Name: Kleuring Protocols for Human pancreatische eilandjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Leer hoe je menselijke pancreaseilandjes karakteriseert met H&E-kleuring en immunohistochemie. Deze methode beoordeelt endocriene samenstelling, celreplicatie en ontstekingsinfiltraten voor diabetesonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken de donateurs de familie en de Organ Procurement Organisaties die betrokken zijn bij dit onderzoek en Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, en Roshan Agarwal voor hun deskundige hulp. Dit werk werd gefinancierd door de Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) ter ondersteuning van het netwerk voor Pancreatic Organ Donors met diabetes.

1. Coupes voor het ongekleurde secties <ol><li> Stel waterbad en microtoom als voor standaard paraffine coupes. Gebruik positief geladen dia&#39;s en pre-label met zaaknummer, pancreas regio (monster) en slide nummer. Plaats paraffineblok in de microtoom boorkop met de cassette label aan de linkerkant. </li><li> Volgens de normale procedures coupes, sectie in blok tot weefsel wordt gelijkmatig aangetroffen. Maak een lint van seriële secties (4 micrometer dik, 3-6 afhankelijk van het aantal vereiste initiële vlekken (zie arrest van Submission Form, bijlage 1)). Aparte secties in het lint, pick-up iedereen moet nemen om, en leg ze op dia&#39;s met om genummerd met potlood. Noem als een deel niet wordt gebruikt door de nummering secties in precies dezelfde volgorde. Houd dezelfde richting op de dia zoals gevonden in de cassette met de dia-label gericht op de links. Droog nacht bij kamertemperatuur vervolgens door te gaan met vlekken of distributie aan onderzoekers. </li><li> Respaling oppervlak paraffineblok met dunne laag paraffine weefsel en archief bewaren bij kamertemperatuur of 20 ° C. </li><li> Voor de volgende coupes, onderhouden nummering voor seriële secties op elk niveau als hierboven. Verkrijgen een extra dia en vlekken door H &amp; E dia per ~ 100 uM niveau in elk blok. </li></ol> 2. H &amp; E kleuring <ol><li> Plaats dan de eerste seriële coupes dia uit elk blok in een dia rek in de eerste lade op de Autostainer. </li><li> Selecteer de standaard H &amp; E vlek programma en ga verder zoals gewoonlijk. </li><li> Wanneer u klaar bent vlekken, verwijdert u de dia&#39;s van Autostainer en plaats in de kap voor afdekken. </li><li> Dekglaasje met standaard technieken. Goed afdrogen en label met een gedrukt etiket (zie paragraaf 12). </li></ol> 3. IHC Set-up <ol><li> Selecteer de Dako-programma voor dubbele vlekken en input aantal dia&#39;s. Bereid TBST en citraat buffers, antilichamen, en Reagouders op basis van gespecificeerde volumes (tabel 1). Laad het reagens lade en dia&#39;s. Rotatie van schone en afval lijnen zijn geprogrammeerd conform de aanbevelingen van de fabrikant. </li><li> Als het uitvoeren van deze testen handmatig, bereiden geschatte volumes. Incubeer dia&#39;s in een vochtige kamer om dia&#39;s uit bij elke stap het drogen te voorkomen. Volg dezelfde procedure voor alle reagentia als bij gebruik voor Autostainer. </li></ol> 4. IHC Deparaffinization en Antigen Retrieval <ol><li> Zet dia&#39;s in xyleen gedurende 5 minuten. Herhaal een keer. Zorg ervoor dat de dia&#39;s om uit te drogen op een later moment tot aan aangegeven, omdat dit zal resulteren in overmatige achtergrond en slechte kleuring. </li><li> Breng dia&#39;s op 100% ethanol gedurende 2 minuten. Herhaal een keer. </li><li> Slides in vers bereide 3% H 2 O 2 in methanol gedurende 10 minuten. </li><li> Dip dia&#39;s in 90% ethanol en vervolgens plaatsen in 90% ethanol gedurende 3 minuten. </li><li> Transfer schuift aan70% Ethanol gedurende 1 minuut. </li><li> Spoel de objectglaasjes in gedeïoniseerd water. </li><li> Verwarm de steamer en citraat buffer in stoompan gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg dia&#39;s om buffer citraat in de stoompan en stoom gedurende 30 minuten. </li><li> Onmiddellijk overbrengen dia&#39;s om water te houden, tot de dia&#39;s afkoelen tot kamertemperatuur (~ 20 minuten). </li><li> Zet dia&#39;s aan het Dako Autostainer racks op basis van volgorde (figuur 1) vlekken op en voer de dubbele kleuring programma. De belangrijkste stappen van het Autostainer programma zijn zo vermeld dat handmatige runs kunnen dupliceren. </li></ol> 5. Eerste Primaire antilichamen (Ki-67, CD3-, pancreas polypeptide) <ol><li> Blokkeer dia&#39;s met Sniper oplossing gedurende 15 minuten. Was twee keer met TBST. </li><li> Incubeer dia&#39;s in primaire antilichaam gedurende 30 minuten. Was twee keer met TBST. </li><li> Incuberen met Mach2 geit anti-muis (Ki-67) of anti-konijn (CD3, pancreas polypeptide) mierikswortelperoxidase (HRP) polymeer 30 minuten. Was twee keer met TBST. </li><li> Breng 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) om dia&#39;s voor 4 minuten. Was twee keer met water. </li><li> Dia geïncubeerd met pancreas polypeptide gehouden op Dako wanneer wordt gelijktijdig getest en TBST bij alle volgende stappen terwijl de overige dia worden geïncubeerd met de tweede primaire antilichamen. Als alternatief voor het handmatig testen, gaat u naar hoofdstuk 6. </li></ol> 6. Tweede Primaire antilichamen (insuline, glucagon) <ol><li> Incubeer dia&#39;s in Deeb gedurende 20 minuten. Was twee keer met TBST. </li><li> Blok met 10% normaal geitenserum in 20% avidine blokker in TBST (insuline) of Sniper (glucagon) in TBST gedurende 20 minuten. Was twee keer met TBST. </li><li> Incubeer met insuline of glucagon primaire antilichaam gedurende 15 minuten. Was twee keer met TBST. </li><li> Insuline: Incubate dia&#39;s in gebiotinyleerd geit anti-cavia bij 1:300 verdunning gedurende 30 minuten. Was twee keer met TBST. Incubeer met standaard vector ABC-AP reagens voor 30 minuten. Was twee keer met TBST. </li><li> Glucagon: incuberen dia in buffer gedurende 30 minuten gevolgd door geit anti-muis alkalische fosfatase (AP) polymeer gedurende 30 minuten. Was twee keer met TBST. </li><li> Terwijl de dia&#39;s worden geïncubeerd in conjugaten, warmen de LPR-buffer op kamertemperatuur. Voeg 1 druppel vloeistof permanent rood (LPR) per 3 ml buffer direct voor het gebruik en de plaats in Dako reagens rek. Incubeer dia&#39;s in LPC gedurende 4 minuten. Was twee keer met water. </li><li> Incubeer dia&#39;s in hematoxyline gedurende 1 minuut. Twee keer spoelen met water. </li><li> Incubeer dia&#39;s in TBS pH 7,6 gedurende 1 minuut. Twee keer spoelen met water. </li><li> Unload dia&#39;s van DAKO Autostainer. </li><li> Onmiddellijk drogen dia&#39;s gekleurd voor pancreas polypeptide. Voor alle dubbele glas dia&#39;s, droog voor minstens 1 uur dan uitdrogen. </li></ol> 7. Uitdroging <ol><li> Plaats de glaasjes in 80% ethanol gedurende 1 minuut. </li><li> Dompel dia&#39;s in 95% ethanol. </li&gt; <li> Houd dia in 95% ethanol gedurende 30 seconden. </li><li> Breng dia&#39;s op 100% ethanol en houd 1 minuut. Herhaal. </li><li> Dip dia&#39;s in xyleen. </li><li> Houd dia&#39;s in xyleen gedurende 1 minuut. Herhaal. </li><li> Onmiddellijk monteren dekglaasjes op dia&#39;s met behulp van cytoseal. </li></ol> 8. Slide Labeling <ol><li> Geef de geval gebeurd de identificatie informatie, inclusief orgel en bloknummer, vlek, en de datum en print. Serial sectie nummer is optioneel voor de eerste dia vlekken van elk blok. Volgende niveaus worden aangeduid met nummering. </li><li> Plaats etiketten op dia&#39;s. </li></ol> 9. Dia&#39;s scannen <ol><li> Plaats in lood dia&#39;s in de scanner lade en scannen op basis van instrumentatie. </li><li> Organiseer dia&#39;s door donor en weefseltype (pancreas hoofd, lichaam, staart, de milt). </li><li> Archief gebrandschilderde dia&#39;s bij kamertemperatuur en de resterende ongekleurde dia&#39;s bij -20 ° C tot gebruik. </li></ol> 10. Representative resultaten Deze vlekken procedures werden ontwikkeld voor de JDRF Network for Pancreatic orgaandonoren met diabetes (nPOD) met de uitgangswaarde karakterisering van paraffine en vers bevroren blokken te bieden. Elke donor heeft een uitgangswaarde karakterisering uitgevoerd bestaat uit vlekken 2 blokken van elk alvleesklier regio (hoofd, lichaam en staart) en de milt (Figuur 1, zie ook zaak indienen vorm, bijlage 1). De H &amp; E kleuring wordt uitgevoerd met behulp van een Autostainer geprogrammeerd als voor een klinische faciliteit met klinische-grade oplossingen gebruikt in. Als extra donor-blokken zijn coupes, elk heeft een glijbaan genomen voor H &amp; E om weefsel morfologie te laten zien. Bij het blokken zijn weer coupes, als voor distributie naar de onderzoekers, zal diepere niveaus ook dia&#39;s genomen voor representatieve H &amp; E dia&#39;s aan het hele blok van weefsel morfologie documenteren en nummering seriële secties op elk niveau. Stained dia&#39;s zijn voorzien vangeval gebeurd de identificatie, de alvleesklier regio, bloknummer, vlek en datum (figuur 2) en gescand in de online pathologie informatie management systeem. Representatieve beelden van een controle-donor zijn weergegeven in figuur 3 bij zowel lage als hoge vergrotingen te verwachte resultaten tonen deze procedure. De slede gekleurd met pancreas polypeptide (D, H) werd bepaald op een andere dag de assay uitgevoerd handmatig toont verminderde intensiteit van de kleuring hematoxyline tegenkleuring. Verschillen in kleuringsintensiteit primaire antilichamen of tegenkleuring tussen assays wordt vermeden vooral bij gebruik beeldanalyse anders glijdt met afzonderlijke kleurcorrectie dezelfde cel gebieden of tellingen te bereiken. Elk laboratorium dient te verwachten dat de concentraties aan antistoffen te optimaliseren als lot-to-lot variatie en andere reagentia en voorwaarden kunnen vlekken intensiteit en specificiteit beïnvloeden. Met de aanschaf van nieuwe reaheren, zijn kleuringen gevalideerd met bekende positieve en negatieve controlemonsters in dezelfde mate van de vlek intensiteit te bereiken als met oud-reagentia. Extra antilichamen geoptimaliseerd in de pathologie nPOD kern worden in tabel 2 als referentie en zijn gebruikt voor multilabeling immunofluorescentie assays voor confocale microscopie. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. Dako vlekken net. Dit schema toont een routine-analyse van een nPOD donor alvleesklier uitgevoerd op een Dako Autostainer. De nPOD donoren zijn gecodeerd met een 4-cijferig identificatienummer. Twee dia&#39;s laden worden getoond met dia&#39;s, georganiseerd door vlek. Alternatieve slide configuraties worden verwacht, afhankelijk van het aantal donoren dia&#39;s. Positieve controles zijn onder andere opname van een bekende positieve donor voor de twee dubbele vlekken en donor milt voor Ki-67 en CD3. Negatieve controles is tweeledig en bestaat uit twee slides ene donoralvleesklier blok geïncubeerd met immunoglobuline (Ig) van de gastheersoort van de primaire antilichamen en twee dia&#39;s van donor milt voor insuline en glucagon. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Vertegenwoordiger dubbel glas glijbaan. Een typische afgewerkte dia wordt weergegeven met glijbaan etikettering parameters en weefsel plaatsing voor digitaal scannen wordt uitgevoerd. <img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3. Vertegenwoordiger van H &amp; E en IHC vlekken in de pancreas secties. Artikelen uit de pancreas van een volwassen vrouwtje orgaandonor (6096-04 Panhead) waren gekleurd en digitale scans uitgevoerd zoals beschreven in het protocol. Verkrijgt men beelden met het ImageScope die programma van de gehele sectie (AD) en van een eiland (EH). De verwachte eilandje vlek intensiteiten voor insuline, glucagon, en pancreas polypeptide zijnwaargenomen voor secties BD als sectie D schetst dat dit alvleesklier hoofd blok een klein deel van de uncinate regio of ventrale pancreas lob als alle eilandjes vooral de pancreas polypeptide-positieve cellen bevatten bevat. Merk op dat de hematoxyline tegenkleuring in het paneel D is te licht, terwijl de hematoxyline tegenkleuring intensiteiten in B-en C-optimaal zijn. Panelen EH tonen een eilandje van het dorsale lob met de verwachte verdeling van de β-cellen en α-cellen. Een paar pancreas polypeptide cellen worden aangetroffen in de linker deel van het eilandje (H). A, E-H &amp;E; B, F-Ki67 + insuline, C, G-CD3 + Glucagon, D, H-pancreas polypeptide. AD, 0,2 x, EH-12.8x.

<ol><li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li>
<li>Matveyenko, A. V., Butler, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+beta-cell+mass+and+diabetes+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Relationship between beta-cell mass and diabetes onset.</a> Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).</li>
<li>Saisho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+volumes+in+humans+from+birth+to+age+one+hundred+taking+into+account+sex%2C+obesity%2C+and+presence+of+type-2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Anat%22%5BJournal%5D)">Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes.</a> Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).</li>
<li>Hruban, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+intraepithelial+neoplasia%3A+a+new+nomenclature+and+classification+system+for+pancreatic+duct+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions.</a> Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+adenocarcinoma+patients+with+localised+chronic+severe+pancreatitis+show+an+increased+number+of+single+beta+cells%2C+without+alterations+in+fractional+insulin+area%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area.</a> Diabetologia. 52, 262-270 (2009).</li>
<li>Meier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).</li>
<li>Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreas+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The pancreas in human type 1 diabetes.</a> Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).</li>
<li>Veld, I. n't, P, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulitis+in+human+type+1+diabetes%3A+The+quest+for+an+elusive+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion.</a> Islets. 3, 131-138 (2011).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Standaardisatie van IHC-procedures is van cruciaal belang voor het imago van de analyse, met name bij het gebruik van computer-gebaseerde algoritmen in een groot aantal dia&#39;s in de tijd. De IHC kleuring procedure zoals beschreven in dit rapport zal batch analyse van de monsters een bepaalde donor met behulp van een Autostainer binnen een 8-urige werkdag en worden aangepast van een eerder verslag 5. Gedigitaliseerde hele dia&#39;s van elk glas dia&#39;s ter beschikking gesteld van nPOD-gelieerde onderzoeke...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 30% waterstofperoxide (H 2 O 2) </td><td> FisherScientific </td><td> H325-500 </td><td> Endogene peroxidase blokkeren </td></tr><tr><td> ABC-alkalische fosfatase (AP) </td><td> Vector </td><td> AK-5000 </td><td> AP conjugaat </td></tr><tr><td> Antibody Diluent </td><td> Invitrogen </td><td> 003218 </td><td> Primaire antilichamen </td></tr><tr><td> Avidine blocker </td><td> Vector </td><td> SP-2001 </td><td> Blokkeer endogene biotine </td></tr><tr><td> Gebiotinyleerd geit anti-cavia </td><td> Vector </td><td> BA-7000 </td><td> Secundair antilichaam </td></tr><tr><td> Blauwen Reagens </td><td> FisherScientific </td><td> 7301 </td><td> Leica autostainer </td></tr><tr><td> Citraat buffer, pH 6,0 </td><td> BioGenex </td><td> HK086-9K </td><td> Antigen retrieval </td></tr><tr><td> Nabezinker 1 </td><td> FisherScientific </td><td> 7401 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Cytoseal XYL </td><td> FisherScientific </td><td> 8312-4 </td><td> Dekglaasje inbedmiddel </td></tr><tr><td> DAB </td><td> Vector </td><td> SK-4100 </td><td> HRP chromogeen </td></tr><tr><td> Deeb </td><td> DAKO </td><td> S2003 </td><td> Endogene AP blokkerend reagens </td></tr><tr><td> Eosine Y Alcoholische </td><td> FisherScientific </td><td> 71204 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> Ethanolen-100%, 95%, 90%, 70% </td><td> FisherScientific </td><td> Diverse </td><td> Deparaffinization en afdekken </td></tr><tr><td> Hematoxylin </td><td> DAKO </td><td> S3301 </td><td> Dako Autostainer </td></tr><tr><td> Hematoxylin 7211 </td><td> FisherScientific </td><td> 7211 </td><td> Leica Autostainer </td></tr><tr><td> IgG (alle gastheren voor primaire antilichamen) </td><td> Diverse </td><td> Diverse </td><td> Negatieve controles voor primaries </td></tr><tr><td> Liquid Permanente Rood (LPR) </td><td> DAKO </td><td> K0640 </td><td> AP chromogeen </td></tr><tr><td> Mach2 AP </td><td> Biocare Medische </td><td> MALP521L </td><td> Geit anti-muis AP conjugaat </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare Medische </td><td> MHRP520L </td><td> Geit anti-muis HRP-conjugaat </td></tr><tr><td> Mach2 HRP </td><td> Biocare Medische </td><td> RHRP520L </td><td> Geit anti-muis HRP-conjugaat </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> FisherScientific </td><td> Diverse </td><td> H 2 O 2 verdunningsmiddel </td></tr><tr><td> Normaal geit serum </td><td> Vector </td><td> S-1000 </td><td> IHC blokkerend reagens </td></tr><tr><td> Scherpschutter </td><td> Biocare Medische </td><td> BS966M </td><td> IHC blokkerend reagens </td></tr><tr><td> TBST 20X </td><td> ThermoScientific </td><td> TA-999-TT </td><td> IHC buffer </td></tr><tr><td> Triology 20x </td><td> Cell Marque </td><td> 920P-06 </td><td> Antigen Retrieval </td></tr><tr><td> Xyleen </td><td> FisherScientific </td><td> Diverse </td><td> Deparaffinization en afdekken </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Reagentia. <table border="1"><tbody><tr><td> Primaire antilichamen </td><td> Gastheersoort </td><td> Verkoper </td><td> Cat. # </td><td> Commentaar en Antigen Retrieval </td></tr><tr><td> Paraffine </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amylase </td><td> Muis </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-46657 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Amylin </td><td> Muis </td><td> Serotec </td><td> MCA11267 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Koolzuuranhydrase 19,9 </td><td> Muis </td><td> Abcam </td><td> ab15146 </td><td></td></tr><tr><td> Caspase-3, gesplitst </td><td> Konijn </td><td> Cell Signaling </td><td> 9961 </td><td> Citraat of Trilogy </td></tr><tr><td> CD20 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0755 </td><td> Citraat of Trilogy </td></tr><tr><td> CD3 </td><td> Konijn </td><td> DAKO </td><td> A0452 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Muis </td><td> Cell Signaling </td><td> 3569 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CD4 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M7310 </td><td> Citraat </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> CD45 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0754 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CD68 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0876 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CD8 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M7103 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Chromogranine A </td><td> Konijn </td><td> DAKO </td><td> A0430 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CK17 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M7046 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CK19 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0772 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> CK7 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M7018 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> C-peptide </td><td> Konijn </td><td> Cell Signaling </td><td> 4593 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Foxp3 </td><td> Rat </td><td> e bio- </td><td> 14-4776-80 </td&gt; <td> Citraat </td></tr><tr><td> Ghreline </td><td> Geit </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-10386 </td><td></td></tr><tr><td> Ghreline </td><td> Konijn </td><td> Abcam </td><td> ab85104 </td><td></td></tr><tr><td> Glucagon </td><td> Konijn </td><td> DAKO </td><td> A0565 </td><td></td></tr><tr><td> Glucagon </td><td> Muis </td><td> Abcam </td><td> ab10988 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Glucagon </td><td> Cavia </td><td> Bachem </td><td> T-5037 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> GLUT-1 </td><td> Muis </td><td> Abcam </td><td> ab40084 </td><td> Trilogie </td></tr><tr><td> Glut-2 </td><td> Konijn </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-9117 </td><td> Niet in menselijke eilandjes </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Cavia </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Ki-67 </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M7240 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Mafa </td><td> Konijn </td><td> Novus Biologische </td><td> NB400-137A </td><td> Trilogie </td></tr><tr><td> Alvleesklier polypeptide </td><td> Konijn </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0043 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> PDX-1 </td><td> Cavia </td><td> Abcam </td><td> ab47308 </td><td> Citraat of Trilogy </td></tr><tr><td> Pro-insuline </td><td> Muis </td><td> Novocastra </td><td> NCL-www.proin-1G4 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-insuline </td><td> Muis </td><td> Developmental Studies Hybridoma Bank </td><td> GS-9A8 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Secretagogin </td><td> Konijn </td><td> Sigma </td><td> HPA 006641 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Glad spierweefsel actine </td><td> Konijn </td><td> Abcam </td><td> ab5694 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Somatostatine </td><td> Konijn </td><td> DAKO </td><td> A0566 </td><td></td></tr><tr><td> Synaptofysine </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0776 </td><td> Citraat </td></tr><tr><td> Fresh Frozen </td><td> Gastheersoort </td><td> Verkoper </td><td> Cat. # </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> Rat </td><td> Abcam </td><td> ab6332 </td><td> Bevestig met 4% PF </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> Konijn </td><td> Serotec </td><td> AHP1226 </td><td></td></tr><tr><td> CD25 </td><td> Muis </td><td> Novus Biologische </td><td> NB 600-564 </td><td> Gebruik overnacht incuberen paraffine secties </td></tr><tr><td> CD94 </td><td> Muis </td><td> Abcam </td><td> ab61874 </td><td> Bevestig met aceton </td></tr><tr><td> GAD65 </td><td> Muis </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-130569 </td><td> Bevestig met 4% PF </td></tr><tr><td> HLA-ABC </td><td> Muis </td><td> DAKO </td><td> M0736 </td><td> Bevestig met aceton of 4% PF </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Primaire antilichamen. <table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Aperio Scanscope CS </td><td> Aperio </td><td></td><td> Digitale diascanner </td></tr><tr><td> DAKO Autostainer Plus </td><td> DAKO </td><td></td><td> IHC vlekken </td></tr><tr><td> Label Matrix software voor het afdrukken </td><td> BioCarta </td><td> LM7UP57 </td><td> Slide label software </td></tr><tr><td> Leica XL Autostainer </td><td>Leica </td><td></td><td> H &amp; E vlekken </td></tr><tr><td> Premium dekglaasje </td><td> FisherScientific </td><td> 12 tot 548-5J </td><td> Dekglaasje </td></tr><tr><td> Spectrum Information Manager </td><td> Aperio </td><td></td><td> Scanner software </td></tr><tr><td> Superfrost Plus schuift </td><td> FisherScientific </td><td> 12-550-15 </td><td> Positief geladen dia&#39;s </td></tr><tr><td> Groentestomer </td><td> Black &amp; Decker </td><td> Diverse </td><td> Antigen retrieval </td></tr><tr><td> Zebra TLP 3742 </td><td> CDWG </td><td> TLP3742 </td><td> Slide labelprinter </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Specifieke voorraden en apparatuur.

kleuring protocols for human pancreatische eilandjes

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Schattingen van eilandje gebied en nummers en endocriene cellen samenstelling in de volwassen menselijke pancreas variëren van enkele honderdduizenden tot enkele miljoenen-en beta-massa bereiken 500 tot 1500 mg 1-3. Met deze bekende heterogeniteit, is een standaard verwerking en kleuring procedure ontwikkeld, zodat de pancreas regio&#39;s duidelijk waren omschreven en eilandjes gekarakteriseerd met behulp van strenge histopathologie en immunolocalization examens. Gestandaardiseerde procedures voor de verwerking van de menselijke alvleesklier hersteld van orgaandonoren zijn beschreven in deel 1 van deze serie. De alvleesklier wordt verwerkt in 3 grote regio&#39;s (hoofd, lichaam, staart), gevolgd door dwarsdoorsneden. Dwarsprofielen van de alvleesklier hoofd zijn verder onderverdeeld, zoals aangegeven op basis van grootte, en genummerd op alfabetische volgorde de onderafdelingen aan te duiden. Deze standaardisatie zorgt voor een volledige dwarsdoorsnede-analyse van het hoofd regio, waaronder de uncinate regio die bestaat uit eilandjes bevatvoornamelijk uit de pancreas polypeptide cellen naar de staart regio. Het huidige rapport bevat deel 2 van deze serie en beschrijft de procedures die worden gebruikt voor seriële snijden en histopathologische karakterisering van de pancreas paraffinecoupes met de nadruk op eilandje endocriene cellen, replicatie, en T-cel infiltreert. Pathologie van de pancreas secties is bedoeld om zowel de exocriene, ductular, en endocriene componenten te karakteriseren. De exocrine compartiment wordt onderzocht op de aanwezigheid van pancreatitis (actieve of chronisch) atrofie, fibrose en vetten, alsmede het kanalensysteem, vooral in verband met de aanwezigheid van pancreatische intraductal neoplasie 4. Eilandjes worden beoordeeld op morfologie, de grootte en dichtheid, endocriene cellen, ontsteking, fibrose, amyloid, en de aanwezigheid van replicerende of apoptotische cellen met behulp van H &amp; E en IHC vlekken. Het laatste onderdeel beschreven in deel 2 is de bepaling van de gebrandschilderde afbeeldings in gedigitaliseerde objectglaasje beelden. De gedigitaliseerde dia&#39;s worden georganiseerd door het geval en de alvleesklier regio in een online databank pathologie het creëren van een virtuele biobank. Toegang tot deze online collectie is momenteel aan meer dan 200 clinici en wetenschappers die betrokken zijn bij type 1 diabetes onderzoek. De online database biedt de mogelijkheid voor een snelle en volledige uitwisseling van gegevens en voor de onderzoekers om blokken voor paraffine of ingevroren seriële secties te selecteren.

Deze video demonstreert de procedures voor de karakterisering van humane pancreatische eilandjes met hematoxyline en eosine (H &amp; E) en immunohistochemie (IHC). Pancreas delen van het hoofd, lichaam en staart regio&#39;s worden gekleurd door zowel H &amp; E en IHC te eilandje endocriene samenstelling (insuline, glucagon, en pancreas polypeptide), cel-replicatie (Ki67) en inflammatoire infiltraten (H &amp; E, CD3) te bepalen. De uncinate regio is gelokaliseerd met behulp van IHC voor pancreas polypeptide.

Kleuring Protocols for Human pancreatische eilandjes

Schattingen van het eilandjesareaal, het aantal eilandjes en de endocriene celcompositie in de pancreas van de volwassen mens variëren van enkele honderdduizend tot enkele miljoenen en ...

Het algemene doel van deze procedure is het karakteriseren van menselijke pancreaseilandjes met behulp van hematoxyline- en eosinekleuring en immunohistochemie. Dit wordt bereikt door seriële coupes te maken van een pancreasmonster dat is ingebed in een paraffineblok. De coupes worden vervolgens in hun oorspronkelijke oriëntatie op objectglazen geplaatst.Een deel van de coupes wordt gekleurd met hematoxine en eosine, terwijl de resterende coupes via immunohistochemie worden gekleurd; de laatste stap is het scannen van de gekleurde coupes en het organiseren ervan per casus. Uiteindelijk kunnen deze beelden worden geüpload naar een online pathologiedatabase, waar ze kunnen worden bekeken door andere onderzoekers in het vakgebied. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de coupes in serie worden gekleurd met behoud van hun oorspronkelijke oriëntatie.De procedure wordt gedemonstreerd door Linda Snyder, histotechnoloog, Emily Montgomery, biologisch wetenschapper, en Tiffany Hippo, laboratoriumtechnicus in mijn laboratorium. Begin met het klaarmaken van het waterbad en de microtoom volgens de standaardprocedures voor paraffine-microtomie. L

staining-protocols-for-human-pancreatic-islets

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.

Een High-gehalte<em&gt; In Vitro</em&gt; Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform

Hier presenteren we de methodologie om belangrijke verbindingsbevattende poly(melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) microsferen te genereren en toe te dienen aan intacte muis-eilandjes in cultuur met daaropvolgende immunofluorescentie-analyse van β-cel proliferatie. Deze methode is geschikt voor het bepalen van de werkzaamheid van kandidaat β-cel mitogenen.

Aanhoudende toediening van β-cel mitogenen om Intact Mouse Islets<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Bioafbreekbare poly (melkzuur-co-glycolzuur) Microspheres

Ex vivo alvleesklier islet studies zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes. Bestaande technieken om te studeren van gekweekte eilandjes in hun oorspronkelijke 3-dimensionale architectuur zijn zelden gebruikte, tijdrovend en inefficiënt. Dit werk beschrijft een nieuwe, eenvoudige en efficiënte methode voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van hele gekweekte eilandjes.

Alvleesklier Islet insluiten voor paraffine secties

Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

Deze studie presenteert de toepassing van levende pancreasweefselplakken op de studie van eilandjesfysiologie en eiland-immuuncelinteracties.

Observeren van eilandjesfunctie en eiland-immuuncelinteracties in levende pancreasweefselplakken

Dit artikel presenteert een protocol voor gerichte differentiatie en functionele analyse van β-celachtige cellen. We beschrijven optimale kweekomstandigheden en doorgangen voor menselijke pluripotente stamcellen voordat insulineproducerende pancreascellen worden gegenereerd. De differentiatie in zes fasen vordert van definitieve endodermvorming naar functionele β-celachtige cellen die insuline afscheiden als reactie op glucose.

Geoptimaliseerd protocol voor het genereren van functionele insuline-afscheidende cellen van de alvleesklier uit menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor de aanschaf van een alvleesklier van varkens voor isolatie en zuivering van eilandjes.

Chirurgische perfusie en isolatie van de alvleesklier van varkens voor isolatie van eilandjes

Deze studie maakt gebruik van multi-kleuring fluorescentie-gebaseerde markers van celdood en apoptose in combinatie met confocale microscopie om cytokine-geïnduceerde apoptose en β-celspecifieke dood in pancreaseilandjes te beoordelen. Het onthult ruimtelijke en temporele veranderingen in celdood en apoptose als reactie op extracellulaire stimuli.

Geïsoleerde behandeling van pancreaseilandjes en meting van apoptose

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Leer hoe je menselijke pancreaseilandjes karakteriseert met H&E-kleuring en immunohistochemie. Deze methode beoordeelt endocriene samenstelling, celreplicatie en ontstekingsinfiltraten voor diabetesonderzoek.

Kleuring Protocols for Human pancreatische eilandjes

Meer video's verkennen