Name: Optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Ontdek een optische methode voor het registreren van neurale spikingactiviteit met hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Deze techniek gebruikt fluorescentiemicroscopie met twee-fotonexcitatie en een deconvolutiealgoritme om spike-tijdstippen te extraheren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Randy Chitwood voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Whitehall Foundation en de Alfred P. Sloan Foundation subsidies aan HJK.

1. Optische opstelling (figuur 1) <ol><li> Voor twee-fotonexcitatie een infrarood laser gepulst systeem femtoseconde pulsen gebruikt. Een hoge laser uitgangsvermogen (soms&gt; 2W bij 890 nm golflengte) nodig om de grote verliezen die door de optische componenten van het systeem te compenseren. </li><li> Een prechirper bestaande uit twee prisma zorgt voor een negatieve groep snelheidsdispersie (GVD) op de laserpulsen voor de acousto-optische deflectoren (gedelegeerd ordonnateur) ter compensatie van de temporele dispersie die door de gedelegeerd ordonnateur 1. </li><li> Twee gedelegeerd ordonnateur met grote openingen (10 mm voor een 40x water immersie objectief met NA 0,8) buigen de laserstraal in twee dimensies. </li><li> Een reflecterende diffractierooster met 100 bosjes / mm geplaatst van 13 cm achter de gedelegeerd ordonnateur van de ruimtelijke spreiding geïntroduceerd door gedelegeerd ordonnateur compenseren bij gebruik van korte laserpulsen. </li><li> De laserstraal wordt gericht met twee relais telescopen in de camera-poort van een rechtopstaande microscope. </li><li> Irissen worden geplaatst op regelmatige tijdstippen voor het uitlijnen van de optische componenten. </li><li> Een dichroïsche bundelsplitser voor het doel zendt het infrarood excitatielicht met het model en weerspiegelt de fluorescentie van het monster op een detector. </li><li> Epi-en transfluorescence detectoren (fotomultiplicatoren, PMT&#39;s) te verzamelen fluorescentie-signaal door de objectieve en - indien van toepassing - door de condensor. </li><li> Gekleurd glas filters (BG-39, 3-5 mm) worden geplaatst voor de detectoren aan excitatielicht voorkomen bereiken van de detectoren. </li><li> De AOD afbuighoeken gestuurd door een computer uitgerust met een digitaal-analoog-converter board (156,25 kHz kloksnelheid), dat op zijn beurt spanningsgestuurde oscillatoren. </li><li> Het signaal van de fotomultiplicatoren wordt doorgegeven via een laagdoorlaatfilter Butterworth filter (cut-off frequentie van 100 kHz) en gedigitaliseerd door een analoog-digitaal-omzetter (156,25 kHz kloksnelheid) voordat deze wordt opgeslagen ineen computer voor analyse. </li><li> Uitlijning en elektrische ruis getest door registratie van de verdeling van fluorescentiesignalen met en zonder laserlicht, bij lage en hoge gain van de fotomultiplicatoren, en met en zonder indicator. De scanner correct is ingesteld en afgeschermd wanneer de breedte van de verdeling van de fluorescentiesignalen bij hoge gain en indicator is veel groter dan de breedte van de andere distributies van fluorescentiesignalen (Fig. 2). </li></ol> 2. Experimentele procedures <ol><li> Geditherde random-access scanning is gebaseerd op de detectie van intracellulaire stijging van calcium. Een groot aantal neuronen kan worden gekleurd met bolus injectie van de ester vorm van een calcium indicator (bijvoorbeeld Oregon Green 488 Bapta AM-1) in zenuwweefsel 5. </li><li> Verschillende locaties van elk neuron soma opgenomen, elk voor een korte tijd (&quot;dithering&quot;, 4 plaatsen, 6,4 microseconden voor elke locatie = 25,6 us opnametijd voor each neuron in elke cyclus, Fig. 3C). Om neuronen plaats selecteren full frame bestaande uit 256x256 pixels wordt verkregen (Fig. 3A). Het midden van elke neuron soma worden geregistreerd handmatig gekozen binnen het beeld. De controle software voegt automatisch drie punten bij 2 micrometer afstand rond dit centrum. </li><li> In elke cyclus wordt de fluorescentie signaal dat van elk van de 40 neuronen (Fig. 3B). Dit proces wordt herhaald voor de gehele duur van een opname (5 tweede registratie = 3,255 cycli, 1 cyclus = 1,536 ms). </li></ol> 3. Online software tools om spike detectie-efficiëntie te maximaliseren <ol><li> Spike detectie van fluorescentie somatische calcium signalen berust op een hoge signaal-ruisverhouding (S / N) verhouding van de somatische fluorescentie calcium signalen. Een hoge S / N kan worden bereikt door excitatie-intensiteit. Excitatie-intensiteit kan echter alleen worden verhoogd tot een bepaalde limiet door zonbeschadigde. Spike detectie is hoog in een zeer kleine Window excitatie intensiteiten wanneer fluorescentiesignalen een hoge S / N, maar slechts weinig zonbeschadigde waargenomen 3. Om ervoor te zorgen dat de geregistreerde signalen binnen het raam van hoge piek detectie tijdens opnames we controleren foton rate (zie vergelijking 3.2) en een afname van de basislijn fluorescentie met behulp van online analyse. </li><li> Geschatte foton rate per neuron wordt berekend uit een korte tijdspanne (100-200 ms) van basislijnruis. Aantal fotonen (N λ) en foton rate (λ = N λ / At) wordt berekend uit de fluorescentiewaarden door het aanbrengen van de verdeling (σ) van relatieve fluorescentie verandert met de volgende vergelijking: </li></ol><img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/4052/4052eq1.jpg" /> Deze vergelijking geeft de Poissonverdeling voor foton opname ruis met een verandering van variabele relatieve fluorescentie change: AF / F = (G * N λ (t)-N * G &amp; lamBDA,, 0) / G * N λ, 0 waarbij G staat voor de cumulatieve winst van fotomultiplicator en alle andere elektronische componenten. Merk op dat deze vergelijking niet correct het aantal gedetecteerde fotonen in vivo opnames bepalen omdat er andere geluidsbronnen (bewegingsartefacten) naast foton schot ruis. Echter deze vergelijking is bruikbaar voor in vivo opnames de ruisschatting. <ol start="3"><li> Baseline fluorescentie na diezelfde tijdvenster en uitgezet als functie van tijd of trials. De gemiddelde daling van de uitgangswaarde wordt gehouden onder 0,0002 / s door het aanpassen van laservermogen omdat spike detectie snel daalt bij het overschrijden van deze limiet. </li><li> Elke 10-20 min het neuron somata posities zijn gecontroleerd door opnieuw het verwerven van een full frame beeld. Indien nodig, worden de opname locaties aangepast. Locaties kunnen worden aangepast voor alle neuronen in een keer, of voor individuele neuronen. </li></ol> 4. Reconstruction van de spike timing van fluorescentie signalen (deconvolutie) <ol><li> De fluorescentiesignalen gevolg van neurale activiteit vaak summate in tijd omdat het verval van de calcium transiënten lang is (enkele honderden milliseconden). Een deconvolutie methode reconstrueert spike en spike timing van fluorescentie signalen. </li><li> Om de meest waarschijnlijke spike trein ten grondslag liggen aan het opgenomen fluorescentie signaal te bepalen, zijn verschillende modellen vergeleken. Hier gebruikten we een genetische algoritme om het model te bepalen - en daarmee de trein en spike spike timings - de maximum likelihood. </li><li> In inhomogene populaties van neuronen, kan de spike-opgeroepen calcium signaal variëren tussen neuronen. Voor clustering analyse van gegevens die we gemaakt van een algoritme dat rekening houdt met de variatie van de spike-opgewekte signaal van calcium neuron tot neuron. </li><li> Om te voorkomen een groot aantal vals positieve detectie is het nuttig vernauwen het toegestane amplitude en verval tijdsconstante van de model van de spike-opgeroepen calcium signaal. De gezamenlijke verdeling van de amplitude en verval tijdsconstante van single-spike opgewekte calcium transiënten worden in een aparte reeks experimenten uit hetzelfde type van neuronen onder dezelfde proefomstandigheden simultaan elektrofysiologische en optische opnamen. </li><li> Om rekening te houden langzame basislijn wijzigingen en om computationele kosten van deconvolving te verminderen, zijn langere opnames onderverdeeld in verschillende kortere sporen van 1-5 seconden. </li><li> Voor elke neuron en elke opname kan de deconvolutie algoritme testen een groot aantal modellen (tot 1.000.000 of meer verschillende modellen). Om het tempo van deconvolutie, is een experiment deconvolved op maximaal 10 verschillende computers in parallel. </li><li> Na deconvolutie, wordt de piek data geanalyseerd en gecontroleerd. Een peri-stimulus time histogram, spike waarschijnlijkheid, en vuursnelheid (gemiddelde piek per neuronen) worden berekend op een geautomatiseerde manier. </li></ol> 5.Representatieve resultaten Spike succesvolle detectie berust op een hoge signaal-ruisverhouding van de opgenomen fluorescentie somatische calcium signalen. Gewoon met behulp van hoge excitatie tarieven (hoog laservermogen) kan leiden tot een negatief effect van photoeffects op biologisch materiaal (zonbeschadigde). In geditherde random-access scanning zonbeschadigde manifesteert zich als afname van de uitgangswaarde fluorescentie en vermindert van de spike-opgeroepen calcium fluorescentie signalen. De daling in de spike opgewekte signaal kan snel leiden tot niet spikes detecteren. Er is slechts een zeer klein venster van de excitatie-intensiteit waar spike detectie van fluorescentie signalen is hoog. Op het hogere eind dit venster wordt beperkt door zonbeschadigde op het ondereinde van de fluorescentiesignalen een laag signaal-ruisverhouding. Voor corticale neuronen in acute plakjes gebruiken we laservermogen resulteert in foton tarieven van ongeveer 400,000-1,500,000 foton / s bij het opnemen van ongeveer 100 micrometer hieronder plak oppervlak. Bij gebruik van een-Affiniteit indicator - hier Oregon Green 488 BAPTA - 1 - dit signaal voldoende is om individuele pieken te detecteren. Fig. 3E toont een voorbeeld van een fluorescentiesignaal opgeslagen bij zeer lage excitatie komt een voorbeeld van een opname in het detectievenster, en een zeer hoge excitatie rate. Vergeleken met andere technieken om neurale activiteit nemen met single-cell en enkele piek resolutie, geditherd random-access scanning kan opnemen van een groter aantal neuronen uit dezelfde bevolking, en is minder invasief bijvoorbeeld in vergelijking met tetrode / multielectrode opnames . Zo geditherde random-access scanning kan worden gebruikt om neurale activiteit opnemen van vele neuronen wederzijdse informatie gesignaleerd suprathreshold activiteit 6 (Fig. 4A), veranderingen van neurale activiteit in een populatie neuronen (corticale plasticiteit) meten en propagatie van suprathreshold activiteit door populaties van neuronen 14 (Fig. 4B) <img<html> alt = &quot;Afbeelding 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg&quot; /&gt; Figuur 1. Optische ontwerp van de geditherde-random access scanning setup. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig2.jpg" /> Figuur 2 Uitlijning en testen:. Distributies van fluorescentie signalen die worden opgenomen onder verschillende omstandigheden. A) No laserlicht en laag photomultiplier gain, B) bij hogere gain PMT, maar laserlicht, de verdeling breder is door de fotomultiplicator donkerstroom. C) Met de laser op en opgenomen bij hoge PMT winst. Een verschil tussen de verdelingen in getoond in B en deze verdeling zou blijken dat excitatielicht bereikt PMT detectoren. D) De verdeling van fluorescentie signalen opgenomen met hoge versterking van neuron somata. Als er geen andere geluidsbron draagt, deze verdeling komt voort uit foton shot-noise alleen. . Jpg &quot;/&gt; Figuur 3 A) Schermvullend fluorescentie beeld op te sporen en te selecteren neuron somata posities, B) Scan pad van een cyclus, C) Illustratie van de dithering principe;. Per soma (cirkel) diverse locaties zijn opgenomen voordat u de balk naar de volgende soma, D) Illustratie van de output van de twee D / A kanalen. Voor elke neuron soma wordt opgenomen fluorescentiesignaal van 4 verschillende plaatsen in elke soma (S1-S4). De locatie van elke spot wordt bepaald door de x en y-positie. De x-en y posities voor alle vlekken en alle neuronen worden verzonden naar de digitaal-analoog omzetter op een sequentiële wijze. Terwijl de bundel wordt bewogen tussen twee neuron somata, wordt geen signaal verkregen (blanco). E) Voorbeelden van fluorescentiesignalen. Merk op dat elk voorbeeld verband met een spike toont (zoals gemeten met elektrofysiologische cell-ingeschreven opname). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4052/4052fig4.jpg" /> Figuur 4. Studeren Cortical functie met behulp van geditherde random-access scanning. A) Het meten van wederzijdse informatie gesignaleerd door populaties van neuronen. Bovenste beeld toont microfoto van een acuut hersenletsel slice en twee pipetten stimulatie in dezelfde kolom in corticale laag 4 (L4). Center grafieken tonen neurale antwoorden voor elke herhaling van een stimulus. Onderste grafiek toont wederzijdse informatie Shannon&#39;s gesignaleerd door de geregistreerde bevolking van neuronen. B) het meten voortplanting van suprathreshold spiking activiteit (signaalvoortplanting) tussen populaties van corticale neuronen. Bovenste grafiek toont proefopzet middenbeeld fluorescentie beeld toont, stippellijnen vat grenzen aangeven onderste grafiek toont gedetecteerd spikes in antwoord op elektrische stimulatie van thalamocorticale vezels (driehoeken).

<ol><li>Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+functional+imaging+of+single+neurons+using+random-access+multiphoton+%28RAMP%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy.</a> J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73(1990).</li>
<li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+neuronal+spiking+activity+from+unbiased+populations+of+neurons+with+high+spike+detection+efficiency+and+high+temporal+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision.</a> J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).</li>
<li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cortical+plasticity+on+information+signaled+by+populations+of+neurons+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex.</a> J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).</li>
<li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li>
<li>Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+relationships+between+spiking+and+%5BCa2%2B%5Di+in+neurons+of+the+Xenopus+tadpole+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb.</a> J. Physiol. 582, 163-175 (2007).</li>
<li>Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+compensation+for+spatial+and+temporal+dispersion+of+acousto-optical+deflectors+for+two-dimensional+scanning+with+a+single+prism%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism.</a> Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).</li>
<li>Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+neuronal+activity+at+high+frame+rate+with+a+digital+random-access+multiphoton+%28RAMP%29+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope.</a> J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).</li>
<li>Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike+inference+from+calcium+imaging+using+sequential+Monte+Carlo+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods.</a> Biophys. J. 97, 636-655 (2009).</li>
<li>Yaksi, E., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+firing+rate+changes+across+neuronal+populations+by+temporally+deconvolved+Ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging.</a> Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).</li>
<li>Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+decrease+with+propagation+of+spiking+activity+in+the+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex.</a> Front Neural Circuits. 5, 8(2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Geditherde random-access scanning detecteert indirect suprathreshold spiking activiteit van de stijging van de intracellulaire calcium somatische die bij elke piek in een neuron somata. De toename in intracellulaire calcium gedetecteerd door fluorescente kleurstoffen calcium. De beperkingen van geditherde random-access scanning zijn grotendeels uit de beperkte signaal-ruisverhouding van het calcium fluorescentiesignalen. De signaal-ruisverhouding weer beperkt door zonbeschadigde, waarvan geen gebruik van hoge excitatie ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Optische componenten in volgorde vanaf de laser </td></tr><tr><td> Titan: Sapphire Laser </td><td> Coherent Inc </td><td> Chameleon Ultra 2 </td><td> Hoog vermogen aanbevolen (&gt; 2 W bij 900 nm) </td></tr><tr><td> Achromatische lens f = 30 mm </td><td> Thor laboratoria </td><td> AC254-030-B </td><td> Anti-reflectie (AR) coating voor 650-1.050 nm </td></tr><tr><td> Achromatische lens f = 100 mm </td><td> Thor laboratoria </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> lens f = 75 mm </td><td> Thor laboratoria </td><td> LA1608-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> lens f = 175 mm</td><td> Thor laboratoria </td><td> LA1229-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Achromatische lens f = 300 mm </td><td> Thor laboratoria </td><td> AC254-300-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Achromatische lens f = 100 mm </td><td> Thor laboratoria </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Achromatische lens f = 100 mm </td><td> Thor laboratoria </td><td> AC254-100-B </td><td> AR 650-1050 nm </td></tr><tr><td> Acousto-optische deflectoren </td><td> Intraaction Corp </td><td> ATD 6510CD2 </td><td></td></tr><tr><td> Reflecterende diffraktieraster </td><td> Newport </td><td> 53-011R </td><td> 100 groeven / mm voor gedelegeerd ordonnateur met 65 MHz bandbreedte en scan hoek van 45 mrad </td></tr><tr><td> 21,6 mm Brewster prisma </td><td> Lambda Research Optics Inc </td><td> IBP21.6SF10 </td><td></td></tr><tr><td> Gekleurd Glas </td><td> Schott </td&gt; <td> BG-39 </td><td></td></tr><tr><td> Dichroïsche spiegel </td><td> Chroma Technology Corp </td><td> Z532RDC </td><td></td></tr><tr><td> Fotomultiplicator modules </td><td> Hamamatsu </td><td> H9305-03 </td><td></td></tr><tr><td> DAC-ADC board </td><td> National Instruments </td><td> PCI-6115 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 Bapta-1 AM </td><td> Invitrogen </td><td> O-6807 </td><td></td></tr></tbody></table>

optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signalering van informatie in de gewervelde centrale zenuwstelsel wordt vaak gedragen door populaties van neuronen in plaats van individuele neuronen. Ook de verspreiding van suprathreshold spiking activiteit betrekking populaties van neuronen. Empirische studies over corticale functie direct vereist dus opnamen van populaties van neuronen met een hoge resolutie. Hier beschrijven we een optische methode en deconvolutie algoritme neurale activiteit opnemen tot 100 neuronen met single-cell en single-spike resolutie. Deze methode berust op detectie van de tijdelijke toename in intracellulaire calciumconcentratie somatische verbonden suprathreshold elektrische pieken (actiepotentialen) in corticale neuronen. Hoge tijdsresolutie van het optische opname wordt bereikt door een snelle willekeurige toegang scantechniek gebruik acousto-optische deflectoren (gedelegeerd ordonnateur) 1. Twee-fotonexcitatie van de calcium-gevoelige kleurstof resulteert in hoge ruimtelijke resolutie in ondoorzichtige hersenen tisaanklagen 2. Reconstructie van spikes van de fluorescentie calcium opnamen wordt bereikt door een maximum-likelihood methode. Gelijktijdig elektrofysiologische en optische opnamen geven aan dat onze methode betrouwbaar spikes (&gt; 97% spike detectie-efficiëntie) detecteert, heeft een laag aantal valse positieve spike detectie (&lt;0,003 spikes / s) en een hoge temporele precisie (ongeveer 3 ms) 3. Deze optische methode spike detectie kan worden gebruikt om neurale activiteit opnemen in vitro en in vivo in dieren verdoofd 3,4.

Inzicht in de functie van de gewervelde centrale zenuwstelsel heeft opnames van vele neuronen omdat corticale functie ontstaat op het niveau van populaties van neuronen. Hier hebben we een optische methode om suprathreshold neurale activiteit op te nemen met single-cell en single-spike resolutie te beschrijven, dithered random-access scanning. Deze methode neemt somatische fluorescentie calcium signalen van tot 100 neuronen met een hoge temporele resolutie. Een maximum-likelihood-algoritme deconvolves de onderliggende suprathreshold neurale activiteit van de somatische fluorescentie calcium signalen. Deze methode detecteert betrouwbaar spikes met een hoge detectie-efficiëntie en een laag aantal valse meldingen en kan worden gebruikt om neurale populaties te bestuderen<em&gt; In vitro</em&gt; En<em&gt; In vivo</em&gt;.

Optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie

De overdracht van informatie in het centrale zenuwstelsel van gewervelde dieren wordt vaak uitgevoerd door populaties neuronen in plaats van door individuele neuronen. Daarnaast ...

Het algemene doel van het FollowMe-experiment is om neurale spiking-activiteit van een groot aantal neuronen vast te leggen. Dit wordt in de eerste stap bereikt door met fluorescentiemicroscopie de toename van de intracellulaire calciumconcentratie in een neuronen-soma te observeren, die geassocieerd is met elk actiepotentiaal. Twee-foton excitatie en een random access scanning-principe worden gebruikt om calciumfluorescentiesignalen van 40 neuronen-soma's vast te leggen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.In de tweede stap worden de precieze timingen van de spikes geëxtraheerd uit de fluorescentiesignalen met behulp van een deconvolutie-algoritme. Deze techniek kan worden gebruikt om de spiking-activiteit van tientallen neuronen vast te leggen. De spiking-gegevens kunnen vervolgens worden gebruikt om onderlinge informatie, signaalvoortplanting tussen neuronale populaties of neuronale correlaties te meten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals registraties met micro-elektroden, is dat de spiking-activiteit van een groot aantal neuronen uit een lokale populatie kan worden geregistreerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de corticale functie op het niveau van lokale neuronale netwerken, zoals het belang van correlaties bij het zoeken naar informatie en veranderingen in de netwerkdynamiek bij corticale plasticiteit. Voor tweefoton-excitatie wordt een infrarood pulslasersysteem met femtoseconde-pulsen gebruikt. Een hoog laseruitgangsvermogen is vereist om de grote verliezen te compenseren die worden veroorzaakt door de optische componenten van het systeem.Een precompensatiesysteem bestaande uit twee prisma's brengt een negatieve groepssnelheidsdispersie aan op de laserpulsen vóór de optische deflectoren om de temporele dispersie te compenseren die door de AOD's wordt geïntroduceerd. Twee AOD's met grote aperturen deflecteren de laserstraal in twee dimensies. Een reflecterend diffractierooster met 100 groeven per millimeter is 13 centimeter achter de AOD's geplaatst om de ruimtelijke dispersie te compenseren die door de AOD's wordt geïntroduceerd. Bij het gebruik van korte laserpulsen wordt de laserstraal via twee relaistelescopen naar de cameraport van een rechtopstaande microscoop geleid.Irissen zijn op regelmatige afstanden geplaatst voor de uitlijning van de optische componenten. Een dichroïsche beamsplitter voor de objectief laat het infrarode excitatielicht door naar het preparaat en reflecteert het fluorescentielicht van het preparaat naar een detector. Epi- en transfluorescentiedetectoren vangen het fluorescentiesignaal op via het objectief, waarbij gekleurde glasfilters in de condensor voor de detectoren zijn geplaatst om te voorkomen dat excitatielicht de detectoren bereikt.De afbuigingshoeken van A OD worden aangestuurd door een computer die is uitgerust met een digitaal-analoge converterkaart, die op zijn beurt spanningsgestuurde oscillatoren aanstuurt. Het signaal van de fotovermenigvuldigers wordt doorgegeven via een laagdoorlaat Butterworth-filter met een afsnijfrequentie van 100 kilohertz en wordt gedigitaliseerd door een analoog-digitaal converter met een kloksnelheid van 156,25 kilohertz voordat het op een computer wordt opgeslagen voor analyse; uitlijning en elektrische ruis worden getest door de verdeling van fluorescentiesignalen op te nemen met en zonder laserlicht bij een lage en hoge versterking van de fotovermenigvuldigers, alsmede met en zonder indicator. Dithered random access scanning is gebaseerd op de detectie van intracellulaire calciumstijgingen. De eerste stap in het protocol is het kleuren van een groot aantal neuronen met de estervorm van een calciumindicator via bolusinjectie.Registreer vervolgens de activiteit van het soma bij elk neuron op vier locaties gedurende 6,4 microseconden per locatie. Om de gewenste neuronen te selecteren, wordt er een volledig frame van 256 bij 256 pixels vastgelegd. Selecteer daarna handmatig de centra van de neuronen die in dit beeld moeten worden geregistreerd.In elke cyclus worden door de aansturingssoftware automatisch drie punten op een afstand van twee micron rond elk centrum toegevoegd. Het fluorescentiesignaal wordt geregistreerd vanaf de vier locaties in alle 40 neuronen. De registratie van alle neuronen in één cyclus vereist 1,536 milliseconden.Herhaal deze sequentiële opname van alle 40 neuronen gedurende vijf seconden. Spike-detectie op basis van fluorescente somatische calciumsignalen is afhankelijk van een hoge signaal-ruisverhouding. Een hoge signaal-ruisverhouding kan worden bereikt door de excitatie-intensiteit te verhogen.De excitatie-intensiteit kan echter slechts tot een bepaalde limiet worden verhoogd vanwege fotobeschadiging. Er is slechts een zeer klein venster van excitatie-intensiteit waarbij de fotobeschadiging gering is en de signaal-ruisverhouding voldoende is om individuele spikes te detecteren, om zo te waarborgen dat de geregistreerde signalen binnen het venster voor een hoge spikedetectie vallen. Tijdens een experiment wordt gebruikgemaakt van een aantal online analyse-softwareprogramma's die door ons laboratorium zijn ontwikkeld.Bereken vervolgens de geschatte fotonensnelheid per neuron over een kort tijdsinterval van basislijnruis van ongeveer 100 tot 200 milliseconden. Het aantal fotonen en de fotonensnelheid worden berekend uit de fluorescentiewaarden door de distributie van relatieve fluorescentieveranderingen met deze vergelijking te fitten; bereken vervolgens de basislijnfluorescentie over hetzelfde tijdsinterval en zet deze uit als functie van de tijd of de trials. Houd de gemiddelde afname van de basislijn onder de 0,0002 per seconde door het laservermogen aan te passen.Omdat de detectie van spikes snel afneemt wanneer deze limiet wordt overschreden. Verifieer daarna elke 10 tot 20 minuten de posities van de neuronale soma door een volledig frame-beeld op te nemen. Pas de registratielocaties aan indien nodig.De fluorescerende signalen die voortkomen uit neurale activiteit lopen vaak in de tijd achter vanwege de lange afname van de calciumtransiënten. In deze procedure wordt een deconvolutiemethode gebruikt om spikes en de timing van spikes uit de fluorescerende signalen af te leiden. Hier gebruiken we een genetisch algoritme om het meest waarschijnlijke model van de spike-trein te bepalen dat past bij het geregistreerde fluorescerende signaal.Bij elke iteratie van het algoritme nadert de maximum likelihood asymptotisch het maximum dat wordt bepaald door de ruis van de fluorescentieopnames. In inhomogene populaties neuronen kan het door actiepotentialen opgewekte calciumsignaal variëren tussen neuronen. Voor ongesuperviseerde analyse van grote datasets hebben we een algoritme ontworpen dat rekening houdt met de variatie van het door actiepotentialen opgewekte calciumsignaal van neuron tot neuron om een groot aantal fout-positieve detecties te voorkomen.De gezamenlijke verdeling van de amplitude en de tijdconstante van het verval van calciumtransiënten opgewekt door enkele spikes is vastgelegd in een aparte reeks experimenten met hetzelfde type neuronen onder dezelfde experimentele omstandigheden. Om rekening te houden met langzame baseline-veranderingen en om de computationele kosten van de deconvolutie te verlagen, worden langere opnames voor elk neuron in elke opname verdeeld in verschillende kortere traces van één tot vijf seconden. Het deconvolutie-algoritme kan een groot aantal modellen testen, tot wel 1 miljoen verschillende modellen of meer; om de deconvolutie te versnellen, wordt één experiment parallel op maximaal 10 verschillende computers gedeconvolueerd.Na deconvolution worden de spike-gegevens geanalyseerd en geïnspecteerd. De spike-waarschijnlijkheid van het peri-stimulus tijdshistogram en de vuursnelheid van het neuron worden op geautomatiseerde wijze berekend. Hier zijn voorbeelden van een fluorescentiesignaal geregistreerd bij een zeer lage excitatiegraad en een ander bij een zeer hoge excitatiegraad binnen het detectievenster.Let op dat elk voorbeeld de respons op één spike laat zien. Hier wordt een fotomicrograaf van een acute hersensnijde getoond, samen met twee stimulatiepipetten die in dezelfde corticale kolom zijn geplaatst. In laag vier worden de neurale responsen voor de repetitieve stimuli getoond, en deze grafiek geeft de onderlinge informatie van Shannon weer, gesignaleerd door de geregistreerde populatie neuronen.Hier is de meting van de voortplanting van superdrempelige spiking-activiteit tussen verschillende populaties corticale neuronen. Dit zijn de gedetecteerde spikes in corticale neuronen als reactie op elektrische stimulatie van thalame corticale vezels. Bij het registreren van neuronale activiteit met behulp van random access scanning is het zeer belangrijk om binnen het detectievenster te registreren.Anders is de kans groot dat men eindigt met onbruikbare datasets. Optische spike-detectie staat nog in de kinderschoenen. Er is nog veel ruimte voor verbetering.Met enkele verbeteringen kunnen we vanuit nog meer neuronen registreren. Met andere verbeteringen zullen we zelfs in staat zijn om registraties uit te voeren bij wakker wordende en bewegende dieren.

optical-recording-suprathreshold-neural-activity-with-single-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Retinale ganglion cellen fungeren visuele informatie van het oog naar de hersenen met sequenties van actiepotentialen. Hier laten we zien hoe de actie mogelijkheden van enkele ganglioncellen...

Single-unit In vivo Opnamen van de Optic chiasma van de Rat

We beschrijven methoden voor grootschalige opname van meerdere afzonderlijke eenheden en lokale veld potentieel in zich gedragen knaagdieren met siliconen sondes. Drive fabricage, sonde gehechtheid aan het station en de sonde implanteren worden geïllustreerd in voldoende details voor het gemakkelijk reproduceren.

Grootschalige Opname van Neuronen door Movable Silicon Probes in Behaving Knaagdieren

Een beeldvormende techniek voor de monitoring van membraanpotentiaal verandert met sub-micrometer ruimtelijke en minder dan een milliseconde tijdsresolutie wordt beschreven. De techniek is gebaseerd op laser-excitatie van voltage-sensitieve kleurstoffen, maakt metingen van signalen in de axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines.

Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

This video demonstrates the recording of electrical signals from single brain neurons using a fine-tipped glass micropipette and a specialized setup. The micropipette is carefully inserted into the rat's brain and is buzzed to penetrate the neuron to record internal neuronal electrical signals.

In Vivo Recording of Intracellular Signals from a Single Neuron

This video demonstrates a procedure for observing changes in neuronal activity in a brain slice stained with a voltage-sensitive dye. The dye reflects changes in the neuron's membrane potential by altering its fluorescence intensity. Through the application of electrical stimuli and advanced imaging techniques, this process enables visual tracking of real-time changes in neuronal membrane potential based on VSD fluorescence.

Optical Recording of Neuronal Activity in Brain Slices Stained with a Voltage-Sensitive Dye

This video outlines a method for simultaneously imaging and recording electrical activity from transgenic brain slices that contain neuron-specific fluorescent proteins. The procedure involves maintaining the brain slice in a perfusion chamber with aerated artificial cerebrospinal fluid, using a light source to excite fluorescent-labeled cells, and recording the electrical signals with a multichannel probe and patch clamp.

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

Het leren van nieuwe stimulus-respons associaties aangrijpt diverse neurale processen die uiteindelijk terug in veranderen piek aan afzonderlijke neuronen. Hier beschrijven we een gedrags-protocol waardoor de continue registratie van de single-neuron activiteit terwijl dieren verwerven, doven, en opnieuw op te pakken een geconditioneerde respons binnen een enkele experimentele sessie.

Opnemen Single Neuronen &#39;actiepotentialen van vrij bewegende Duiven over drie stadia van het leerproces

Hier beschrijven we onze strategie voor het verkrijgen van stabiele, goed geïsoleerde single-unit opnamen van geïdentificeerde remmende interneuronen in de geanesthetiseerde muiscortex. Neuronen die ChR2 tot expressie brengen, worden geïdentificeerd door hun reactie op blauw licht. De methode maakt gebruik van standaard extracellulair opname-apparatuur en dient als een goedkope alternatief voor calcium-beeldvorming of visueel geleid patchen.

Een gids voor In vivo Single-unit Opnemen van Optogenetically Identified Cortical Remmende Interneurons

We introduceren een reproduceerbare en stabiele optische opnamemethode voor hersen schijfjes met spannings gevoelige kleurstof. Het artikel beschrijft spanning-gevoelige kleurstof beitsen en het opnemen van optische signalen met behulp van conventionele hippocampale slice preparaten.

Wide-veld single-foton optische opname in de hersenen schijfjes met behulp van spanning-gevoelige kleurstof

Dit protocol presenteert een methode voor het weergeven van neuronale populatieactiviteit met eencellige resolutie bij niet-transgene ongewervelde soorten met behulp van absorptiespanningsgevoelige kleurstoffen en een fotodiode array. Deze aanpak maakt een snelle workflow mogelijk, waarbij beeldvorming en analyse in één dag kunnen worden nagestreefd.

Op fotodiode gebaseerde optische beeldvorming voor het opnemen van netwerkdynamica met single-neuronresolutie in niet-transgene ongewervelde dieren

Ontdek een optische methode voor het registreren van neurale spikingactiviteit met hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Deze techniek gebruikt fluorescentiemicroscopie met twee-fotonexcitatie en een deconvolutiealgoritme om spike-tijdstippen te extraheren.

Optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie

Meer video's verkennen