Kleuring Protocols for Human pancreatische eilandjes
23 mei 2012
Deze video demonstreert de procedures voor de karakterisering van humane pancreatische eilandjes met hematoxyline en eosine (H & E) en immunohistochemie (IHC). Pancreas delen van het hoofd, lichaam en staart regio's worden gekleurd door zowel H & E en IHC te eilandje endocriene samenstelling (insuline, glucagon, en pancreas polypeptide), cel-replicatie (Ki67) en inflammatoire infiltraten (H & E, CD3) te bepalen. De uncinate regio is gelokaliseerd met behulp van IHC voor pancreas polypeptide.
Het algemene doel van deze procedure is het karakteriseren van menselijke pancreaseilandjes met behulp van hematoxyline- en eosinekleuring en immunohistochemie. Dit wordt bereikt door het maken van seriële coupes van een pancreasmonster dat is ingebed in een paraffineblok. De coupes worden vervolgens in hun oorspronkelijke oriëntatie op objectglazen geplaatst.
Een deel van de coupes is gekleurd met hematoxyline en eosine, terwijl de resterende coupes via immunohistochemie zijn gekleurd; de laatste stap is het scannen van de gekleurde coupes en deze per casus te organiseren. Uiteindelijk kunnen deze beelden worden geüpload naar een online pathologiedatabase, waar ze kunnen worden bekeken door andere onderzoekers in het vakgebied. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de coupes in serie worden gekleurd terwijl hun oorspronkelijke oriëntatie behouden blijft.
De procedure wordt gedemonstreerd door Linda Snyder, histotechnoloog, Emily Montgomery, biologisch wetenschapper, en Tiffany Hippo, laboratoriumtechnicus in mijn laboratorium. Begin met het klaarmaken van het waterbad en de microtoom volgens de standaardprocedures voor paraffine-microtomie. Label vervolgens de positief geladen objectglazen met het casusnummer, de regio van de pancreas en het glaasnummer.
Zodra alles is voorbereid, wordt het paraffineblok in de houder van de microtoom geplaatst met het cassettelabel aan de linkerzijde. Volg de standaard microtomieprocedures en snijd het blok tot het weefsel gelijkmatig is blootgesteld. Zodra het weefsel gelijkmatig wordt bereikt, wordt er een lint van seriële coupes van ongeveer vier microns dik geproduceerd.
Afhankelijk van het aantal vereiste initiële kleuringen zijn drie tot zes coupes nodig. Scheid vervolgens de coupes van het lint. Neem elke coupe opeenvolgend op en plaats deze op een objectglas.
Noteer het sectienummer met een potlood. Als een sectie onbruikbaar is, sla dat nummer dan over en ga verder met het nummeren van de secties in de exacte volgorde. Zorg ervoor dat de oriëntatie op de objectglas dezelfde blijft als in het cassetteje, met het label van het objectglas naar links gericht.
Plaats de objectglazen vervolgens in een objectglasrek en laat ze een nacht drogen. Seal bij kamertemperatuur het oppervlak van het paraffineblok opnieuw met een dunne laag paraffine om het weefsel te preserveren en archiveer dit bij kamertemperatuur of bij minus 20 graden Celsius. Herhaal deze procedure voor het volgende monster.
Het is belangrijk om de nummering voor seriële coupes op elk niveau, zoals hierboven weergegeven voor H&E-kleuring, te handhaven. Plaats de eerste coupe van elk blok in een objectglashouder en plaats de houder vervolgens in het eerste bakje van de automatische kleurmachine. Selecteer het standaard HE-programma en start het kleuringsproces.
Wanneer de kleuring voltooid is, worden de objectglaasjes uit de automatische kleurmachine gehaald en in de zuurkast geplaatst voor het aanbrengen van de dekglasjes. Plaats met standaardtechnieken een dekglasje op elk objectglasje. Label tot slot de objectglasjes met een geprint label en laat ze grondig drogen in de zuurkast.
Begin met het instellen van de automatische kleureermachine en het klaarmaken van alle benodigde reagentia. Selecteer het Daco-programma voor dubbelkleuringen. Voer het aantal coupes in en de behandeling die elke coupe zal ondergaan.
Laad alle reagentia in de automatische kleureermachine volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Bereid vervolgens TBST en citraat, buffers, antilichamen en andere reagentia voor die nodig zijn voor de procedure. Deparaffineer de coupes door ze vijf minuten in xyleen te plaatsen.
Laat de preparaten niet uitdrogen, omdat dit zal leiden tot overmatige achtergrondkleuring en poriekleuring terwijl de preparaten worden gedeparaffiniseerd. Giet citraatbuffer in een stomer om deze voor gebruik voor te verwarmen. Dien vervolgens de gedeparaffiniseerde preparaten in voor een reeks ethanolwasbeurten.
Spoel de coupes voor de laatste keer met gedeïoniseerd water. Voeg de coupes toe aan de voorverwarmde citraatbuffer en laat ze 30 minuten stomen. Verplaats de coupes na deze periode onmiddellijk naar een waterbad op kamertemperatuur totdat ze volledig zijn afgekoeld.
Zodra ze zijn afgekoeld, worden de coupes overgebracht naar de rekken van de Dayco automatische kleurmachine, waarbij nauwkeurig op de juiste volgorde wordt gelet. Start vervolgens het dubbele kleuringsprogramma dat eerder is ingeladen. Wanneer het dubbele kleuringsprogramma is voltooid, worden de coupes uit de automatische kleurmachine gehaald en minimaal één uur gedroogd voordat ze worden gedehydrateerd.
Om de dehydratie voort te zetten, worden de coupes gedurende één minuut overgezet naar 80% ethanol. Zet de dehydratie van de coupes voort door ze onder te dompelen in 95% ethanol en vervolgens in 100% ethanol. Dompel de coupes tot slot gedurende één minuut in xyleen.
Monteer de coupes onmiddellijk met dekglas met behulp van cyto seal om de procedure te voltooien. Print etiketten met de casusinformatie, inclusief het orgaan en bloknummer, het type kleuring en de datum. Plak een etiket op elk preparaat om de gekleurde coupes te scannen.
Plaats ze op een scantray en volg de standaardprocedures. Archiveer de gekleurde coupes bij kamertemperatuur en eventuele overgebleven ongekleurde coupes bij minus 20 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Organiseer tot slot de gekleurde beelden per donor en per waargenomen weefseltype.
Hier is een voorbeeld van KI 67- en insulinekleuring bij zowel lage als hoge vergrotingen. Beelden van de gekleurde pancreassecties worden ingediend in een online pathologiedatabase ter creatie van een virtuele biobank. Met behulp van deze database kunnen onderzoekers snel toegang krijgen tot informatie die nodig is voor onderzoek naar diabetes type 1.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hoogwaardige coupes van de menselijke pancreas prepareert en kleurt.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert procedures voor de karakterisering van menselijke pancreaseilandjes met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en immunohistochemie (IHC). De techniek maakt het mogelijk om de endocriene samenstelling van de eilandjes, celreplicatie en inflammatoire infiltraten te beoordelen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Endocrinologie
- Histologie
Achtergrond
- Humaan pancreaseilandjes spelen een cruciale rol in het glucosemetabolisme.
- Karakterisering van de samenstelling van de eilandjes is essentieel voor het begrip van diabetes.
- H&E en IHC zijn standaardtechnieken voor weefselanalyse.
- Het behouden van de oorspronkelijke oriëntatie van de coupes is van kritisch belang voor een nauwkeurige beoordeling.
Doel van de studie
- Om menselijke pancreaseilandjes te karakteriseren.
- Om de endocriene samenstelling van de eilandjes te bepalen.
- Om celreplicatie en ontstekingsreacties te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Het maken van seriesecties van in paraffine ingebedde pancreasmonsters.
- Het kleuren van secties met H&E en IHC.
- Het scannen van gekleurde coupes voor analyse.
- Het organiseren van beelden per casus voor upload naar de database.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van insuline, glucagon en pancreatisch polypeptide in eilandjes.
- Beoordeling van celreplicatie met behulp van Ki67-kleuring.
- Evaluatie van inflammatoire infiltraten via H&E- en CD3-kleuring.
- Succesvolle lokalisatie van de processus uncinatus met behulp van IHC.
Conclusies
- De methode biedt een uitgebreide karakterisering van pancreaseilandjes.
- Het behouden van de oorspronkelijke oriëntatie van het coupesnijde verhoogt de nauwkeurigheid van de analyse.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van de pancreasfunctie bij gezondheid en ziekte.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Gestandaardiseerde histopathologische workflows voor menselijke pancreaseilandjes maken een reproduceerbare karakterisering van endocriene cellen mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie in diabetesonderzoek. Door de oriëntatie van seriële coupes te behouden en gedigitaliseerde whole-slide images te genereren, faciliteert deze methode cross-functionele gegevensuitwisseling en biobanking voor het mechanistisch minimaliseren van risico's bij therapieën gericht op eilandjes. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door kwantificeerbare, ruimtelijk opgeloste gegevens te verschaffen over de compositie, replicatie en immuuninfiltraten van de eilandjes.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via rigoureuze histopathologie en immunolocalisatie van endocriene eilandjescellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicobeperking door het karakteriseren van de morfologie, grootte, dichtheid en endocriene celcompositie van de eilandjes met behulp van H&E- en IHC-kleuringen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van het portfolio door de replicatie van eilandjes en apoptotische cellen te evalueren via Ki67 en andere proliferatiemarkers.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows via gestandaardiseerde verwerking van de menselijke pancreas in gedefinieerde regio's (kop, lichaam, staart) en transversale secties.
- Operationele waarde: Pakt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays aan door subsecties te nummeren en alfabetisch aan te duiden op basis van grootte voor een volledige dwarsdoorsnedenanalyse.
- Platformwaarde: Benadrukt screening-gereedheid en schaalbaarheid via gedigitaliseerde whole-slide images, georganiseerd in een online pathologiedatabase die toegankelijk is voor meer dan 200 onderzoekers.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor de ziekte door eilandjes te evalueren op ontsteking, fibrose, amyloïd en T-celinfiltraten met behulp van H&E- en CD3-kleuring.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door zowel endocriene als exocriene compartimenten te beoordelen, inclusief ductulaire pathologie en neoplasie.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Richt zich op voorspellende risicoreductie door pancreatische intraductale neoplasie en de relatie ervan met het ductussysteem te karakteriseren.
Integratie van pipeline en workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot preklinische beoordeling, door seriële doorsnijding, gestandaardiseerde kleuring en digitale biobanking van menselijk pancreaatweefsel mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking via histopathologie en immunolokalisatie van pancreaseilandjes en endocriene cellen.
- Screening: Garandeert assay-gereedheid en reproduceerbaarheid door de oorspronkelijke oriëntatie van de coupes te behouden tijdens seriële sectiering en seriële kleuring.
- Analytics: Benadrukt kwantitatieve metingen van eilandjesoppervlak, aantallen, endocriene celcompositie, replicatie en T-celinfiltraten via H&E en IHC om vergelijking tussen verschillende condities mogelijk te maken.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door evaluatie van eilandjesamyloïd, fibrose en inflammatoire infiltraten die relevant zijn voor de pathogenese van type 1 diabetes.
- Enterprise Hergebruik: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit via een online pathologiedatabase die snelle gegevensuitwisseling en blokselectie voor paraffine- of bevroren seriële coupes mogelijk maakt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit in de endocriene samenstelling van eilandjes en immuuninteracties.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van seriële sectiering, kleuring en digitale archivering van coupes.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium door vroege identificatie van eilandjespathologie en replicatiestatus.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en voortgangsbeslissingen op basis van kwantificeerbare morfologie, dichtheid en endocriene cel-fenotypes van de eilandjes.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in histotechnologie, immunohistochemie en workflows voor digitale pathologie.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een microtoom, automatische kleurstofapparaat, slide scanner en toegang tot een online pathologie-database.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor het labelen van coupes, de nummering van secties en het behoud van de oriëntatie tussen de histologie- en beeldvormingsteams.
- Overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen, in het bijzonder voor het toepassen van gestandaardiseerde regionale verwerking (kop, lichaam, staart) op niet-menselijke pancreata.
- Praktische beperkingen omvatten weefselvariabiliteit van organdonoren en de noodzaak van geoptimaliseerde antilichaamvalidatie voor multiplex IHC-kleuring.
