Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

In deze video beschrijven we een tijd- en kostenefficiënte procedure voor expressie van gesecreteerde eiwitten van gemaakte Durant HEC 2 9 3 T cellen. Aanvankelijk wordt een 40% Cofluent HEC 2 9 3 T celcultuur bereid in een zes wereldplaat. Vervolgens wordt een transfectiemixsel geproduceerd door het verdunnen van gene juice, vervolgens testplasmiden in serumvrij medium.

De transfectiemixsel wordt op de cellen aangebracht, die vervolgens worden geïncubeerd bij 37 graden Celsius om eiwitexpressie mogelijk te maken. Detectie van eiwit in de supan-agent kan worden uitgevoerd door middel van western blot. Zodra een geschikt construct is geïdentificeerd, kan de procedure worden opgeschaald met behulp van 10-laags celfabrieken.

Cellen worden getransfecteerd met behulp van PEI als de transfectie. Reagens en eiwit kunnen uit de cultuursupernatanten worden gehaald met behulp van tangentiële flowsepareren gevolgd door affiniteitschromatografie. Uiteindelijk maakt dit platform expressie van een breed scala aan macromoleculen in milligram-hoeveelheden mogelijk.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals balo-virusgebaseerde insectencelexpressie, is dat een groot aantal constructen kan worden geschermd en opgeschaald voor expressie met resultaten die binnen drie weken worden verkregen. Het demonstreren van deze procedure zal Hello Aiden zijn voor Shada Zini en Jonathan Cook. Drie afgestudeerde studenten uit mijn laboratorium beginnen met het zaaien van 250.000 HEC 2 9 3 T cellen per put in een volume van één milliliter in een zeswelplaat. Voeg een milliliter per put van 10%FBS pentre gesupplementeerd DMEM en S toe en swir de plaat om de cellen gelijkmatig te verspreiden.

Vervolgens incuberen we de cellen een nacht in een bevochtigde 5% koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius. Zodra de cellen een cofluëntie van ongeveer 40% bereiken, vervangen we het SUP natum door twee milliliter vers medium om de transfectiemixsel voor te bereiden. Geef eerst 90 microliters serumvrij DMEM in een eend of orphbuisje.

Voeg vervolgens drie microliters gene juice, het transfectiereagens, toe, meng voorzichtig de inhoud van de buis en incubeer deze gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 microliters toe van een 100 nanogram per microliter stock van het mini prep gezuiverde plasmide, DNA. Te worden getransfecteerd.

Meng de inhoud van de buis en laat het 15 minuten op kamertemperatuur staan. Om de transfectie uit te voeren, brengt u het mengsel op de HEC 2 9 3 T cellen aan. Laat het mengsel druppel voor druppel zachtjes op de plaat vallen om de transfectiemixsel gelijkmatig te verdelen.

Vervolgens incuberen we de cellen bij 37 graden Celsius. 24 uur later voegen we één milliliter vers medium toe aan elke put en incuberen we deze gedurende nog eens 48 uur. Drie dagen na transfectie, verzamelen we de supinate en detecteren we de expressieniveaus van het eiwit van belang door middel van western blot.

Zodra een geschikt construct is geïdentificeerd, kan de transfectieprocedure worden opgeschaald. Gebruik 10-laags celfabrieken, vul een celfabriek met 1,2 liter DMEM gesupplementeerd met 5% FBS. Voeg vervolgens 200 miljoen HEC 2 9 3 T cellen toe en verdeel de cellen gelijkmatig over alle lagen.

Vier T 225 centimeter vierkante celcultuurflacons die zijn gekweekt tot 100% Cofluëntie bevatten ongeveer 200 miljoen cellen. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius een nacht. Bereid de transfectiemixsel in een T 75 flesje voor door 840 microgram DNA te verdunnen in 84 milliliter steriele eenmaal PBS.

Voeg 2,5 milliliter toe van een milligram per milliliter polyethyleenionenoplossing of PEI en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. De oplossing zou troebel moeten worden. Giet vervolgens het transfectiemixsel langzaam in de celfabriek en verdeel het grondig.

Voeg over alle lagen valproïnezuur toe met een eindconcentratie van vier millimolar. Dit zal de expressieopbrengsten verhogen zodra het transfectiemixsel is toegevoegd.

Incubeer de cultuur gedurende vier dagen bij 37 graden Celsius om eiwitexpressie mogelijk te maken. Verzamel het medium vier dagen na transfectie en reinig onmiddellijk de celfabriek voor hergebruik. Centrifugeer het verzamelde medium gedurende 30 minuten bij 6.000 G bij vier graden Celsius en filter het door een 0,22 micron sterische vacuümfilterinrichting om eventueel deeltjes te verwijderen. Gebruik vervolgens het centra mate tangentiële flowseparerensysteem om het supernatant te concentreren tot 75 milliliter.

Zodra het supernatant is geconcentreerd, kan het eiwit van belang worden gezuiverd door middel van affiniteitschromatografie. In dit experiment hebben we de HA-gehechte subeenheden van de extracellulaire domein van de menselijke AAL twee receptoren gezuiverd met behulp van het grootschalige systeem dat hier wordt beschreven, gevolgd door hoog-affiniteit anti THA-chromatografie. Zoals te zien is in deze kumasi-gekleurde SDS-pagina-analyse.

De extracellulaire domeinen van de interleukine twee receptor alfa- en gamma-subeenheden migreren bij de moleculaire gewichten van 40 kilodalton en 46 kilodalton. De heterogeniteit van de EnLink-glycanen die aanwezig zijn op IL twee R alfa en IL twee R gamma veroorzaakt bandverbreding op de SDS-paginagel. De band met hoger moleculair gewicht vertegenwoordigt besmettend BSA.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u eiwitten uit humane celcultuur kunt expresseren met behulp van 10-laags celfabrieken. Vergeet niet dat HC 2 93 T cellen als biogevaarlijk worden beschouwd en moeten worden behandeld op bioveiligheidsniveau twee. Draag altijd de juiste persoonlijke beschermingskleding en desinfecteer oppervlakken volgens institutionele en overheidsrichtlijnen.