Kleuring Protocols for Human pancreatische eilandjes
May 23rd, 2012
Deze video demonstreert de procedures voor de karakterisering van humane pancreatische eilandjes met hematoxyline en eosine (H & E) en immunohistochemie (IHC). Pancreas delen van het hoofd, lichaam en staart regio's worden gekleurd door zowel H & E en IHC te eilandje endocriene samenstelling (insuline, glucagon, en pancreas polypeptide), cel-replicatie (Ki67) en inflammatoire infiltraten (H & E, CD3) te bepalen. De uncinate regio is gelokaliseerd met behulp van IHC voor pancreas polypeptide.
Het algemene doel van deze procedure is om menselijke pancreas-oogjes te karakteriseren met behulp van hematine en eosinekleuring en immunohistochemie. Dit wordt bereikt door seriële secties te maken van een pancreasmonster ingebed in een paraffineblok. De secties worden vervolgens in hun oorspronkelijke oriëntatie op dia's geplaatst.
Een deel van de dia's wordt gekleurd met hematine en eoin, terwijl de resterende dia's worden gekleurd door middel van immunohistochemie, de laatste stap is om de gekleurde dia's te scannen en ze te ordenen per casus. Uiteindelijk kunnen deze afbeeldingen worden geüpload naar een online pathologiedatabase waar ze kunnen worden bekeken door andere onderzoekers in het veld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat dia's in serie worden gekleurd terwijl hun oorspronkelijke oriëntatie wordt behouden.
De procedure zal worden gedemonstreerd door Linda Snyder, histotechnoloog, Emily Montgomery, biologisch wetenschapper, en Tiffany Hippo, laboratoriumtechnicus in mijn laboratorium. Om te beginnen de waterbad en microtoom instellen volgens de standaardprocedures voor paraffine microtomie. Label vervolgens positief geladen dia's met het casusnummer, pancreasgebied en dianummer.
Zodra alles is voorbereid, plaats de paraffineblok in de microtoomklem met het cassettelabel aan de linkerkant. Volg de normale microtomieprocedures, sectioneer de blok totdat het weefsel uniform blootligt. Zodra het weefsel gelijkmatig is ontmoet, produceer een lint van seriële secties van ongeveer vier micron dik.
Drie tot zes secties zijn nodig, afhankelijk van het aantal vereiste initiële kleuringen. Scheid vervolgens de secties van het lint. Neem elke sectie op volgorde en plaats deze op een dia.
Noteer het sectienummer met een potlood. Als een sectie onbruikbaar is, sla dat nummer over en nummer de secties in exacte volgorde verder. Zorg ervoor dat u dezelfde oriëntatie op de dia behoudt zoals gevonden in de cassette met de dialabel naar links georiënteerd.
Plaats vervolgens de dia's in een diastandaard en laat ze een nacht drogen. Bij kamertemperatuur, verzegel het oppervlak van de paraffineblok opnieuw met een dunne laag paraffine om het weefsel te behouden en archiveer het bij kamertemperatuur of min 20 graden Celsius. Herhaal deze procedure voor het volgende monster.
Het is belangrijk om de nummering voor seriële secties op elk niveau te behouden zoals hierboven te zien is voor h en e kleuring. Plaats de eerste dia van elke blok in een diastandaard en plaats vervolgens de standaard in de eerste lade van de automatische kleuringsmachine. Selecteer het standaard HE-programma en start het kleuringsproces.
Wanneer de kleuring is voltooid, verwijder de dia's uit de automatische kleuringsmachine en plaats ze in de kap voor bedekking. Plaats een dekglas op elke dia met behulp van standaardtechnieken. Ten slotte label de dia's met een afgedrukt label en laat ze grondig drogen in de kap.
Begin met het instellen van de automatische kleuringsmachine en het voorbereiden van alle benodigde reagentia. Kies het Daco-programma voor dubbele kleuringen. Voer de aantallen dia's in en de behandeling die elke dia zal ontvangen.
Laad alle reagentia in de automatische kleuringsmachine volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Bereid vervolgens TBST en citraat, buffers, antilichamen en andere reagentia voor die nodig zijn voor de procedure. Deparizeer de dia's door ze vijf minuten in xyleen te plaatsen.
Laat de dia's niet uitdrogen, want dit zal leiden tot overmatige achtergrond en poruskleuring terwijl de dia's worden depa. Giet citraatbuffer in een stoomboot om voor te verwarmen voor gebruik. Dien vervolgens de depa dia's in voor een reeks ethanolwasbeurten.
Spoel de dia's voor de laatste keer in gedeïoniseerd water. Voeg de dia's toe aan de voorverwarmde citraatbuffer en laat ze 30 minuten stomen. Na deze periode brengt u de dia's onmiddellijk over naar een waterbad op kamertemperatuur totdat ze volledig zijn afgekoeld.
Eenmaal afgekoeld, breng de dia's over naar de Dayco auto Stainer-rekken, zorg ervoor dat u de juiste volgorde behoudt. Voer ten slotte het dubbele kleuringsprogramma uit dat eerder werd geladen wanneer het dubbele kleuringsprogramma is voltooid. Verwijder de dia's uit de automatische kleuringsmachine en laat ze minimaal een uur drogen voordat ze worden gedehydrateerd.
Om de dehydratatie voort te zetten, brengt u ze over naar 80% ethanol gedurende één minuut. Continueer het dehydrateren van de dia's door ze in 95% ethanol en vervolgens 100% te weken. Duik tot slot de dia's één minuut in xyleen en houd ze vast.
Monteer de dia's onmiddellijk met dekglasjes met behulp van cytoseal om de procedure te voltooien. Druk labels af die de casusinformatie bevatten, inclusief het orgaan- en bloknummer, type kleuring en datum. Plaats een label op elke dia om de gekleurde dia's te scannen.
Plaats ze op een scannerlade en volg standaardprocedures. Archiveer de gekleurde dia's bij kamertemperatuur en eventuele resterende ongekleurde dia's bij min 20 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Ten slotte organiseert u de gekleurde afbeeldingen per donor en weefseltype dat wordt gezien.
Hier is een voorbeeld van KI 67 plus insulinekleuring op zowel lage als hoge vergrotingsniveaus. Afbeeldingen van de gekleurde pancreassecties worden ingediend bij een online pathologiedatabase en creëren een virtuele biobank. Met behulp van deze database kunnen onderzoekers snel toegang krijgen tot de informatie die nodig is voor onderzoek en type één diabetes.
Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u hoogwaardige dia's van de menselijke pancreas kunt bereiden en kleuren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze video toont procedures voor de karakterisering van menselijke pancreas-eilandjes met behulp van hematoxyline en eosine (H&E) kleuring en immunohistochemie (IHC). De techniek maakt de beoordeling van de endocriene samenstelling van de eilandjes, celreplicatie en inflammatoire infiltraties mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Endocrinologie
- Histologie
Achtergrond
- Menselijke pancreas-eilandjes spelen een cruciale rol in het glucosemetabolisme.
- Karakterisering van de samenstelling van de eilandjes is essentieel voor het begrijpen van diabetes.
- H&E en IHC zijn standaardtechnieken voor weefselanalyse.
- Het behoud van de oorspronkelijke oriëntatie van de dia's is cruciaal voor een nauwkeurige beoordeling.
Doel van de studie
- Om menselijke pancreas-eilandjes te karakteriseren.
- Om de endocriene samenstelling van de eilandjes te bepalen.
- Om celreplicatie en inflammatoire reacties te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Het maken van seriële secties van paraffine-ingelegde pancreasmonsters.
- Het kleuren van secties met H&E en IHC.
- Het scannen van gekleurde dia's voor analyse.
- Het organiseren van afbeeldingen per geval voor upload naar de database.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van insuline, glucagon en pancreatisch polypeptide in eilandjes.
- Beoordeling van celreplicatie met behulp van Ki67 kleuring.
- Evaluatie van inflammatoire infiltraties door middel van H&E en CD3 kleuring.
- Succesvolle lokalisatie van het uncinate gebied met behulp van IHC.
Conclusies
- De methode biedt een uitgebreide karakterisering van pancreas-eilandjes.
- Het behoud van de oorspronkelijke dia-oriëntatie verbetert de nauwkeurigheid van de analyse.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van de pancreasfunctie in gezondheid en ziekte.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Standardized histopathology workflows for human pancreatic islets enable reproducible endocrine cell characterization, supporting target validation in diabetes research. By preserving serial section orientation and generating digitized whole-slide images, the method facilitates cross-functional data sharing and biobanking for mechanistic de-risking of islet-targeted therapies. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantifiable, spatially resolved data on islet composition, replication, and immune infiltrates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through rigorous histopathology and immunolocalization of islet endocrine cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking by characterizing islet morphology, size, density, and endocrine cell composition using H&E and IHC stains.
- Predictive Value: Assists in portfolio triage by evaluating islet replication and apoptotic cells via Ki67 and other proliferation markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized processing of human pancreas into defined regions (head, body, tail) and transverse sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility by numbering and alphabetically denoting subsections based on size for complete cross-sectional analysis.
- Platform Value: Highlights screening readiness and scalability via digitized whole-slide images organized in an online pathology database accessible to over 200 researchers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by evaluating islets for inflammation, fibrosis, amyloid, and T-cell infiltrates using H&E and CD3 staining.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by assessing both endocrine and exocrine compartments, including ductular pathology and neoplasia.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by characterizing pancreatic intraductal neoplasia and its relationship to the duct system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment by enabling serial sectioning, standardized staining, and digital biobanking of human pancreatic tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through histopathology and immunolocalization of pancreatic islets and endocrine cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility by maintaining original slide orientation during serial sectioning and staining in series.
- Analytics: Highlights quantitative measurements of islet area, numbers, endocrine cell composition, replication, and T-cell infiltrates via H&E and IHC to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by evaluating islet amyloid, fibrosis, and inflammatory infiltrates relevant to type 1 diabetes pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability through an online pathology database that provides rapid data sharing and block selection for paraffin or frozen serial sections.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in islet endocrine composition and immune interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of serial sectioning, staining, and digital slide archiving.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early identification of islet pathology and replication status.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable islet morphology, density, and endocrine cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histotechnology, immunohistochemistry, and digital pathology workflows.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtome, auto stainer, slide scanner, and online pathology database access.
- Cross-team standardization requirements for slide labeling, section numbering, and orientation maintenance across histology and imaging teams.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for applying standardized regional processing (head, body, tail) to non-human pancreata.
- Practical limitations include tissue variability from organ donors and the need for optimized antibody validation for multiplex IHC staining.
