwen die een hysterectomie ondergaan onmiddellijk na de operatie.

In RPMI met 5% FCS zonder antibiotica bij vier graden Celsius tot aan de voorbereiding. Disseceer de menselijke eileider in een Petrischaal met RPMI met 5% FCS zonder antibiotica gedurende het gehele proces. De buis moet ondergedompeld blijven in het medium om uitdroging te voorkomen; snijd het bindweefsel en het tijdens de operatie beschadigde weefsel weg en gooi dit weg.

Open na dissectie de HFT voorzichtig met een klein scalpel. Vermijd weefselschade door onvoorzichtig gebruik van de pincet en het scalpel. Bereid kleine stukjes weefsel voor met een afmeting van vijf bij vijf millimeter voor infectie; bewaar het HFT-monster in 1 mL RPMI met 5% FCS zonder antibiotica en voeg C track toe.

HFT-monsters van OMAS elementaire lichamen worden tot 48 uur geïncubeerd bij 37 °C, 5% CO2 en 20% O2 in een normale incubator of in een zuurstofarme omgeving, minder dan 5% O2 in een hypoxiekamer. Na de respectievelijke incubatietijdstippen worden de monsters verzameld en gedurende ten minste drie dagen bij vier °C bewaard in Monty's Fixative tot aan de SEM- of TEM-preparatie voor transmissie-elektronenmicroscopie. Het gefixeerde weefsel wordt in kleine stukjes gesneden, gewassen en overnacht geïncubeerd met 1% osse en tetroxide.

Na verschillende was- en droogstappen worden de gedehydrateerde preparaten overgebracht naar vers bereide aite en 48 uur lang gepolymeriseerd bij 60 °C. Na het trimmen worden halfdunne en ultradunne coupes gesneden en respectievelijk op objectglazen of grids overgebracht. Na kleuring kunnen de halfdunne coupes met een lichtmicroscoop worden onderzocht ter voorbereiding op transmissie-elektronenmicroscopie.

Verwijder het preparaat uit het fixeermiddel van Monty en snijd dit in stukjes van maximaal twee bij twee bij vijf millimeter. Na het wassen, incubatie in sodium CCO dilate-buffer, wassen met osmiumtetroxide, dehydratatie met oplopende concentraties ethanol, wordt het preparaat overgebracht naar een mengsel van 50% propyleenoxide en aite voor een nacht. Breng het preparaat de volgende dag voor ten minste één uur over naar vers bereide aite.

Breng het geheel vervolgens over in platte mallen, vul deze met resin en laat de resin 48 uur polymeriseren bij 60 °C. Snijd na het trimmen van het ingebedde monster semi-dunne coupes van ongeveer 700 nm of ultradunne coupes van 70 nm met een ultramicrotoom uitgerust met een glazen mes of bij voorkeur een diamantmes. Analyseer het specimen met behulp van licht- en transmissie-elektronenmicroscopie voor de semi-dunne en ultradunne coupes, en met scanning-elektronenmicroscopie.

De preparaten worden op kurkplaten gespeld met het epitheel naar boven gericht, gewassen en gedehydrateerd met oplossende concentraties aceton. Na het drogen in een critical point dryer worden de preparaten overgebracht naar een SEM-monsterhouder en gecoat met platina, goud of palladium met behulp van een sputter coater. Vervolgens zijn ze klaar voor analyse in een scanning elektronenmicroscoop voor scanning elektronenmicroscopie.

Verwijder het specimen uit het fixatief van Monty en oriënteer het weefselstuk met het epitheel naar boven op een kurkplaat, en fixeer de positie met insectenpennen. Na het wassen met sodium caco dilate buffer en een behandeling met aceton, droog het specimen in een critical point dryer. Na overdracht van het specimen van de kurk naar een SEM-specimenhouder, breng een geleidende coating van platina-goud of palladium aan op het specimen met behulp van een sputter coater; breng het gesputterde specimen vervolgens over naar een scanning elektronenmicroscoop voor verdere analyse.

De ongewijzigde hoge incidentie van lumeninfecties bij vrouwen en de enorme klinische gevolgen van opstijgende al-infecties vormen de rationale voor het intensiveren van fundamenteel en translationeel onderzoek in dit gebied. We hebben gebruikgemaakt van een eerder door de groep van St.Perus en anderen vastgesteld ex-vivo weefselmodel van de menselijke eileider om chlamydia-geïnduceerde celschade in de eileider morfologisch te karakteriseren. Door het gebruik van deze methode wordt de vorming van intracellulaire inclusies in verschillende ontwikkelingsstadia waargenomen, waarbij zowel replicerende als persistente infecties zichtbaar zijn.

Er is echter nog geen experimenteel bewijs voor de aanwezigheid van persistente chlamydia in menselijk weefsel van de eileiders, wat verdere analyse vereist van chlamydia, nakomelingen en de transcriptionele opregulatie van persistentiegenen. Een van de belangrijkste beperkingen van dit model is de afwezigheid van ontstekingscellen, wat de analyse van secundaire effecten als gevolg van de initiële glaucomateuze KLA-infectie belemmert. Desondanks lijkt dit model geschikt om omgevingsfactoren, zoals het zuurstofgehalte, te analyseren in de context van schade aan de epitheelcellen van de eileider, en om de initiële immuunrespons van de gastheer tegen een acute glaucomateuze infectie te bestuderen.

Een van de toekomstige doelstellingen is het opzetten van een uitgebreider model voor MIC-testen van CTU's in het pH-model van menselijk weefsel van de eileider, en om dit model te gebruiken om de verschillende ontwikkelingsstadia van CLI's metabool te definiëren met behulp van de tweefoton-laser-scanning microscopietechniek.