Optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie
5 september 2012
Inzicht in de functie van de gewervelde centrale zenuwstelsel heeft opnames van vele neuronen omdat corticale functie ontstaat op het niveau van populaties van neuronen. Hier hebben we een optische methode om suprathreshold neurale activiteit op te nemen met single-cell en single-spike resolutie te beschrijven, dithered random-access scanning. Deze methode neemt somatische fluorescentie calcium signalen van tot 100 neuronen met een hoge temporele resolutie. Een maximum-likelihood-algoritme deconvolves de onderliggende su
Het algemene doel van het FollowMe-experiment is om neurale spikes te registreren vanuit een groot aantal neuronen. Dit wordt bereikt door in de eerste stap de toename in intracellulaire calciumconcentratie in een neuron soma te observeren die geassocieerd is met elke actiepotentiaal met behulp van fluorescentiemicroscopie. Twee-fotonexcitatie en een willekeurig toegankelijk scanprincipe worden gebruikt om calciumfluorescentiesignalen van 40 neuron somato met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie op te nemen.
In de tweede stap worden de precieze spikestimings uit de fluorescentiesignalen gehaald met behulp van een deconvolutie-algoritme. Deze techniek kan worden gebruikt om spikesactiviteit van tientallen neuronen op te nemen. De spikesdata kunnen vervolgens worden gebruikt om wederzijdse informatie, signaalpropagatie tussen neuronale populaties of neurocorrelaties te meten.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals micro-elektrode-opnamen is dat men de neuronspikesactiviteit kan opnemen vanuit een groot aantal neuronen van een lokale populatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over corticale functie op het niveau van lokale netwerken van neuronen, zoals de belangrijkheid van correlatie bij het zoeken naar informatie en veranderingen in netwerkdynamica met cortico-plasticiteit Voor twee-fotonexcitatie wordt een infraroodpulslasersysteem met femtosecondepulsen gebruikt. Een hoge laseruitgangskracht is vereist om de grote verliezen te compenseren die worden geïntroduceerd door de optische componenten van het systeem.
Een prediker per systeem, bestaande uit twee prisma's, brengt een negatieve groepssnelheidsdispersie aan op de laserpulsen voorafgaand aan de custom optische deflecteurs om de temporele dispersie te compenseren die wordt geïntroduceerd door de AODs. Twee AODs met grote openingen buigen de laserstraal in twee dimensies af. Een reflecterende diffractiegradiënt met 100 groeven per millimeter wordt 13 centimeter achter de AODs geplaatst om de ruimtelijke dispersie die door de AODs wordt geïntroduceerd te compenseren. Bij gebruik van korte laserpulsen wordt de laserstraal met twee relaistelescopen in de camerapoort van een rechtopstaande microscoop geleid.
Irisjes worden op regelmatige intervallen geplaatst voor de uitlijning van de optische componenten. Een dichroische straalparer voor de objectief zendt het infrarood excitatielicht naar het preparaat en reflecteert het fluorescentielicht van het preparaat naar een detector. Epi en trans fluorescentiedetectoren verzamelen het fluorescentie signaal door het objectief en de gekleurde glazen filters worden voor de detectoren geplaatst om te voorkomen dat excitatielicht de detectoren bereikt.
De A OD afbuigingshoeken worden bestuurd door een computer uitgerust met een digitaal analoog converterboard, die op zijn beurt spanningsgestuurde oscillatoren aanstuurt. Het signaal van de fotomultipliers wordt door een laagdoorlaat Butterworth-filter met een snijvrequeqntie van 100 kilohertz gerapporteerd en wordt gedigitaliseerd door een analoog digitaal converter bij een kloksnelheid van 156,25 kilohertz voordat het wordt opgeslagen op een computer voor analyse, uitlijning en elektrische ruis worden getest door de verdeling van fluorescentiesignalen op te nemen met en zonder laserlicht bij lage en hoge versterking van de fotomultipliers, evenals met en zonder indicator. Willekeurig toegankelijk scannen berust op de detectie van intracellulaire toenames van calcium. De eerste stap in het protocol is om een groot aantal neuronen te kleuren met de Esther-vorm van een calciumindicator door bolusinjectie.
Vervolgens registreer de activiteit van het soma bij elke neuron op vier locaties gedurende 6,4 microseconden op elke locatie. Om de interessante neuronen te selecteren, verwerft u een volledig frame bestaande uit 256 bij 256 pixels. Selecteer vervolgens handmatig de centra van de neuronen die binnen dit beeld moeten worden opgenomen.
Drie punten op twee micron afstand rond elk centrum worden automatisch toegevoegd door de besturingssoftware in elke cyclus. Fluorescent signaal wordt geregistreerd van de vier locaties in alle 40 neuronen. Opnemen van alle neuronen in één cyclus vereist 1,536 milliseconden.
Herhaal deze sequentiële opname van alle 40 neuronen gedurende vijf seconden. Spike detectie vanuit fluorescente somatische calcium signalen is afhankelijk van een hoog signaal-ruisverhouding. Een hoog signaal-ruisverhouding kan worden bereikt door de excitatie-intensiteit te verhogen.
Echter, de excitatie-intensiteit kan alleen tot een bepaalde limiet worden verhoogd vanwege fotobeschadiging. Er is slechts een zeer klein venster van excitatie-intensiteit waarbij fotobeschadiging laag is en het signaal-ruisverhouding voldoende is om enkele spikes te detecteren om ervoor te zorgen dat de opgenomen signalen binnen het venster van hoge spike detectie vallen. Tijdens een experiment worden een aantal online analysesoftwares gebruikt die door ons lab zijn ontwikkeld.
Bereken vervolgens de geschatte foton snelheid per neuron uit een korte tijdsvenster van baseline ruis van ongeveer 100 tot 200 milliseconden. Het aantal fotonen en de fotonsnelheid worden berekend uit de fluorescentiewaarden door de verdeling van relatieve fluorescentie veranderingen te passen met deze vergelijking, bereken vervolgens de baseline fluorescentie uit hetzelfde tijdsvenster en plot het als functie van tijd of proeven. Houd het gemiddelde verval van de baseline onder 0,0002 per seconde door de laservermogen aan te passen.
Omdat spike detectie snel afneemt wanneer deze limiet wordt overschreden. Controleer daarna de neuron somatische posities elke 10 tot 20 minuten door een volledig frame beeld te verkrijgen. Pas de opnamelocaties indien nodig aan.
De fluorescente signalen die het gevolg zijn van neurale activiteit zijn vaak in tijd vanwege de lange verval van calciumtransient. In deze procedure wordt een deconvolutiemethode gebruikt om spikes en spiketimings uit de fluorescente signalen te halen. Hier gebruiken we een genetisch algoritme om het meest waarschijnlijke spike treinmodel te bepalen dat past bij het opgenomen fluorescentiesignaal.
Met elke iteratie van het algoritme nadert de maximale waarschijnlijkheid asymptotisch zijn maximum dat wordt gegeven door de ruis van de fluorescentieopnamen. In de homogene populaties van neuronen kan het spike-geïnduceerde calciumsignaal variëren tussen neuronen. Voor onbeheerde analyse van grote datasets hebben we een algoritme ontworpen dat rekening houdt met de variatie van het spike-geïnduceerde
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een optische methode voor het registreren van neurale spiking-activiteit van meerdere neuronen met behulp van fluorescentiemicroscopie. De techniek maakt een hoge temporele en spatiale resolutie mogelijk bij het detecteren van calciumsignalen die geassocieerd zijn met actiepotentialen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Neuroimaging
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de dynamiek van neurale populaties is cruciaal voor de neurowetenschap.
- Calciumsignalen in neuronen correleren met actiepotentialen.
- Traditionele methoden leggen de activiteit van grote populaties neuronen mogelijk niet effectief vast.
- Fluorescentiemicroscopie biedt een niet-invasieve manier om neuronale activiteit te monitoren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode om spike-activiteit van een groot aantal neuronen te registreren.
- Het bereiken van een hoge temporele resolutie bij het detecteren van neurale activiteit.
- Het mogelijk maken van de analyse van neurale populatiedynamiek in vitro en in vivo.
Gebruikte methoden
- Fluorescentiemicroscopie om de intracellulaire calciumconcentratie te observeren.
- Tweefoton-excitatie voor beeldvorming met een hoge resolutie.
- Dithered random-access scanning om signalen van meerdere neuronen te registreren.
- Een deconvolutie-algoritme om precieze spike-timing uit fluorescentiesignalen te extraheren.
Belangrijkste resultaten
- De methode kan calciumsignalen van maximaal 100 neuronen registreren.
- Er werd een hoge detectie-efficiëntie en een laag aantal fout-positieve resultaten bereikt.
- Spiking-gegevens kunnen worden gebruikt om wederzijdse informatie en signaalvoortplanting te meten.
- Deze techniek is toepasbaar voor het bestuderen van neurale populaties in diverse settings.
Conclusies
- De ontwikkelde methode verbetert het vermogen om neurale activiteit in grote populaties te bestuderen.
- Het biedt een betrouwbare manier om spikes met een hoge nauwkeurigheid te detecteren.
- Deze aanpak kan verder onderzoek naar neurale dynamiek en interacties faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het registreren van supradrempelige neurale activiteit met resolutie op single-cell- en single-spike-niveau maakt mechanische risicoreductie bij targetvalidatie mogelijk door de functionele connectiviteit in corticale netwerken te verduidelijken. Deze benadering vergroot het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door signaalpropagatie en wederzijdse informatie tussen neuronale populaties te kwantificeren. De schaalbaarheid van de methode tot wel 100 neuronen maakt deze geschikt voor vroege discovery-workflows die read-outs op populatieniveau vereisen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door het in kaart brengen van door spikes opgewekte calciumtransiënten over lokale neuronale netwerken.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door hooggetrouwe detectie van supradrempelige spiking-activiteit (>97% efficiëntie, <0,003 fout-positieven/sec).
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door het kwantificeren van neurale correlaties en informatiesignalering in ziekterelevante systemen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows via spike-timingextractie met behulp van maximum-likelihood deconvolutie.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid van de assay door een hoge temporele precisie (~3 msec) en een lage baseline-drift (<0,0002/sec).
- Schaalbaarheid: Ondersteunt screening-gereedheid met random-access scanning van 40 neuronen per cyclus, uitbreidbaar tot 100 neuronen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt ontdekking met preklinische validatie door de propagatie van supradrempelwaarde spikes tussen corticale populaties te meten.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door spike-detectie te koppelen aan wederzijdse informatie en metrieken voor signaalpropagatie.
- Ziekterelevantie: Toepasbaar op in vitro en geanestheseerde in vivo modellen, wat de continuïteit over verschillende experimentele systemen ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot leadidentificatie, door neurale activiteitsmetingen op populatieniveau te leveren die bijdragen aan het mechanistische begrip.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door de spiking-activiteit van tientallen neuronen in lokale netwerken vast te leggen.
- Screening: Maakt assays gereed voor gebruik via kwantitatieve fluorescentiesignalen die zijn geëxtraheerd uit calciumtransiënten met een hoge signaal-ruisverhouding.
- Analytics: Maakt het vergelijken van condities mogelijk via geautomatiseerde peri-stimulus tijdhistogrammen, spike-waarschijnlijkheid en berekeningen van de vuursnelheid.
- Translationeel onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door de signaalvoortplanting tussen neuronale populaties te meten, een belangrijke biomarker voor netwerkfuncties.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Fungeert als een herbruikbare mogelijkheid voor longitudinale studies naar netwerkdynamiek onder farmacologische of genetische perturbatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door mechanische ambiguïteit in neurale populatiedynamiek te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en schaalbaarheid via computergestuurde AOD-scanning en geparalleliseerde deconvolutie over meerdere systemen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door kwantitatieve beoordeling van neurale correlaties en informatiestroom mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door middel van reproduceerbare spiking-data met hoge resolutie uit lokale corticale netwerken.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in tweefotonenmicroscopie, calcium-imaging en deoptimalisatie van deconvolutiealgoritmen.
- Is afhankelijk van infraroodpuls lasersystemen, acousto-optische deflectoren en infrastructuur voor snelle analoog-digitaalconversie.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor baseline fluorescentiemonitoren en het online behoud van de signaal-ruisverhouding.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij de overgang van in vitro coupes naar geanestheseerde in vivo preparaten.
- Wordt beperkt door drempelwaarden voor fotoconsumptie die de excitatie-intensiteit en daarmee de gevoeligheid van de spike-detectie beperken.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Optical Setup
3:18
Cell Staining and Recording
4:18
Online Software Tools to Maximize Spike Detection Efficiency
5:44
Reconstruction of Spike Timings from Fluorescence Signals
7:26
Results: Studying the Cortical Function Using Dithered Random-Access Scanning
8:12
Conclusion
