Name: Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer neuroblastmigratie bestuderen in acute schijfjes van de volwassen muizen voorhersenen met time-lapse fluorescentiebeeldvorming. Deze methode onthult dynamiek van neuronale voorlopercellen en migratiefasen voor inzicht in neurale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Canadese Institutes of Health Research (CIHR) subsidie ​​ASJK werd gedeeltelijk ondersteund door een Universite Laval gemeenschap. AS is de ontvanger van een Canada Research Chair in postnatale neurogenese.

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Kaneko, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li>
<li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+neuronal+migration+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li>
<li>Snapyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
<li>Lledo, P. M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+new+neurons+into+the+adult+olfactory+bulb%3A+joining+the+network%2C+life-death+decisions%2C+and+the+effects+of+sensory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience.</a> Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).</li>
<li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+release+and+uptake+regulate+neuronal+precursor+migration+in+the+postnatal+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li>
<li>Martini, F. J., Valdeolmillos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+contraction+at+the+cell+rear+drives+nuclear+translocation+in+migrating+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons.</a> J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).</li>
<li>Murase, S., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li>
<li>Bovetti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+scaffold+for+neuroblast+migration+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Nam, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+subventricular+zone+stem+and+progenitor+cells+are+sessile+and+epidermal+growth+factor+receptor+negatively+regulates+neuroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration.</a> PLoS One. 4, e8122(2009).</li>
<li>Bortone, D., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCC2+expression+promotes+the+termination+of+cortical+interneuron+migration+in+a+voltage-sensitive+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner.</a> Neuron. 62, 53-71 (2009).</li>
<li>Comte, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De juiste targeting van neuronale precursors de juiste hersengebieden is een fundamenteel proces achter de juiste assemblage en functie van neurale circuits. De meeste cellen migreren tijdens de embryonale ontwikkeling en de postnatale hersenen slechts enkele regio&#39;s, zoals de OB, dentate gyrus en cerebellum, neuronale verplaatsing nog steeds plaats. De mechanismen orkestreren celmigratie in de postnatale hersenen blijven echter slecht begrepen. Kennis van de mechanismen en moleculaire pathways die betrokken zijn in...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma </td><td> S9378 </td></tr><tr><td> Glucose (ACSF) </td><td> EMD </td><td> DX0145-3 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9625 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> MgCI 2 x6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 xH 2 O </td><td> EMD </td><td> SX0710-1 </td></tr><tr><td> CACI 2 x2H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3881 </td></tr><tr><td> Dextran TexasRed </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Dextran CascadeBlue </td><td> Invitrogen </td><td> D1976 </td></tr><tr><td> Glucose (40X oplossing) </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Natrium pyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D-5025 </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> Neurobasal medium </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> EMD </td><td> 2930 </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Ketamine / Xylazine </td><td> CDMV </td><td> 5230 </td></tr><tr><td> Pasteur pipet </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td></tr><tr><td> 15 ml conische buis </td><td&gt; Sarstedt </td><td> 62.553.205 </td></tr><tr><td> 50 ml conische buis </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.205 </td></tr><tr><td> Glazen capillairen (stereotactische injectie) </td><td> WPI </td><td> 4878 </td></tr><tr><td> Petroleum </td><td> EMD </td><td> PX0045-3 </td></tr><tr><td> Proviodine </td><td> Rougier </td><td> 65655-1370 </td></tr><tr><td> Hechten </td><td> Stoelting </td><td> 50487 </td></tr><tr><td> Anafen </td><td> CDMV </td><td> 11508 </td></tr><tr><td> 20 cc spuit </td><td> VWR </td><td> SS-20L2 </td></tr><tr><td> Petrischaal </td><td> VWR </td><td> 25384-094 </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> Laboratoire Mat </td><td> AP-0108 </td></tr><tr><td> Lijm </td><td> Permabond </td><td> 910 </td></tr><tr><td> 95% O2 / 5% CO2 </td><td> Linde </td><td> 24068835 </td></tr><tr><td> Blade &lt;/ Td&gt; <td> WPI </td><td> 501901 </td></tr><tr><td> Nylon mesh </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0.198 </td></tr><tr><td> Centrifugeer </td><td> Eppendorf </td><td> 5702 000.019 </td></tr><tr><td> Pipetteer trekker </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Nanoliter injector </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td></tr><tr><td> Stereotactische injectie-inrichting </td><td> WPI </td><td> 502900 </td></tr><tr><td> Micro boorsysteem </td><td> WPI </td><td> 501819 </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Thermo Scientific </td><td> 920110 </td></tr><tr><td> Wide-field fluorescentie microscoop </td><td> Olympus </td><td> BX61WIF </td></tr><tr><td> CCD camera </td><td> Lichttechniek </td><td> CS-HQ2-D </td></tr><tr><td> Uiterst stille beeldkamer </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 64-1.487 </td></tr><tr><td> PH-1Series 20-platform verwarming </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 64 tot 0284 </td></tr><tr><td> Verwarming </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344b </td></tr><tr><td> 40X water immersie objectief </td><td> Olympus </td><td> 1-UM587 </td></tr><tr><td> 10X water immersie objectief </td><td> Olympus </td><td> 1-UM583 </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> DG-4/OF </td></tr><tr><td> Metamorph software </td><td> Molecular Devices </td><td> 40000 </td></tr><tr><td> Imaris software </td><td> Bitvlak </td><td> BPI-IM70-F1 </td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging van neuroblast migratie in acute schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Er is een groot aantal cijfers blijkt dat aangeeft dat nieuwe functionele neuronen constitutief zijn gegenereerd op basis van een endogene pool van neurale stamcellen in beperkte gebieden van de volwassen hersenen van zoogdieren. Pasgeboren neuroblasten van de subventriculaire zone (SVZ) migreren langs de rostrale migratie stroom (RMS) naar hun eindbestemming in de bulbus olfactorius (OB) 1. In de RMS, neuroblasten tangentiaal migreren in ketens ensheathed door astrocytische processen met 2,3 bloedvaten als structurele steun en een bron van moleculaire factoren vereist voor migratie 4,5. In de OB, neuroblasten los van de ketens en migreren radiaal in de verschillende bulbaire lagen er te differentiëren in interneuronen en te integreren in het bestaande netwerk 1, 6. In dit manuscript beschrijven we de procedure voor toezicht celmigratie in acute plakken van het knaagdier hersenen. Het gebruik van acute segmenten kan de assessment van celmigratie in de micro-omgeving die nauw lijken op in vivo omstandigheden en in hersengebieden die moeilijk toegankelijk zijn voor in vivo imaging. Bovendien voorkomt lange kweken voorwaarde bij organotypische en celkweken die uiteindelijk kunnen veranderen de migratie-eigenschappen van de cellen. Neuronale voorlopers in acute plakjes kan worden gevisualiseerd met behulp van DIC optiek of fluorescerende eiwitten. Virale labeling van neuronale precursors in de SVZ, neuroblasten enten van reporter muizen in de SVZ van wild-type muizen, en transgene muizen die fluorescent eiwit expressie in neuroblasten zijn geschikte werkwijzen voor het visualiseren neuroblasten en na de migratie. De latere methode echter geen afzonderlijke cellen worden bijgehouden voor lange tijd vanwege de hoge dichtheid van gemerkte cellen. We gebruikten een breed gebied fluorescent rechtop microscoop uitgerust met een CCD camera om een ​​relatief snelle acquisitie interval (een ima verwezenlijkenge elke 15 of 30 sec) om betrouwbaar identificeren stationaire fasen en migratie. Een exacte beschrijving van de duur van de stationaire en trekkende fasen is cruciaal voor de eenduidige interpretatie van de resultaten. We hebben ook uitgevoerd meerdere z-stap overnames om neuroblasten migratie in 3D te volgen. Wide-field fluorescerende beeldvorming is uitgebreid gebruikt om neuronale migratie visualiseren 7-10. We beschrijven gedetailleerd protocol voor het labelen neuroblasten, uitvoeren real-time video-imaging van neuroblast migratie acute plakken van de volwassen muis voorhersenen en analyseren celmigratie. Hoewel de beschreven protocol voorbeeld de migratie van neuroblasten in de volwassen RMS kan ook worden gebruikt om celmigratie volgen embryonale en vroege postnatale hersenen.

We beschrijven een protocol voor real-time videoimaging van neuronale migratie in de muis voorhersenen. De migratie van viraal gemerkte of geënte neuronale precursors opgenomen in acute levende plakjes met breedveld fluorescerende beeldvorming met een relatief snelle verwerving interval de verschillende fasen van celmigratie, zoals de duur van de stationaire en migratiefasen en de snelheid van bestuderen migratie.

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

Er is een aanzienlijke hoeveelheid bewijslast die aangeeft dat er constant nieuwe functionele neuronen worden gegenereerd vanuit een endogene pool van neurale stamcellen ...

Het algemene doel van deze procedure is om de migratie van neuroblasten in acute coupes van de hersenen van volwassen muizen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst de neuronale precursoren in de subventriculaire zone van de volwassen muis te labelen; vijf tot acht dagen na het labelen van de neuroblasten worden acute coupes van de muizenhersenen bereid. Vervolgens wordt time-lapse imaging van de neuroblastmigratie uitgevoerd.Uiteindelijk wordt realtime widefield-microscopie gebruikt om de dynamiek van neuroblastmigratie in acute coupes aan te tonen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neuronale ontwikkeling door de rol van verschillende moleculaire signalen en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij celmigratie te bestuderen. Deze methode kan inzicht bieden in fysiologische processen die de neurale migratie in een volwassen brein reguleren, maar kan ook worden toegepast in andere systemen, zoals bij het bestuderen van neurale migratie in een ischemisch brein en tijdens de embryonale ontwikkeling.Begin deze procedure door een op sucrose gebaseerd kunstmatig cerebrospinaal vocht voor te bereiden voor het snijden van de plakjes en een op natriumchloride gebaseerd A CSF van 32 °C voor het in stand houden van de plakjes tot aan de beeldvorming; oxygeneer vervolgens de oplossingen door ze continu te beluchten met 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Anestheseer daarna de muis met de fluorescentiegelabelde neuroblast via een intraperitoneale injectie van ketamine-xylazine. Bereid vervolgens snel de ijskoude snijoplossing met een geleiachtig uiterlijk voor met behulp van vloeibare stikstof.Neem daarna 15 tot 20 milliliter ijskoude snijoplossing op met een spuit van 20 cc en perfuseer de muis intracardiaal. Indien de bloedvaten gelabeld moeten worden in plaats van perfusie met de snijoplossing, injecteer dan 200 microliters dextran Texas red met een concentratie van 10 milligram per milliliter transcardiaal in de linker ventrikel van het hart, en wacht twee tot drie minuten voordat de muis wordt gedecapiteerd. Decapiteer de muis na de transcardiale perfusie snel, dompel de kop onder in de ijskoude snijoplossing en verplaats deze naar de vibratoom. Knip de schedel met een schaar langs de sagittale naad open, van het cerebellum tot aan de bulbus olfactorius.Verwijder vervolgens voorzichtig de schedelflappen met een pincet. Excite daarna het caudale deel van de hersenen met een scalpel. Maak vervolgens twee sagittale sneden in het meest laterale deel van elke hemisfeer en snijd de hersenen langs de intrahemisferische fissuur. Verwijder vervolgens voorzichtig de hersenen met een spatel en plaats deze in een ijskoud snijmedium.Plaats de twee hemisferen afzonderlijk op een 4% agarblok, waarbij de dorsale zijde het agar raakt. Plak vervolgens het blok met de lateraal gesneden zijde van de twee hemisferen aan het platform van een Vibram, met de mediale zijde naar boven gericht. Plaats daarna het platform in de Vibram-kamer.Vul deze met de snijoplossing. Houd de oplossing vervolgens gedurende de gehele bereiding van de coupes verzadigd met zuurstof door er een mengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide doorheen te borrelen. Maak nu met de vibratom coupes met een dikte van 250 micron.Om coupes van hoge kwaliteit te verkrijgen, moet een lage snijsnelheid en een hoge frequentie van de mesvibratie worden gebruikt. Zodra een coupes is vrijgekomen van het mes, dient deze voorzichtig uit de snijoplossing te worden verwijderd en te worden geplaatst in een incubatiekamer gevuld met gezuurstofte A CSF, die in een waterbad op 32 °C wordt gehouden. Bij deze procedure moet de coupes zorgvuldig in de beeldkamer van de microscoop worden geplaatst om te voorkomen dat de coupes tijdens de beeldvorming gaat drijven.Stabiliseer het door er voorzichtig een nylon gaasje bovenop te plaatsen. Zorg ervoor dat het plakje continu wordt geperfuseerd met A CSF. Gebruik vervolgens een 10x objectief om een interessant gebied te vinden.Open de Metamorph-software en stel vast dat het nylon gaas het beeldveld niet blokkeert. Gebruik vervolgens het 40 x objectief en stel de focus in. Zorg ervoor dat er voldoende oplossing aanwezig is tussen het objectief en de plak.Stel met de Metamorph-software de parameters voor de time-lapse acquisitie in, zoals de excitatieduur, het aantal Z-vlakken, de afstand tussen elke Z-sectie, het tijdsinterval en de opnameperiode. Start vervolgens de time-lapse acquisitie. De gegevens worden door Metamorph automatisch opgeslagen als tiff-bestand, waarbij elk bestand overeenkomt met één tijdstip van de opgenomen time-lapse video, om de film in Metamorph te openen.Laad de verkregen beelden door simpelweg de afbeelding van het eerste tijdspunt van de video naar het programma-icoon te slepen. Zodra de film is geladen, past u de helderheid en het contrast van het signaal aan in het venster voor weergave-aanpassing. Stel de parameters van de verkregen video in, zoals de voxelgrootte en het tijdsinterval in de beeldeigenschappen, en stel vensters met equidistant tijdspunten in.Na het specificeren van de voxelgrootte is het mogelijk om het frame in 3D te bekijken, evenals de tijd en schaal van de video, om de opgenomen cellen automatisch te volgen. Creëer in het surpass-venster een spot voor elke cel in het veld door de spots-functie te kiezen, en meet de diameter van de te volgen cel in het slice-venster. Stel de parameters voor het volgen in en ga verder.Inspecteer de betrouwbaarheid van de gedetecteerde objecten over de tijd. Als niet alle migrerende cellen automatisch worden gedetecteerd, pas dan de detectiedrempel aan en zorg ervoor dat alle cellen op alle tijdstippen met spots zijn geselecteerd. De maximale afstand en de maximale tussenruimte tussen twee spots die opeenvolgende tijdstippen van hetzelfde traject vertegenwoordigen, moeten worden gespecificeerd zodat het programma de tijdstippen kan verbinden.Zodra de tracks zijn aangemaakt, is het mogelijk om deze te filteren en irrelevante tracks te verwijderen door ze simpelweg te wissen. Tracks kunnen worden gecorrigeerd door verschillende tracks en verschillende tijdspunten van dezelfde track met elkaar te verbinden of te ontkoppelen. Zodra alle correcties zijn doorgevoerd, worden de tracks nogmaals gecontroleerd en worden de gegevens, inclusief de celverplaatsing per tijdspunt, tracklengte, verplaatsingslengte en trackduur, geëxporteerd naar een Excel-bestand.Deze video toont time-lapse imaging van de migratie van groene neuroblasten langs bloedvaten die zijn gelabeld met dextran Texas Red. Let op dat de migrerende neuroblasten saltatorisch gedrag vertonen, waarbij de migratiefasen worden onderbroken door stationaire perioden. Deze video toont tevens het tracken van de neuroblastmigratie met imas-software.De bollen en lijnen geven respectievelijk de cellichamen en de migratiepaden van individuele cellen aan. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er acute levensvatbare coupes van goede kwaliteit van de forebrain van volwassen muizen verkregen moeten worden. Daarnaast moeten de coupes goed gestabiliseerd worden in de beeldkamer door zorgvuldig een nylon gaas te plaatsen om het verschuiven van de coupe tijdens de beeldvorming te voorkomen.Elke verandering in de snelheid van de A CSF-perfusie, een onregelmatige perfusie of drastische temperatuurvariaties kunnen leiden tot drift en verschuivingen in het brandvlak tijdens de beeldvorming. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de migratie van neuroblasten in acute coupes van volwassenen kunt registreren en analyseren. Wij raden aan om korte physician-intervallen van 15 tot 30 seconden te gebruiken om het begin en het einde van de migratie- en stationaire fasen betrouwbaar te identificeren.

time-lapse-imaging-neuroblast-migration-acute-slices-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) This video demonstrates time-lapse confocal microscopy to observe cortical neuron radial migration from the subventricular zone to the cortical plate via radial glial scaffolds in transduced mouse embryonic brain slices.

Time-Lapse Imaging of Cortical Neuron Radial Migration in Transduced Mouse Embryonic Brain Slices

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Magnetic resonance imaging (MRI) is uitgegroeid tot een steeds populairder middel voor de behandeling van het fenotype van genetisch veranderde muizen. Dit artikel illustreert de methoden die nodig zijn om high-throughput fenotypering van genetisch veranderde muizen met behulp van meerdere MRI-muis te bereiken.

Multiple-muis neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Werkwijze voor subventriculaire zone (SVZ) cellen geladen met calcium indicator kleurstoffen voor opname calcium activiteit beschreven. De postnatale SVZ bevat dicht opeengepakte cellen met inbegrip van neurale progenitor cellen en neuroblasten. Plaats van bad loading injecteerden we de kleurstof door druk in het weefsel voor een beter kleurstofdiffusieoverdracht.

Voorbereiding van Acute subventriculaire zone Schijfjes voor Calcium Imaging

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen...

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Leer neuroblastmigratie bestuderen in acute schijfjes van de volwassen muizen voorhersenen met time-lapse fluorescentiebeeldvorming. Deze methode onthult dynamiek van neuronale voorlopercellen en migratiefasen voor inzicht in neurale ontwikkeling.

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

Meer video's verkennen