Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

Het algemene doel van het volgende experiment is om de neuronale activiteit van de muis in beeld te brengen met mangaan-versterkte MRI. Dit gebeurt door eenzijdige stimulatie van de vibrissae en het in kaart brengen van de neuronale respons in de contralaterale barrel field cortex. De eerste stap is het assembleren en kalibreren van het ultrasoonsysteem, dat voor het experiment bestaat uit een ongefocuste ultrasone transducer die wordt aangestuurd door een signaalgenerator en versterker.

Na een intraperitoneale injectie van mangaan wordt de bloed-hersenbarrière geopend met echografie en microbellen, waardoor het mangaan het hersenparenchym kan binnendringen. Vervolgens wordt de muis onderworpen aan een paradigma voor neuronale stimulatie, wat resulteert in een hogere accumulatie van mangaan in de actievere regio's van de hersenen. Ten slotte worden MRI-beelden verkregen die regionale verschillen in de intensiteit van T1-gewogen MR-beelden laten zien, gebaseerd op verschillende niveaus van mangaanaccumulatie in de hersenen.

In de neurowetenschappen is de muis het dominante modelsysteem voor het bestuderen van de genetische en moleculaire basis van hersenontwikkeling en hersenziekten. Deze techniek biedt een niet-invasief instrument voor het in kaart brengen van neurale activiteit in deze muismodellen. Ultrasone disruptie van de bloed-hersenbarrière kan niet alleen worden gebruikt om mangaan in het hersenparenchym te brengen voor functionele neuro-imaging, maar kan ook worden ingezet om een breed scala aan andere verbindingen in het hersenparenchym af te leveren, waaronder gadoliniumhoudende contrastmiddelen of chemotherapeutica.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het kalibreren van het echosysteem en het hanteren van de microrubels. De procedure zal worden gedemonstreerd aan elk van de technici in ons laboratorium. Het echosysteem bestaat uit een enkel-element echotransducer met een diameter die groot genoeg is om de muizenhersenen te bestrijken en een centerfrequentie in het bereik van twee megahertz.

De transducer wordt aangestuurd door een signaalgenerator en een vermogensversterker van 50 decibel, waarmee de ultrasone pulsserie werd gegenereerd. Kalibreer het ultrasone systeem in een waterbad. Plaats de hydrofoon op de bodem van het bad en positioneer de transducer erboven met een translationstage met drie assen.

Breng vervolgens een korte reeks sinusvormige pulsen aan op de transducer en stel de tafel zo in dat de maximale respons wordt gevonden, welke zich in het centrum van de ultrasone bundel en de natuurlijke focus van de transducer moet bevinden. Voer daarna verschillende metingen van de akoestische druk uit over een reeks ingangsspanningen en gebruik een lineaire regressie om de relatie tussen de ingangsspanning en de akoestische druk te schatten. Bepaal de pulsamplitude om een maximale negatieve akoestische druk van ongeveer 0,36 megapascals te genereren.

Anestheseer in deze stap het dier door isofluraan via de neuskegel toe te dienen. De neuskegelapparatuur moet de kop van het dier telkens nauwkeurig en betrouwbaar in dezelfde positie fixeren; ons apparaat houdt de kop tijdens het experiment in een vlakke schedelpositie. Gebruik een pneumatisch kussen om de ademhalingsfrequentie te bewaken en doseer het anestheticum om een ademhalingsfrequentie tussen 85 en 125 ademhalingen per minuut te handhaven. Bewaak tegelijkertijd de lichaamstemperatuur van het dier met een rectale probe en handhaaf de lichaamstemperatuur met behulp van een warmtelamp of warme lucht.

Plaats daarna een staartvenecatheter en een intraperitoneale catheter bij het dier. De volgende stap is het trimmen van de haren om unilaterale stimulatie van de VII aan te tonen en de neuronale respons in de contralaterale barrel field cortex in kaart te brengen. Knip de contralaterale VII zo dicht mogelijk bij het huidoppervlak door, zonder het follicle of de omringende huid te irriteren.

Plaats het dier vervolgens in het echografie-systeem en breng de echogel aan op de schedel; plaats daarna het dunne plastic vel met een waterkolom op de kop. Gebruik een wattenstaafje in de waterkolom om eventuele luchtbellen die in de echogel gevangen zitten te verwijderen. Positioneer vervolgens de echotransducer in het water op de natuurlijke brandpuntsafstand direct boven de hersenen van de muis en veeg met uw vinger over de transducer om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen.

Produce vervolgens de perrin-lipidemicrosferen door het vial gedurende 45 seconden in de agitator te schudden tijdens het werken. Laat het vial op kamertemperatuur staan, maar bewaar het in de koelkast na het laatste gebruik van de dag tot het eerste gebruik. Agiteer op volgende dagen het bewaarde vial opnieuw in de agitator.

Inject vervolgens 0,5 millimol per kilogram mangaanchloride intraperitoneaal en wacht 10 minuten om de distributie ervan mogelijk te maken. Schud daarna het vial met microbellen één minuut lang met de hand om de microsferen opnieuw te suspenderen. Trek vervolgens 30 µL plus het dode volume van de katheter op.

Zorg ervoor dat er geen lucht in het vial wordt geïnjecteerd, omdat dit de resterende microbellen zal afbreken. Start direct de ultrasone pulsserie en injecteer de microsferen via de staartveneutcatheter met minimale vertraging. Ga door met de sonicatie gedurende drie minuten.

Zet vervolgens het ultrasone systeem uit. Nadat het mangaangehalte in de hersenen ongeveer 40 minuten lang is gestabiliseerd, schakelt u de isofluoraan uit en verwijdert u de neuskegel. Begin op dit punt met het neuronale stimulatieparadigma om de barrel veld cortex in kaart te brengen.

Beweeg een penseel in een cirkelvormige beweging met een frequentie van ongeveer één tot vijf hertz door de contralaterale vibra-array gedurende 90 minuten. Hervat de anesthesie na de stimulatie, handhaaf vervolgens de lichaamstemperatuur en titreer het isofluoraneniveau tot een ademhalingsfrequentie van 85 tot 125 ademhalingen per minuut. Plaats de muis vervolgens in een MRI-spoel en breng deze over naar het MRI-systeem.

Verwerf vervolgens de hoge-resolutie 3D T1-gewogen beelden zoals hier getoond. Verstoring van de bloed-hersenbarrière na toediening van een T1-verkortend contrastmiddel, zoals mangaan of een gadoliniumhoudend middel, resulteert in een signaaltoename in het hersenparenchym op T1-gewogen beelden in vergelijking met de hersenen waarin BOMA niet is uitgevoerd. Hier staan de neuronale activiteitskaarten in de eerste kolom, gegenereerd door unilaterale stimulatie van de risi bij zeven dieren.

Differentiekaarten op twee verschillende locaties tonen een verhoogd MRI-signaal contralateraal aan de door brissy gestimuleerde zijde. In de tweede kolom geven p-waarde kaarten de relatieve significantie van deze verschillen aan. In de derde kolom laten de overeenkomstige diagrammen van de hersenatlas zien dat deze actieve regio's overeenkomen met het barrelveld van de primaire sensorische cortex.

Met oefening kan deze techniek in ongeveer twee uur worden uitgevoerd, exclusief de duur van de simulatie. Bij het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om te onthouden dat het flacon met microbellen vóór injectie moet worden geschud en dat er zorgvuldig moet worden gewerkt om te voorkomen dat er lucht in de flacon wordt geïnjecteerd. Daarnaast is het van belang om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen ingesloten raken in de echogel of onder de echotransducer.

Voor deze demonstratie hebben we ervoor gekozen om de snorharen te stimuleren, maar deze techniek kan duidelijk worden aangepast om elke stimulus van belang te bestuderen. Na de procedure kan het dier volledig herstellen, wat longitudinale studies mogelijk maakt.