Name: Analyse van de Single-cell gentranscriptie door RNA TL In Situ Hybridisatie (FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Leer FISH-analyse van mRNA-transcripten in individuele cellen van Plasmodium falciparum-geïnfecteerde erytrocyten. Deze methode onthult polygene transcriptie-activiteit en helpt bij het begrijpen van malariaparasieten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Michael Alifrangis en Ulla Abildtrup bedanken voor genotypering van parasieten en Christina Holm voor een uitstekende technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door Howard Hughes Medical Institute (subsidie ​​55005511), De Lundbeck Foundation (subsidie ​​R9-A840) en door het Niels Bohr Foundation.

1. Generatie van Vers Geselecteerde geïnfecteerde erythrocyten Voor deze test worden de beste resultaten verkregen met vers geselecteerde cultures voor oppervlakte-expressie van PfEMP1 eiwit. In dit experiment de 3D7 P. falciparum lineage is geselecteerd met specifieke antilichamen zoals eerder beschreven 1. Dag 1 <ol><li> Oogst 200 ul gepakte bloedcellen van een P. falciparum cultuur met 2-5% late stadium IE door centrifugeren bij 800 g gedurende 8 min bij kamertemperatuur. </li><li> Het bloed pellet resuspendeer in 2 ml van 37 ° C warm 0,75% gelatine-oplossing in een 14 ml steriele buis en gedurende 15-20 min bij 37 ° C laat de geïnfecteerde en ring-stadium IE het sediment mogelijk. </li><li> Oogst de late-fase IE, dwz de bovenste fase, in een nieuwe 14 ml tube en was tweemaal met 10 ml van 37 ° C warm RBC-wash media. </li><li> Verdun 50 pi specifieke anti-PfEMP1-antilichamen in 2 ml van 37 ° C warm RBC-wasmedia en steriele filter. </li><li> Meng de gewassen laat stadium IE met het gesteriliseerde verdunde antisera in een 14 ml steriele buis en incubeer 30 min bij 37 ° C onder zacht schudden. </li><li> Spin down bij 800 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur, en was tweemaal met 10 ml van 37 ° C warm RBC-wasmedia. </li><li> Wassen 50 ul Proteïne A Dynabead suspensie tweemaal met RBC-wasmedia met een DynaMaq-15 magneet. </li><li> Resuspendeer de Dynabeads in 300 ul RBC-wash media en voeg ze toe aan de gewassen in een laat stadium IE. Incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C onder zacht schudden. </li><li> Breng de buis aan de DynaMaq-15 magneet. Laat gedurende 1-2 minuten en verwijder al het vocht. </li><li> Resuspendeer de Dynabeads in 4-5 ml RBC-wash media. Breng de buis terug naar de magneet en laat het 1-2 min voor het verwijderen van alle vloeistof. Herhaal deze wasstap. </li><li> Breng de gewassen kralen aan een 25 cm 2 steriele cultuur fLask met 200 ul vers verpakte rode bloedcellen. Voeg 5 tot 6 ml Albumax media in de cultuur. Bewaar nacht bij 5% CO2 bij 37 ° C. </li></ol> Dag 2 <ol start="12"><li> Verwijder de Dynabeads uit de cultuur als de geselecteerde IE heeft het verse rode bloedcellen reinvaded door al de cultuur om een ​​14 ml steriele buis. Zet de tube op de DynaMaq-15 magneet en laat 1-2 minuten. Vervolgens giet al het vocht terug naar een cultuur kolf. </li><li> Cultuur voor zo weinig cycli als mogelijk tot een parasitemie van 5-10% en parasieten zijn bij de ringstage. </li><li> IE moet worden geanalyseerd door FACS om ervoor te zorgen dat de juiste oppervlakte fenotype, dat wil zeggen eiwitexpressie van een van beide PFD1235w and/orPF11_0008 is een verkregen. </li></ol> 2. Bereiding van Probes De antisense RNA probes werden gegenereerd uit de variabele gebieden van de PFD1235w en PF11_0008 var &lt;/ Em&gt; genen van P. falciparum 3D7 genomisch DNA. DNA werd geamplificeerd door PCR en gekloneerd in de vector pSPT18 of 19 voor transcriptie, respectievelijk volgens de door de fabrikant (Roche). De probes (580 baseparen (bp) en 590 bp in lengte) worden gemerkt met digoxigenine (DIG) of biotine met een DIG RNA labeling Kit of Biotin RNA labeling Mix respectievelijk. We bevestigden de specificiteit van de probes zowel Northern blot analyses en enkelvoudige FISH analyse 1. 3. Dunne Smear en fixatie van parasieten Voorafgaand aan in situ hybridisatie Dag 1 Alle stappen worden uitgevoerd in een RNase-vrije omgeving en de reagentia RNase-vrij of voorbehandeld met diethylpyrocarbonaat (DEPC) of RNase Zap (Invitrogen). De dia&#39;s en dekglaasjes moet worden gereinigd met alcohol om de resterende productie-vet te verwijderen. Het is belangrijk om het protocol te voeren zonder pauze tussen de stappenom het risico van verontreiniging te minimaliseren nuclease. <ol><li> Maak een dunne bloed film van de standaard verspreiden methode 3. Met behulp van de 100x olie objectief van de microscoop, de telling van de IE en bereken het percentage van IE in de cultuur. Controleer of de parasiet stadia zijn bij benadering synchroon in de ring en vroege stadia van de trofozoiet IE cyclus. Dit zijn de pre-replicatie, uni-kiemen fasen expressie var gen mRNA en geschikt voor cel transcriptie FISH assays van dit type. </li><li> Breng 50 pl van de parasiet cultuur op parasitemie van 5-10%, met een 1,5 ml RNase-vrij Eppendorf buis. Centrifugeer gedurende 1 min bij 2.000 rpm bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de media en voeg 50 ul PBS pH 7,2 in DEPC-behandeld water. Voorzichtig Schud de buis. Tweemaal herhalen centrifugale sedimentatie stap om de cellen vrij van media en celresten wassen. </li><li> Maak vier goede kwaliteit dunne strepen. Voor elke uitstrijkje, maak een uitstrijkje opeen diameter van 11 mm en een 4 goed glijbaan, dat wil zeggen vier glazen dia&#39;s in totaal, in een RNase-vrij kap (een kritische stap). Golf glijdt kort in de lucht te drogen. Maak drie extra geleiders voor negatieve controles een dia-sonde kleuring voor andere irrelevante gen met een bepaalde probe, een glijbaan voor RNase behandeling en een derde dia met IE niet het gen van belang. Laat de dia&#39;s om op de bank te drogen gedurende 10-20 minuten. </li><li> Bevestig de dunne films door 60 pi fixatie oplossing die 4% paraformaldehyde en 5% ijsazijn in de putjes. Laat 10 min op de bank bij kamertemperatuur. </li><li> Was de dia&#39;s in 2x SSPE buffer gedurende 5 min door voorzichtig schudden bij kamertemperatuur. Kort te verwijderen overtollige vloeistof door het aanraken van de putjes die de cellen voorzichtig met een papieren zakdoek. </li><li> Bedek de slides met 0,01% pepsine in 0,01 M HCl gedurende 2 minuten bij 37 ° C (een kritieke stap). Was de dia&#39;s in 2x SSPE gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Verdun de RNase oplossing tot een eindconcentratie van 10 ug / ml. Het negatieve controle uitstrijkjes met 60 ul van de RNase oplossing. Incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C en vervolgens het wassen van de objectglaasjes in 2x SSPE gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Zich onmiddellijk de hybridisatiestap. </li></ol> 4. Hybridisatie van RNA probes aan de gefixeerde glaasjes Dag 1 <ol><li> Bereid de hybridisatie kamer, zoals een ThermoStar 100 HC4 of een lege pipet tip box in een schone oven, door te besproeien met RNase Zap en af ​​te vegen schoon met een papieren zakdoek. Vul de kanalen van de hybridisatie kamer of de bodem van de doos met DEPC behandeld water te zorgen dat de dia niet uitdrogen tijdens hybridisatie. Sluit de tank af en verwarm tot 48 ° C. </li><li> Verdun de probes in de hybridisatie-oplossing tot een eindconcentratie van 12 ng / pl. Denaturatie van de probe-oplossing bij 65 ° C gedurende 5 min in een verwarmingsblok. Onmiddellijk koelen op ijs. </li><li> Kort aan de lucht drogen de dia&#39;s na de 2x SSPE wassen. Verwijder voorzichtig overtollige vloeistof rond de putten met een papieren zakdoek. </li><li> Open de hybridisatie kamer en plaats de dia&#39;s in de kamer. Een of beide probes in een totaal volume van 60 ul per putje. Voorzichtig dekking van de vloeistof druppel met een RNase-vrij dekglas met behulp van steriele pincet. </li><li> Sluit de tank en de dia hybridiseren bij 48 ° C gedurende ten minste 16 uur &#39;s nachts. </li></ol> 5. Antilichaam Vervoeging en Fluorescentie Amplification Dag 2 De volgende stappen zijn gebaseerd op de TSA Plus System Fluorescence Palette van Perkin Elmer. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. <ol><li> Was de dia 3 keer in TNT buffer gedurende 5 minuten onder zacht schudden. </li><li> Blokkeren putjes in 150 ul TNB buffer gedurende 30 min. </li><li> Verdun het HRP-geconjugeerd α-DIG antilichaam in TNB buffer bij een verhouding van 1:100 en het HRP-geconjugeerd α-biotine antilichaam in TNB buffer, in een verhouding van 1:500. Verwijder overtollig TNB buffer van de dia&#39;s met een papieren zakdoek. Bij het detecteren van gelijktijdig twee transcripten, kunnen beide antilichamen meteen gaan. Breng een totale hoeveelheid van 100 ui van het antilichaam-TNB oplossing per putje en zorgvuldig bedekken met een dekglas. Incubeer de glaasjes gedurende 2 uur. </li><li> Verwijder de dekglaasjes. Was de dia&#39;s in TNT buffer 3 keer gedurende 5 minuten. </li><li> Verdunnen FITC-fluorofoor in de tyramide versterkingsreagens in een verhouding van 1:500 en breng 100 ui van de oplossing aan elk putje. Bedek de putten met dekglaasjes en incubeer gedurende 12 minuten. </li><li> Verwijder de dekglaasjes en was de dia&#39;s 3 keer gedurende 5 minuten in TNT buffer door voorzichtig schudden. </li><li> Verdunnen Cyan3-fluorofoor in de tyramide versterkingsreagens in een verhouding van 1:500. Voeg 100 pl peren van deze oplossing. Bedek de putten met dekglaasjes en incubeer gedurende 12 minuten. </li><li> Verwijder het deksel glijdt zorgvuldig en vervolgens snel spoel de glaasjes door onderdompeling in TNT buffer. </li><li> Was de dia 3 keer met TNT buffer gedurende 5 minuten. </li><li> Quickly dompel de dia&#39;s in DEPC-behandeld water. </li><li> Laat de dia&#39;s aan de lucht drogen. Monteer de dia&#39;s met anti-fade reagens dat DAPI. Sluit de hoeken van de dekglaasjes met nagellak. </li><li> De dia&#39;s zijn nu klaar voor microscopie. Houd de glaasjes afgedekt met aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C indien het experiment moet worden ingevuld de volgende dag. Een volledige afdichting van de zijden van de schuiven kan worden uitgevoerd 24 uur na het aanbrengen van de anti-fade reagens. Hierdoor kan de dia te beelden tot een week na de protocol is voltooid. </li></ol> 6. Visualisatie van gehybridiseerd Probes <ol><li> Zet de microscoop. Een standaard immunofluorescentie microscoop is sufficient voor dit soort experiment, maar als je toegang hebt tot een confocale microscoop kunt u ook gebruiken voor 3D-beelden of om video&#39;s van je gekleurde cellen te verkrijgen. Laat microscoop op te warmen voor 15-30 min. Schakel de computer en de software. </li><li> De kwaliteit van de vlekken op de immunofluorescentie microscoop. Kies een plek met een paar parasieten. </li><li> Handmatig de winst van elke laser. Stel de pixelverblijftijd van 4-6 m -1 s -1 en de stappen tot 512 x 512 pixels. </li><li> Neem een ​​testfoto met behulp van Frame Lambda. Stel de laser te krijgen. </li><li> Neem een ​​minimum van 20 goede foto&#39;s van fluorescerende enkele cellen. Tenminste 2-5 beelden van een veld met 5-20 parasieten nodig zijn een waarheidsgetrouw overzicht van het percentage positieve parasieten verkrijgen. </li></ol>

<ol><li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheeseborough%2C+M+%22District+Laboratory+Practice+in+Tropical+Countries%22">District Laboratory Practice in Tropical Countries</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (2006).</li>
<li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117(2009).</li>
<li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li>
<li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li>
<li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li>
<li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li>
<li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li>
<li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

RNA FISH analyse, in tegenstelling tot werkwijzen zoals Northern blotting en RT-PCR, maakt onderscheid specifieke mRNA transcripten in de enkele cel. Dit maakt het mogelijk onderscheid te maken tussen transcriptioneel actieve en inactieve cellen, in dit voorbeeld, P. falciparum parasitaire protozoa in menselijke rode bloedcellen. Dergelijke whole-cell waarnemingen zijn vaak nodig en kunnen ontrafelen belangrijke en nieuwe transcriptionele patronen 1. Hoewel andere RNA FIS...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Azijnzuur </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax media: RPMI 1640 Glutamine oplossing </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 5 ml oplossing glutamine </td></tr><tr><td> Albumax media: gentamicinesulfaat Albumax-oplossing </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml gentamicinesulfaat 50 ml Albumax-oplossing </td></tr><tr><td> Albumax-oplossing: Hypoxanthine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g Hypoxanthine </td></tr><tr><td> Albumax-oplossing: AlbuMAX II </td><td> Iknvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-oplossing: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 liter RPMI 1640 Los met magneet bij max. 50 ° C. Filter steriliseer en bewaar bij -20 ° C in porties. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Hars formamide deioniseren. </td></tr><tr><td> Anti-biotine geit pAb peroxidaseconjugaat </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DIG antistof </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fade reagens met DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> De fixeermiddelen moet gedurende 24 uur uitharden voordat de dia volledig afdichten. </td></tr><tr><td> Biotine RNA Labeling Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Camera digitale </td><td> Nikon digitale zicht DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dekglaasjes </td><td> Menzel-Glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> cultuur fles 25 cm 2 Nunclon oppervlak </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32490-100ml </td><td> 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Voeg een roerstaaf en roer gedurende 12 uur. Autoclaaf gedurende 30 minuten. </td></tr><tr><td> Digitale camera </td><td> Nikon digitale zicht DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteïne A Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Magneet </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formamide bioultra 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Gedeïoniseerd formamide: 5 g ionenwisselaar per 100 ml formamide. Roer 30 min. Filtreer over Whatman papier. </td></tr><tr><td> . Gelatine 0 75% oplossing: Gelatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Verwarm tot 56 ° C op te lossen. Filter steriliseren wanneer 56 ° C. Bewaren bij -20 ° C in porties. </td></tr><tr><td> . Gelatine 0 75% oplossing: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Verwarm tot 56 ° C op te lossen. Filter steriliseren wanneer 56 ° C. Bewaren bij -20 ° C in porties. </td></tr><tr><td> Glutamine oplossing: L-glutamine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g L glutamine in 500 ml 0,9% NaCl. Los, filter sterilize en bewaar bij -20 ° C in porties. </td></tr><tr><td> Glutamine oplossing: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g L glutamine in 500 ml 0,9% NaCl. Los, filteren steriliseer en bewaar bij -20 ° C in porties. </td></tr><tr><td> Hybridisatie-oplossing: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Totaal 20 ml, blijven bevroren bij -20 ° C in porties 10 ml gedeïoniseerd formamide </td></tr><tr><td> Hybridisatieoplossing: 50x Denhardt&#39;s concentraat </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> Hybridisatieoplossing: Gist tRNARoche blokkerend reagens </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt&#39;s 250 pl 20 mg per ml gist tRNA </td></tr><tr><td><sTrong&gt; hybridisatie-oplossing: zalmsperma DNA </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4g Roche blokkerend reagens 1 ml van 10 mg per ml zalmsperma DNA (Critical: denatureren zalm spermDNA bij 96 ° C gedurende 5 min voor het toevoegen aan de hybridisatieoplossing) </td></tr><tr><td> Veredelaar ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Kan vervangen worden door hybridisatie oven en RNase vrij hybridisatie kamers opgevuld met DEPC water. </td></tr><tr><td> Immersie-olie UV transparant fluorescentie gratis </td><td> Sigma </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Immunofluorescentie of confocale microscoop </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nagellak </td><td> Verkrijgbaar in elke drogist </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20x PBS: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2PO 4 DEPC gedeïoniseerd H 2 O </td><td></td><td></td><td> Ajust pH tot 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4% </td><td> Fluka / Chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA in 80 ml PBS / DEPC. Verwarm tot 65 ° C totdat de PFA oplost. Voeg 20 ml PBS, laat de oplossing afkoelen. Breng de pH op 7,4. Filter. Store in aliquots bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde 4% / Acid azijnzuur 5% </td><td></td><td></td><td> 950 ul paraformaldhyde + 50 pl Azijnzuur </td></tr><tr><td> Pepsine </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Peroxidase-geconjugeerd anti-biotine </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine oplossing </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 5 ml oplossing glutamine </td></tr><tr><td> RBC-wash media: gentamycinesulfaat </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml gentamicinesulfaat </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Een 10 mg / ml voorraadoplossing. </td></tr><tr><td> RNase vrij 1,5 ml tube </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Slides 4 putten 11mm </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 Na3 citraat x H 2 O (88 g / l) pH 7,0 met 1 M HCl </td></tr><tr><td> SSC 20x: Natriumcitraat uitdrogen </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 Na3 citraat x H 2 O (88 g / l) pH 7,0 met 1 M HCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g NaH 2PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA poeder </td><td></td><td></td><td> 9,4 g EDTA poeder Voeg DEPC water toe, breng de pH 7,4. Autokliefde gedurende 20 min </td></tr><tr><td> TNB buffer: TNT buffer </td><td></td><td></td><td> 10 ml TNT buffer </td></tr><tr><td> TNB buffer: Het blokkeren van reagens </td><td></td><td></td><td> 0,05 g blokkerend reagens Om het blokkerend reagens ontbinden Verwarm de oplossing tot 60 ° C gedurende een uur onder roeren. Bewaren bij -20 ° C. (Afgeleid van de Perkin Elmer TSA-protocol.) </td></tr><tr><td> TNT buffer: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> TNT buffer: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT buffer: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Breng de pH op 7,5 bij kamertemperatuur. (Afgeleid van de Perkin Elmer TSA-protocol.) </td></tr><tr><td> TSA plus Cyanine3 / fluoresceïne-systeem </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Lees aandachtig het protocol van de TSA Plus Fluorescentie Palet systeem voordat het experiment. </td></tr><tr><td> Buizen 14 ml steriel </td><td> Almeco - CM LAB Aps </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van de single-cell gentranscriptie door rna tl<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie (fish)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Hechting van Plasmodium falciparum geïnfecteerde erythrocyten (IE) om humane endotheliale receptoren tijdens malariabesmettingen wordt gemedieerd door expressie van PfEMP1 eiwitvarianten gecodeerd door de genen var. De haploïde P. falciparum genoom herbergt ongeveer 60 verschillende var genen waarvan slechts een is verondersteld te transcriberen per cel tegelijk in het bloed stadium van de infectie. Hoe dergelijke elkaar uitsluitende regulatie van var gentranscriptie wordt bereikt is onduidelijk, evenals de identificatie van de individuele var genen of subgroepen van var genen geassocieerd met verschillende receptoren en het gevolg van differentiële bindend zijn voor de klinische uitkomst van P. falciparum infecties. Onlangs heeft de transcriptie elkaar uitsluitende paradigma is in twijfel getrokken door transcriptie assays gebaseerd op individuele P. falciparum transcript identificatie in enkele infected erytrocytaire cellen met behulp van RNA fluorescente in situ hybridisatie (FISH) analyse van var gentranscriptie door de parasiet in individuele kernen van P. falciparum IE 1. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van de RNA-FISH methode voor de analyse van var gentranscriptie in enkele kernen van P. falciparum geïnfecteerde humane erythrocyten. De methode is gebaseerd op het gebruik van digoxigenine en biotine-gelabelde antisense RNA probes met de TSA Plus Fluorescence Palette System 2 (Perkin Elmer), microscopische analyse en vers geselecteerd P. falciparum IE. De in situ hybridisatie methode kan worden gebruikt om transcriptie en regulering van een aantal genen die tijdens de verschillende fasen van het P. toezicht falciparum levenscyclus en is aanpasbaar aan andere malariaparasiet soorten en andere organismen en celtypes.

Figuur 1 toont een stroomschema van de belangrijkste stappen en de tijdsduur van de RNA FISH methode. Een reeks van representatieve beelden van goed en slecht bewaard gebleven gebrandschilderde mRNA FISH experimenten met behulp van enkele P. falciparum IE worden getoond in Figuur 2. Deze intracellulaire protozoaire heeft een klein (1-1,5 micrometer diameter) kern, die is blauw gekleurd met DAPI. Vierentwintig uur na erytrocyten invasie in P. fal...

Fluorescerende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) om mRNA transcripten in individuele cellen te identificeren maakt analyse van polygene activiteit zoals de gelijktijdige transcriptie van meer dan een lid van de<em&gt; Var</em&gt; Multigenfamilie in<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Geïnfecteerde erythrocyten<sup&gt; 1</sup&gt;. De techniek is aanpasbaar en kan gebruikt worden op verschillende genen, cellen en organismen.

Analyse van de Single-cell gentranscriptie door RNA TL<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH)

De adhesie van door Plasmodium falciparum geïnfecteerde erytrocyten (IE) aan menselijke endotheliale receptoren tijdens malariainfecties wordt gemedieerd door de expressie van PfEMP1-eiwitvarianten die worden gecodeerd door de var-genen. Het haploïde P. falciparum-genoom bevat ongeveer 60 verschillende var-genen, waarvan tot voor kort werd aangenomen dat er slechts één per cel tegelijkertijd wordt getranscribeerd tijdens het bloedstadium van de infectie. Hoe een dergelijke wederzijds exclusieve regulatie van de var-gentranscriptie wordt bereikt, is onduidelijk, evenals de identificatie van individuele var-genen of subgroepen van var-genen die geassocieerd zijn met verschillende receptoren en de consequentie van differentiële binding voor de klinische uitkomst van P. falciparum-infecties. Onlangs is het paradigma van wederzijds exclusieve transcriptie in twijfel getrokken door transcriptie-assays gebaseerd op de identificatie van individuele P. falciparum-transcripten in enkele geïnfecteerde erytrocytaire cellen middels RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)-analyse van var-gentranscriptie door de parasiet in individuele kernen van P. falciparum IE1. Hier presenteren wij een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van de RNA-FISH-methodologie voor de analyse van var-gentranscriptie in enkelvoudige kernen van door P. falciparum geïnfecteerde menselijke erytrocyten. De methode is gebaseerd op het gebruik van digoxigenine- en biotine-gelabelde antisense RNA-probes met behulp van het TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopische analyses en vers geselecteerde P. falciparum IE. De in situ hybridisatiemethode kan worden gebruikt om de transcriptie en regulatie van diverse genen te monitoren die tot expressie komen tijdens de verschillende stadia van de P. falciparum-levenscyclus en is aanpasbaar voor andere malariaparasietsoorten en andere organismen en celtypen.

Mijn naam is Elena Rand en ik werk bij het Center for Medical Pathology aan de Universiteit van Kopenhagen in Denemarken. Hier werken ongeveer 60 mensen uit verschillende delen van de wereld aan malaria. Onze groep werkt met plasmodium foci-parasieten.Dit zijn de meest virulente soorten die malaria bij mensen veroorzaken. De parasieten brengen oppervlakte-eiwitten tot expressie met diverse functies, zoals adhesie aan gastheercellen. De grootste groep adhesie-eiwitten zijn de zogenaamde Plasmodium falciparum erythrocytenmembraaneiwitten 1, oftewel PfMP1.Er bestaan ten minste 60 varianten waarvan voorheen werd aangenomen dat er tijdens het bloedstadium van de infectie slechts één per cel werd getranscribeerd. Op onze afdeling geloven we dat er in de parasieten meer dan één eiwit gelijktijdig getranscribeerd kan worden. Eén methode om deze activiteit aan te tonen is mRNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).Hier presenteren wij een op maat gemaakte methode voor de detectie van mRNA, transcripten van twee verschillende genen in een enkele nucleus van odum FCI-geïnfecteerde erytrocyten. De methode takes twee dagen om te voltooien. De eerste dag omvat de preparatie van RNA-probes, het toevoegen hiervan aan de gefixeerde parasieten op glasplaatjes en hybridisatie overnacht.De tweede dag omvat het verzamelen van antilichamen, fluor-amplificatie en visualisatie van de gekleurde parasieten in een confocale microscoop. Ter overzicht van het experiment wordt een stroomschema van de handelingen getoond, samen met de kritieke reagentia en materialen die in het experiment zijn gebruikt. RNAs zap dig labeling kit biotin, RNA, labeling mix, paraformaldehyde, glaciaal azijnzuur, pepin anti dig antilichaam, anti biotin antilichaam, TSA PL plus fluorescentie-paletsysteem, DPI RNAs, free microbuisjes, ETH ethanol, gewiste glasplaatjes, geautoclaveerde dekglasjes, steriele instrumenten zoals scharen en pincetten, een glazen koppelpot.De geïnfecteerde erytrocyten moeten worden gecontroleerd via Giemsa-kleuring om er zeker van te zijn dat ze zich in het juiste ontwikkelingsstadium bevinden. Dit betekent dat de ringstadia die VAR transcriberen, gesynchroniseerd en in goede conditie moeten zijn. Het is cruciaal om het exacte ontwikkelingsstadium van de levenscyclus te kiezen waarin de transcriptie plaatsvindt.Aangezien individuele RNA-soorten gefaseerd zijn, specifiek worden getranscribeerd en snel worden afgebroken, moeten de cellen voorzichtig worden gewassen voordat er zeer hoogwaardige, dunne bloeduitstrijkjes op schone glazen objectglazen worden gemaakt; een gelijkmatige monolaag van geïnfecteerde rode bloedcellen op het objectglas wordt vervolgens gedurende 10 minuten gefixeerd in een oplossing van 4% paraformaldehyde en 5% glaciaal azijnzuur. Daarna worden de objectglazen twee keer gewassen in PBS en wordt de vloeistof voorzichtig met het weefsel van de glazen verwijderd. Permeabiliseer vervolgens de cellen met een voorverwarmde 10 millimolaire zoutzuuroplossing voordat de Pepsi wordt toegevoegd.Incubeer dit gedurende twee minuten bij 37 °C voorafgaand aan de hybridisatie. De probes worden gedenatureerd bij 65 °C gedurende vijf minuten, snel afgekoeld op ijs en vervolgens toegevoegd aan de cellen, die inmiddels zijn gefixeerd op het glazen objectglas. Plaats een dekglas bovenop de cellen en verwijder eventuele luchtbellen met een kleine pipetpunt. Bevochtig de hybridisatiekamer door druppels dubbel gedestilleerd water aan de rand van de kamer toe te voegen, zodat de objectglazen in de kamer vochtig blijven.Plaats tijdens de hybridisatieprocedure de glazen objectglazen in de kamer en hybridiseer deze gedurende de nacht bij 48 °C. Na 16 tot 17 uur hybridisatie worden de objectglazen voorzichtig uit de hybridisatiekamer verwijderd. Vanaf deze stap is een RNAse-vrije omgeving niet langer strikt noodzakelijk.Was de objectglazen in een glazen pot gevuld met TNT-buffer, waarbij u ervoor zorgt dat de dekglasjes loslaten van het objectglas. Herhaal de wasprocedure drie keer en blokkeer ze vervolgens een half uur in TNB-buffer. Voeg de HRP-geconjugeerde anti-dig of anti-biotine gelabelde antilichamen toe aan de cellen.Beide typen gelabelde antilichamen kunnen gelijktijdig worden toegevoegd. Als het experiment bedoeld is om twee mRNA-transcripten in de cellen te detecteren, moeten de antilichamen vooraf worden verdund. Incubeer gedurende één tot twee uur in TNB-buffer, was drie keer met TNT-buffer en voeg vervolgens één fluorochroom toe aan de gewassen cellen, een verdunde FSE of cyaan.Drie oplossingen moeten vers worden bereid. Vanaf deze stap is het belangrijk om de objectglazen niet direct aan sterk licht bloot te stellen. Incubeer de objectglazen 10 tot 15 minuten met het fluorochroom.Indien er na de eerste incubatie twee mRNA-transcripten worden gedetecteerd, spoel dan de eerste kleurstof uit en voeg de tweede toe. Voer een laatste wasbeurt uit in TNT-buffer. Dompel de slides in dubbel gedestilleerd water voordat ze aan de lucht worden gedroogd.Voeg de druppel toe en plaats een dekglas bovenop het preparaat. Verwijder eventuele luchtbellen en verzegel de randen van het dekglas met sneldrogende nagellak. Hier zien we een enkele geïnfecteerde erytrocyt die één parasiet bevat.Het blauw, de DPE, vertegenwoordigt het DNA van de parasiet, en het groen vertegenwoordigt het mRNA van één gen dat wordt getranscribeerd. In de andere afbeelding vertegenwoordigt de rode kleur het mRNA van het andere gen, en in de derde afbeelding kunnen we de dubbele kleuring van beide gentranscripties zien. De afbeeldingen onthullen ook dat de gebonden mRNA's zijn geprojecteerd op het nucleaire DNA en over het algemeen niet erbovenop of ernaast liggen.In 99% van de geïnfecteerde erytrocyten kunnen we het mRNA van twee genen detecteren dat wordt getranscribeerd. Een belangrijk aspect van dit experiment is het controleren of de probes niet aan andere genen binden. In deze afbeelding hebben we de geïnfecteerde erytrocyten met beide probes geïncubeerd, maar slechts één probe bindt aan IE. De andere genen worden hier niet getranscribeerd.Deze situatie is omgekeerd op deze andere afbeeldingen in de gevisualiseerde geïnfecteerde erytrocyten. De odium phos palm-parasieten hebben over het algemeen goed bewaard gebleven membranen met een duidelijk gedefinieerde kleuring van zowel DNA als RNA. Als de cellen om welke reden dan ook van slechte kwaliteit zijn, zal de kleuring ook verslechteren.Zoals in deze afbeelding te zien is, zullen het DNA en het RNA diffuus, troebel en relatief ongedefinieerd verschijnen. Tot slot kan worden gesteld dat deze methode eenvoudig kan worden toegepast op andere bloedparasieten. Onze transcriptiegegevens zijn bovendien ondersteund door experimenten om de vertaalde eiwitten van de geanalyseerde mRNA's te detecteren met behulp van specifieke antilichamen gericht tegen de op het oppervlak tot expressie gebrachte pf EMP one-eiwitten op geïnfecteerde cellen.

analysis-single-cell-gene-transcription-rna-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Door het combineren van methoden voor RNA whole...

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie in Hele Mount Embryo&#39;s en histologie Aangepast voor Marine kraakbeenvissen

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren...

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) maakt de detectie van nucleïnezuren in hun eigen omgeving binnen cellen. We beschrijven hier een protocol voor gecombineerde, gelijktijdige detectie van RNA en DNA door middel van FISH, die kan worden gebruikt om X-chromosoom inactivatie in muis embryonale stamcellen.

Gecombineerde DNA-RNA-TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) aan X-chromosoom inactivatie studeren in Gedifferentieerde vrouwelijke muis embryonale stamcellen

Trofoblastische reuzencellen (TGC's) spelen een sleutelrol in de placenta om een gezonde zwangerschap te garanderen. We presenteren een protocol voor het beoordelen van de transcriptionele status van genen in TGC's door middel van nascent fluorescente in situ hybridisatie op cryostaat secties van post-implantatie embryo's of kortdurende culturen van ectoplacentale kegels op embryonale dag 7.

Transcriptionele Analyse van ontluikende RNA FISH van<em&gt; In Vivo</em&gt; Trofoblast Giant Cells of<em&gt; In Vitro</em&gt; Korte termijn culturen van Ectoplacental Cone Explantaten

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is een methode om niveaus en lokalisatie van specifieke RNA's op het niveau van één cel nauwkeurig te kwantificeren. Hier rapporteren we onze gevalideerde laboratoriumprotocollen voor natte-bench verwerking, beeldvorming en beeldanalyse voor eencellige kwantificering van specifieke RNA's.

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

Leer FISH-analyse van mRNA-transcripten in individuele cellen van Plasmodium falciparum-geïnfecteerde erytrocyten. Deze methode onthult polygene transcriptie-activiteit en helpt bij het begrijpen van malariaparasieten.

Analyse van de Single-cell gentranscriptie door RNA TL

Meer video's verkennen