Computed Tomography-begeleide tijd-domein Diffuus fluorescentie tomografie in kleine dieren voor het lokaliseren van Cancer Biomarkers
17 juli 2012
Diffuse fluorescentie tomografie biedt een relatief goedkope en potentieel hoge hele benadering van de preklinische In vivo Tumor beeldvorming. De methodiek van optische data verzamelen, kalibratie en beeldreconstructie wordt gepresenteerd voor een computertomografie-geleide non-contact tijd-domein systeem met behulp van fluorescerende doelgerichtheid van de tumor biomarker epidermale groeifactor receptor in een muis glioom model.
Het algemene doel van het volgende experiment is om fluorescentiebeelden te produceren van de expressie van epidermale groeifactorreceptor in een ortotopisch glioom muismodel. Dit wordt bereikt door de linker hersenhelft van een A IIC muis te inoculeren met groen fluorescente eiwitten die expressie van humane U2 51 glioomcellen uitoefenen. Nadat de tumor twee weken is gegroeid, wordt de muis geïnjecteerd met een cocktail van twee fluorescerende tracers.
De muis wordt vervolgens geïmagerd op een klein dier x-ray systeem om anatomische gegevens te verzamelen die nodig zijn voor nauwkeurige beeldreconstructie. De gegevens worden gebruikt om de bron en detectielocaties van het optische tomografiesysteem anatomisch te positioneren, en gespecialiseerde software wordt gebruikt om de fluorescentiegegevens te verzamelen en om het uiteindelijke beeld te construeren. Uiteindelijk kan deze methode een beeld van een tumor construeren op basis van de overexpressie van epidermale groeifactoren met behulp van zowel fluorescentie als x-ray beeldvorming, waarvan de nauwkeurigheid kan worden vergeleken met beeldvorming met contrastverbeterde magnetische resonantie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals ladingskoppeling, apparaatgebaseerde kleine dier fluorescentietomografie, is dat enkele foton telling detectie met behulp van fotovermenigvuldigers een veel hogere gevoeligheid en dynamisch bereik voor lichtdetectie biedt. Deze methode kan uiteindelijk worden gebruikt om de effectiviteit van moleculaire therapieën te bewaken door de expressie van hun doelen te meten. Terwijl subcutane tumoren gemakkelijk kunnen worden geïmagerd met niet-tomografische methoden met behulp van oppervlaktebeeldvorming. Dit systeem is ontworpen om door weefsel tot enkele centimeters dik te beeldvormen, waardoor het bijzonder geschikt is om contrastmiddelen af te leveren en lekkage in hersentumoren te beeldvormen.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in kanker biomarker expressie, kan het ook worden toegepast op andere studies van ziekten zoals infectie, obesitas of verouderingselementen zoals Alzheimer. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn voor deze methode worstelen vanwege de diffuse aard van lichtvoortplanting in biologisch weefsel en de moeilijkheid om x-ray tomografie te gebruiken voor de reconstructie van diffuus licht. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang.
Aangezien de stappen voor gegevensverzameling en beeldreconstructie moeilijk te leren kunnen zijn, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de gegevens die van het fluorescente systeem worden verzameld goed gekalibreerd zijn. De near fast softwarepakket is ontworpen om optische gegevens te lezen en de x-ray tomografiebeelden te gebruiken om een eindig elementennetwerk te maken, dat wordt gebruikt als een ruimtelijk sjabloon voor fluorescentie reconstructie. Om te beginnen plaatst u een geanesthetiseerde atymische naakte muis op een steriele chirurgische sjaal en bevestigt u de diepte van de anesthesie voordat u doorgaat met het schoonmaken en desinfecteren van de huid boven het incisiegebied.
Gebruik Betadine om een steriele chirurgische sjaal over de incisieplaats te plaatsen met behulp van een scalpel, maak een kleine incisie iets links van de middenlijn en 0,5 centimeter posterieur aan de intraoculaire lijn. Maak het oppervlak van de schedel schoon door alle bindweefsel weg te ruimen, zodat herkenningspunten kunnen worden geïdentificeerd. Zodra de schedel is blootgelegd, gebruikt u een hogesnelheidsboor met een steriele millimeter bit om een gat te maken dat twee millimeter links van de centrale lijn en twee millimeter achter de bgma ligt.
Laad een Hamilton Micros-spuit met een stomp uiteinde van 27 gauge naald met de cellen die moeten worden geïmplanteerd. Plaats vervolgens de muis op een stereotactisch frame. Bevestig vervolgens een diepe chirurgische en esthetische vlak met een teenknijper en plaats de chirurgische sjaal weer op het dier.
Bevestig vervolgens de geladen spuit op het stereotactisch frame. Positioneer de spuit boven het gat in de schedel en steek de punt van de naald drie millimeter onder het oppervlak van de schedel. Trek vervolgens de naald een millimeter terug om een zakje te maken.
De volgende stap is om de cellen gedurende een periode van vijf minuten langzaam in de linker hersenhelft te injecteren. Zodra de injectie voltooid is, trekt u de naald terug en veegt u het gat af met Betadine. Om te voorkomen dat cellen buiten de injectieplaats groeien, verwijdert u de muis uit het stereotactisch frame en vult u het blootgestelde gat met voorverwarmde beenwas.
Sluit tot slot de incisieplaats met steriele vijf oh nylon hechting. Breng de muis terug naar een verwarmde kooi en monitor tot herstel. Na herstel, injecteert u de muis met 130 microliters van 0,1 milligram per kilogram buprenorfine IP en laat u de tumor 14 dagen groeien voordat u gaat beeldvormen. Op de dag van muisbeeldvorming, start u het systeem om de lasers en lichtdetectoren ongeveer 20 minuten te laten opwarmen.
Om driften en systemgevoeligheid te voorkomen, plaatst u een 100 graden bij vier graden geconstrueerde lijnverspreider in het directe centrum van de beeldvormingsgantry om de excitatielasers gelijkmatig in intensiteit te verspreiden onder de detectiekanalen van het systeem. Pas de hoek van de verspreider met de hand aan om de hoeveelheid signaal te maximaliseren die door alle vijf lichtverzamelkanalen wordt gedetecteerd. Plaats vervolgens optische dichtheid.
Twee neutrale dichtheidsfilters voor alle fluorescentiedetectie fotovermenigvuldigers genaamd PMT's en optische dichtheid. Een neutraal dichtheidsfilter voor alle transmittansdetectie. PMT's verzamelen 100 temporele pulsverspreidingsfuncties of T psfs van de laser, elk met een integratietijd van een seconde voor elke laser achtereenvolgens, normaliseer elke TPSF door de laserreferentie, corrigeer voor temporele drift in de laserreferentie en gemiddeld over alle iteraties voor elke detector en elke laser afzonderlijk.
Deze gemiddelde TPS's zijn de detectorspecifieke instrumentresponsfuncties die worden gebruikt bij de optische beeldreconstructie 12 uur voorafgaand aan de beeldvormingsprocedure. Injecteer de testmuis met een cocktail van fluorescerende tracers. Nauwkeurige kalibratie van het fluorescentietomografiesysteem en het beperken van dierdier zijn de moeilijkste
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het produceren van fluorescentiebeelden van epidermale groeifactorreceptorexpressie in een glioma-muismodel. De techniek combineert fluorescentie en röntgenbeeldvorming om tumorvisualisatie te verbeteren en moleculaire therapieën te monitoren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Fluorescentietomografie is een veelbelovende benadering voor tumorbeeldvorming.
- De epidermale groeifactorreceptor is een belangrijke biomarker bij glioma's.
- Bestaande beeldvormingsmethoden kunnen gevoeligheid en dynamisch bereik missen.
- Deze studie heeft tot doel de beeldvorming door weefsel te verbeteren met behulp van geavanceerde technieken.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het beeldvormen van tumorbiomarkers in vivo.
- Om de nauwkeurigheid van deze methode te vergelijken met traditionele beeldvormingstechnieken.
- Om het monitoren van moleculaire therapieën in kankerbehandeling te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Inoculatie van gliomacellen in een muismodel.
- Injectie van fluorescerende tracers voor beeldvorming.
- Gebruik van een kleindier-röntgensysteem voor het verzamelen van anatomische gegevens.
- Calibratie en reconstructie van beelden met behulp van gespecialiseerde software.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van tumorexpressie met behulp van fluorescentie- en röntgengegevens.
- Verbeterde gevoeligheid en dynamisch bereik vergeleken met traditionele methoden.
- Aangetoond potentieel voor het monitoren van kankertherapieën.
- Gecondeerde uitdagingen bij gegevensverzameling en beeldreconstructie.
Conclusies
- Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor tumorbeeldvorming in preklinische studies.
- Het biedt inzichten in kankerbiomarkerexpressie en de effectiviteit van therapieën.
- Verdere optimalisatie en training zijn noodzakelijk voor nieuwe gebruikers.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables sensitive detection of epidermal growth factor receptor expression in deep-tissue tumor models, addressing a key limitation in preclinical oncology imaging. By combining time-domain fluorescence tomography with microCT co-registration, it improves biomarker localization accuracy and supports quantitative assessment of target engagement. The approach enhances predictive confidence in early-stage therapeutic development by providing mechanistic insight into biomarker expression dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal growth factor receptor overexpression as a therapeutic hypothesis in glioma models.
- Operational Value: Provides quantitative fluorescence readouts that support functional target validation and biomarker density assessment.
- Predictive Value: Improves confidence in target selection by correlating imaging signal with histopathological validation via contrast-enhanced MRI.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible fluorescence maps that reflect specific tracer binding to cell surface receptors.
- Operational Value: Supports assay readiness through dual-tracer methodology that distinguishes receptor-mediated from non-specific uptake.
- Platform Utility: Enables scalable imaging workflows for longitudinal monitoring of biomarker expression in preclinical studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by quantifying epidermal growth factor receptor expression in vivo.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via cross-modality correlation with MRI.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing spatially resolved, quantitative biomarker data.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling non-invasive monitoring of biomarker modulation in preclinical models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of receptor overexpression and pathway activation in orthotopic tumor models.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative fluorescence outputs with high sensitivity and dynamic range for compound evaluation.
- Analytics: Provides time-domain photon flux measurements that enable precise reconstruction of biomarker distribution and expression levels.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through co-registered anatomical imaging and quantitative biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across tumor types and therapeutic modalities in oncology research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation through quantitative, spatially resolved biomarker imaging.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible data acquisition with sensitivity superior to conventional CCD-based fluorescence tomography.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing biological uncertainty in target expression and drug-target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of therapeutic candidates based on measurable biomarker modulation in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, fluorescence quantification, and small animal handling.
- Depends on single-photon detection hardware, time-domain laser systems, and co-registered microCT infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for calibration protocols, data normalization, and reconstruction workflows.
- Involves adaptation considerations for different tumor models, tracer chemistries, and anatomical sites beyond orthotopic glioma.
- Involves practical limitations related to long acquisition times and complex data calibration, which affect throughput and require operator training.
