RNA-extractie uit Neuroprecursor cellen met behulp van de Bio-Rad Totaal RNA Kit

Hallo, ik ben Josh Sh, promovendus in het laboratorium van Dr. Ed Maki aan de University of California Irvine. Ik zal u laten zien hoe u RNA extraheert uit neurale precursorcellen met behulp van deze BioRad RNA mini kit. Ik gebruik deze kit in dit laboratorium al een paar jaar en deze levert altijd consistente resultaten met hoge opbrengsten.

De cellen die we gebruiken zijn neuroprecursorcellen van embryo's van 10,5 dagen oud, die acuut zijn gedissocieerd uit embryonale cortices; we zaaien deze gewoonlijk uit in een 24-wells weefselkweekbehandelde plaat die is gecoat met PD L en laminine, met een dichtheid van 100.000 cellen per well. Voordat ik begin, moet ik u vertellen dat u moet werken op een aangewezen bench waar u uw RNA-werk uitvoert. De eerste stap is om er zeker van te zijn dat uw RNA-bench schoon is.

De juiste manier om de werkbank te reinigen is door deze RNA zap te gebruiken. In essentie elimineert dit alle RNA's, aangezien de RA in feite uw RNA's vernietigt. Daarnaast is het belangrijk om altijd handschoenen te dragen tijdens de extractie, omdat uw huid vol met deze RNA's zit.

Dus dat is absoluut niet toegestaan. Oké, wat ik hier heb is de BioRad total RNA mini kit. Ik heb de inhoud eruit gehaald, dus laat me zien wat erin zit.

Ten eerste hebben we deze ene met X dep C behandelde PBS, en we hebben 70% DEP-behandelde ethanol. We hebben een totale RNA-lysiselectie-oplossing waaraan DEPC-behandelde ethanol is toegevoegd. Ten tweede is er een wasstap met lage strengentie waaraan honderd procent ethanol is toegevoegd, de wasstap met hoge strengentie, de DNA-verdunningsoplossing, het DNA zelf en de totale RNA-elutie.

De oplossing plaatsen we in het warmteblok van 70 °C. De overige benodigdheden zijn 1,5 ml dopbuisjes. Deze mogen geen DNA of RNA bevatten, dus zorg ervoor dat u buisjes gebruikt die vrij zijn van deze stoffen.

En we hebben twee doploze buisjes van 2 ml. En het allerbelangrijkste zijn de RNA-kolommen zelf. Zonder deze kunt u geen RNA-extracties uitvoeren.

Om deze kolommen te assembleren, heeft u de RNA-kolom en de 2 mL capless tube nodig; voeg deze simpelweg zo samen en u bent klaar om te beginnen. Oké, en het laatste wat we altijd nodig hebben zijn deze cellen. De cellen hier zijn Eton and a half neurale precore-cellen.

Deze werden acuut gedissocieerd uit embryonale cortices. Ze zijn enkele dagen gegroeid in temple-medium. Ik heb de cellen uit de 37 °C incubator gehaald.

Dit protocol is specifiek voor adherente cellen. Deze cellen zijn gekweekt op weschaalplaatjes van 0,4 met weefselkweekbehandeling die zijn gecoat met PDL en laminaat. Ik ga nu een vacuümslang gebruiken om het medium af te zuigen.

De volgende stap is om ongeveer 500 µL van de dep SEA PBS toe te voegen. Ook hier willen we filtertips gebruiken. De PBS dient in feite om het medium weg te wassen.

U wilt voorkomen dat mediumcomponenten in uw RNA-kolom terechtkomen of uw RNA-extractie beïnvloeden, omdat u anders geen goede opbrengsten zult verkrijgen. Oké? Ik ga nu snel de PBS aspireren, omdat neurale stamcellen niet goed tegen PBS kunnen. Vervolgens voeg ik aan elk monster 350 µL lysisbuffer toe.

Zorg er vervolgens voor dat u beta-mercaptoethanol aan de lysisbuffer heeft toegevoegd. Nu pipetteer ik de lysisbuffer 15 keer op en neer om er zeker van te zijn dat de cellen zijn gelyseerd, zodat we de RNA-inhoud kunnen extraheren.

Nu voeg ik 70% ethanol toe aan elke put; nadat ik 350 µL van deze 70% ethanol heb toegevoegd, pipetteer ik dit 10 keer op en neer in elke put. Ik heb dit 10 keer op en neer gepipetteerd voor elke put. Nu stel ik mijn pipetteur in op iets meer dan 700 µL, aangezien het totale volume van elke put 700 µL is.

Nadat ik het volume van meer dan 700 µL heb opgezogen, breng ik dit over in een RNA-kolom. Na het toevoegen van de inhoud aan de kolom, plaats ik deze in de centrifuge en centrifugeer ik 30 seconden op maximale snelheid. Na deze eerste centrifugatie van het lysaat, gooi ik het filtraat weg door het in een lege beker te gieten.

Een andere methode die sommigen gebruiken, is het gebruik van een vacuümslang om het filtraat af te zuigen. Vervolgens voegt u 700 µL van de washbuffer met lage strengheid toe. Zorg er opnieuw voor dat u de ethanol hieraan toevoegt.

Nu ga ik het 30 seconden op maximale snelheid centrifugeren. Na het centrifugeren van de wasbuffer met lage stringentie, zal ik het filtraat weggooien. Oké? Vervolgens ga ik de DNA-oplossing bereiden.

Voeg dus voor elk monster 5 µL DNA toe. Voor ons geldt dat we het DNA al in aliquoten hebben verdeeld voordat we hiermee beginnen, aangezien het wederom om een enzym gaat.

Het is beter om ze als aliquoten te bewaren. Als u ze in zijn geheel bewaart, zal het herhaaldelijk vriezen en ontdooien de enzymatische activiteit vernietigen. Daarom ga ik, nadat ik de 5 µL DNA heb toegevoegd, dit verdunnen met 75 µL van de DNA-verdunningsoplossing.

Nadat u dit heeft toegevoegd, is het totale volume 80 µL DNA-oplossing. Ik ga nu 80 µL van de DNA-oplossing aan elk monster toevoegen. Zorg ervoor dat de vloeistof op het membraan van de kolom terechtkomt.

U wilt dat de DNA-oplossing in het membraan wordt opgenomen. Zo verwijdert u het DNA en verhoogt u de RNA-opbrengst.

Nadat u de DNA's heeft toegevoegd, laat u de kolom 15 minuten bij kamertemperatuur staan, zodat het enzym zijn werk kan doen. Nogmaals, u incubeert het gedurende 15 minuten. Oké, de timer gaat af.

Na de incubatie van 15 minuten ga ik de DNA's 30 seconden op maximale snelheid centrifugeren. Oké, na 30 seconden centrifugeren om de DNA's te laten bezinken, gooi ik het filtraat weg. Nu voeg ik 700 µL high stringency buffer toe om eventuele resterende DNA's uit te wassen.

Nadat ik dat heb toegevoegd, centrifugeer ik het geheel opnieuw gedurende 30 seconden. Na het centrifugeren verwijder ik het filtraat met hoge strengheid door het in een opvangbak te gieten. Vervolgens voegen we 700 µL van de buffer met lage strengheid toe.

Deze keer ga ik het één minuut op maximale snelheid centrifugeren in de Centri Beach. Na de eerste wasbeurt van één minuut met lage strengentie ga ik het filtraat weggooien. Deze keer voeg ik niets toe, maar ik ga opnieuw twee minuten centrifugeren om de resterende lage strengentie te verwijderen, omdat de lage strengentie ethanol bevat en dat uw RNA-opbrengst zal verlagen.

Ik haal nu de elutiebuffer uit het warmteblok van 70 °C. Ter herinnering: zorg ervoor dat u vóór aanvang van het experiment de elutiebuffer op 70 °C brengt; we willen deze warm houden om de efficiëntie van uw RNA-opbrengst te verhogen. Ik heb de kolommen klaarstaan.

Ze zijn gecentrifugeerd. De volgende stap is het verwijderen van de kolommen. Oké, ik gooi de dopjes weg en we gaan ze overbrengen naar deze dopjes.

Voeg 50 µL van de Lucian-buffer toe aan elke kolom. Zorg ervoor dat de Lucian-buffer op het membraan terechtkomt, zodat dit volledig wordt doordrenkt. Als dit niet gebeurt, zal de RNA-opbrengst onvoldoende zijn.

Laat de kolom nu één of twee minuten staan om ervoor te zorgen dat de elutie in het membraan van de kolom trekt. Oké, er is nu één minuut verstreken. Nu kan ik deze naar de centrifuge brengen.

Nu plaats ik de kolommen in de centrifuge. Ik zal deze één minuut op maximale snelheid centrifugeren. Dit is de laatste centrifugatiestap, waarna u het geëlueerde pollutant of het RNA opvangt in deze dopjes.

Haal nu, na de laatste centrifugatiestap, de inhoud eruit en verwijder de kolom; deze kan worden weggegooid. Sluit de buis en bewaar deze bij -80 °C, zodat u ze later naar wens kunt gebruiken. Ik heb zojuist RNA geëxtraheerd met behulp van de BioRad RNA-kit. Nu ga ik de concentratie van het geëxtraheerde RNA meten, of we kunnen de optische dichtheid (OD) ervan bepalen met een spectrofotometer.

Dit is wat ik u ga laten zien. Eerst moeten we een verdunningsmengsel maken. Dit wordt een verdunning van één op vijf.

We gaan ons RNA mengen met enkel Milli-Q gefilterd water. Daarom maak ik eerst een blanco. Ik neem twee microliter van de elutie-oplossing die we eerder hebben gebruikt om ons RNA te elueren, en voeg daar acht microliter Milli-Q water aan toe. Oké?

Dit is onze blanco. Nu ga ik de sample voorbereiden. Dat wordt twee microliters van ons RNA van belang.

We voegen opnieuw acht microliter MQ-water toe. Dat maakt het een verdunning van 1:5, toch? Ik heb deze cuvet waarin ik mijn monsters zal plaatsen en ik ga deze cuvet in de spectrometer laden.

Laten we dit nu gaan meten. Voordat ik de OD van de RNA-monsters meet, moet ik mijn cuvet reinigen. Hier is opnieuw de glazen cuvet.

Raak de voorkant er nooit aan. Anders laat u vingerafdrukken achter en krijg ik onjuiste metingen. Daarom ga ik eerst de glazen cuvette wassen met dubbel gedestilleerd water.

Vervolgens gebruik ik een vacuümslang om het water weg te zuigen. Na deze stap spoel ik het materiaal met 95% ethanol en gebruik ik opnieuw een vacuümslang om de ethanol te verwijderen.

Nu ben ik klaar om mijn blanco te laden. We hebben eerst de blanco nodig om onze metingen te normaliseren. Ik ga daarom 10 µL van het mengsel nemen dat we zojuist hebben gemaakt.

Ik ga de oplossing nu goed mengen om een homogeen mengsel te verkrijgen. Vervolgens breng ik het naar deze spectrofotometer. Dit is de Ultra Spec 3, 100 probe machine, en we gaan de RNA-concentratie meten.

Open dus de machine en plaats het in een van deze houders. We gaan de programma's zo aanpassen dat alleen RNA wordt uitgelezen. Oké, nogmaals, we hebben een verdunning van 1 tot 5 uitgevoerd.

We stellen de verdunningsfactor in op vijf. Oké, ik ben klaar om te beginnen. Ik druk nu op 'run' om de blanco te refereren.

Goed, hij staat nu op nul. We zijn nu klaar om ons monster te meten. Ik zal nu de glazen bedplaat verwijderen.

Ik ga de inhoud van het blanco monster afzuigen. Vervolgens zal ik het wassen met dubbel gedestilleerd water. Daarna zal ik het wassen met 5% ethanol.

Ik ben nu klaar om 10 µL van ons monster van belang te laden. Zorg er opnieuw voor dat u uw monster goed mengt. We laden het vervolgens in het glazen vat.

Nu kunnen we de resultaten aflezen. Na het meten van de optische dichtheid (OD) moet een goede opbrengst en zuiverheid een RNA-absorbantieratio van 2,60 tot 2,80 hebben, wat ongeveer 2 is. De opbrengst is ongeveer 144 µg per ml.

Hoewel de machine 72 micrograms per mil aangeeft, moeten we dit met twee vermenigvuldigen vanwege de halve lengte in onze vets, twee centimeters. We hebben u laten zien hoe u RNA extraheert uit neuro-precursorcellen. We maken opnieuw gebruik van de total mini RNA kit van BioRad. We hebben andere kits geprobeerd en dit is, op basis van de efficiëntie, de beste kit die we gebruiken.

Dat resulteert in RNA van een hoge kwaliteit. Als u deze kit gebruikt, zult u dezelfde hoogwaardige resultaten verkrijgen die wij altijd behalen.