Name: Eiwit misfolding Cyclische Versterking van prionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer de PMCA-techniek voor het versterken van prionstammen in vitro met behulp van hamsterhersenweefsel. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van prionconversie en het ontwikkelen van detectiemethoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Dr Vesper Fe Marie Ramos bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06 RR17417-01 en G20RR024001) en het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (2R01 NS052609).

1. Voorbereiden van de Apparatuur <ol><li> Gebruik Misonix 3000 of 4000 Misonix sonicator (Farmingdale, NY) verbonden met een Thermo Electron Neslab EX-7 waterbad (Newington, NH) om een ​​constante temperatuur te houden van 37 ° C. Sonificeer de monsters in 200 ul dunwandige buis PCR strips met gewelfd deksel verkregen Thermo Scientific (Waltham, MA). </li><li> Een gloednieuwe sonicator vereist een &quot;break-in&quot;-periode van continue werking 9. Een twee maanden break-in periode bestaat uit een 40-sec sonificatie burst en 10 minuten incubatie cycli met de amplitude ingesteld op 10. Men moet opmerken erosie gehele oppervlak van de microplaat titanium hoorn (Figuur 1, panel B). Het circulerende water ziet er wit troebel als gevolg van erosie van de titanium microplaat hoorn. Dagelijks te vervangen dit water. </li><li> De amplificatie van PrP Sc varieert gedurende de microplaat hoorn. De beste PrP Sc amplificatie-efficiëntie kan bekomen wordeneen straal van 5 cm van het midden van de microplaat hoorn (zie figuur 1, paneel C). </li><li> Een ronde van PMCA bestaat 144 cycli. Elke cyclus bestaat uit 5 sec sonicatie en 10 min incubatie. Dit zal ongeveer inhouden tot 24 uur per ronde van PMCA. </li><li> Het vermogen van sonicatie op het bedieningspaneel van de sonicator paneel, varieert met het aantal PCR-buizen in de sonificator rek en de temperatuur van het circulerende water uit het waterbad. Garanderen dat het water in evenwicht is bij 37 ° C en niet invullen meer dan 30% van de tube sonicator rack (Figuur 1, panel C). Spreid de PCR-buizen door de microplaat hoorn. Hebben ten minste een rij van lege ruimte tussen PCR-tube-strips en laat niet meer dan vier buizen aan elkaar per strip verbonden (figuur 1, paneel C). </li><li> De kracht van sonificatie is cruciaal voor een succesvolle amplificatie prionstam. Terwijl sonicatie, stel de amplitude om een ​​vermogen hebbenvariërend tussen 155 ~ 170 watt. In ons laboratorium het vermogen is ingesteld op zes en zeven voor de Misonix 3000 en Misonix 4000, respectievelijk. </li><li> Gebruik gedestilleerd water in het waterbad om te voorkomen dat accumulatie van hard water vlekken. Vervang dit water per week. Tijdens de incubatie en sonicatie cycli, zal het water condenseren op de microplaat hoorn deksel. Om condensatie te voorkomen, voeg een klein aquarium warmte-pad naar de top van de behuizing van het sonificator doos zoals weergegeven in figuur 1, paneel A. </li></ol> 2. Voorbereiding van de monsters <ol><li> Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de Creighton University Institutional Animal Care en gebruik Comite en voldoen aan de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Voordat een weefselverzameltoestel, moet het dier verdoofd en transcardiaal geperfuseerd met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing met 5 mM EDTA bij pH 7,4 om bloed uit de hersenen en de remming van voorkomenPMCA reactie van het bloed 7. Snel verzamelen dierlijke weefsels met behulp van aseptische techniek en hebben speciale dissectie-instrumenten voor elke prionstam. Na dissectie het weefsel plaatsen in een 1,5 ml microcentrifugebuisje, flash bevriezen op droogijs en bewaard bij -80 ° C tot homogenisatie. </li><li> De PMCA substraat (PrP C) oplossing te bereiden homogeniseer een geïnfecteerde hamster hersenen (UN BH) een 10% gewicht / volume (w / v) oplossing met ijskoude buffer conversie (zie deel 3) met een tissue Tenbroeck molen. Onder homogeniseren, wees voorzichtig dat u de lucht binnen in de molen om te voorkomen dat overmatige schuimvorming van de oplossing. Verduidelijken de oplossing door centrifugeren bij 500 xg gedurende 30 sec en de supernatant aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Bij -80 ° C tot verder gebruik. </li><li> De PMCA zaad (PrP Sc) te bereiden, homogeniseer een infectueus materiaal (hersenen, milt, lymfeknopen, andere weefsels of vervuilde grond) om een 10% w / v oplossing met ijskoude water en aliquot de oplossing in 0,6 ml microcentrifugebuizen. Bij -80 ° C tot verder gebruik. </li></ol> 3. Voorbereiden Conversie Buffer <ol><li> Weeg 0,5093 g Triton X-100 in een 50 ml maatkolf (resultaat is een 1% eindconcentratie van Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland). </li><li> Voeg een complete proteaseremmer Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Duitsland). </li><li> Voeg 0,0931 g EDTA (dit zal resulteren in een 5 mM eindconcentratie van EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc Phillipsburg, NJ). </li><li> Stel de pH op 7,4 met 1 N NaOH. </li><li> Stel het volume op 50 ml met fosfaat gebufferde Dulbecco&#39;s fysiologische zoutoplossing (DPBS) (Mediatech Inc Manassas, VA). </li><li> Filtreer de oplossing door een 0,45 um nitrocellulose membraan met een vacuümfiltratie inrichting. De omzetting buffer kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende niet langer dan een maand. </li></ol> 4. Amplificatie van Prion stammen gebruik PMCA <ol><li>Verdun de PMCA zaad in de PMCA substraat in een verhouding van 1:20 (ie mix 5 ul van de PMCA zaad en 95 ul van de PMCA substraat) in een PCR buis. Verwijder en bewaar een 15 pi aliquot bij -80 ° C gedurende unsonicated controle; dit unsonicated controle wordt gebruikt om de PrP Sc amplificatie via proteinase K (PK) digestie gevolgd door Western blot (WB) analyse kwantificeren. Een extra unsonicated controle kan gegenereerd worden door een tweede 15 pi aliquot bij 37 ° C voor de duur van de PMCA reactie. Een minimum van drie herhalingen nodig is voor statistische doeleinden. </li><li> Betreft de rest van het monster (70 ul) een ronde PMCA zoals afgebeeld op Figuur 1, Paneel A. Shake ze om 5 h water condensatie te vermijden op de gewelfde kap van de PCR buis. </li><li> Het monster buizen moeten worden gecentrifugeerd en voorzichtig gevortext (let erop dat de oplossing niet ingaan op de koepelvormige kap) voor het openen na een procedure te waarborgen homogeniseringeneity en vermijd mogelijke besmetting. </li><li> Voor seriële PMCA (sPMCA) korte incubatieperiode stammen (bijvoorbeeld HY TME, HaCWD of 263K), vul de gesonificeerde materiaal in een verhouding van 1:20 door overdracht 5 pl van het monster van gesonificeerde ronde in 95 pl vers geïnfecteerde hersenhomogenaat (Figuur 2, Paneel B). </li><li> Voor sPMCA lange incubatietijd stammen (bijvoorbeeld DY TME, 139H, 22CH, 22AH of ME7H), vul de gesonificeerde materiaal in een verhouding van 1:1 door de overdracht 50 ul van het monster van gesonificeerde ronde in 50 pl vers geïnfecteerde hersenhomogenaat (Figuur 2, Paneel B). </li><li> Verwijder twee 15 ul aliquots van de eerder verdunde sonicated mengsel (van stap 4.4 of 4.5) en een van hen opgeslagen bij -80 ° C en de andere bij 37 ° C (unsonicated besturingssystemen voor PMCA ronde). Onderwerpen de overblijfselen van een PMCA de tweede ronde. </li><li> Deze procedure kan onbeperkt worden herhaald. In ons laboratorium hebben wehebben uitgevoerd tot vijftien PMCA rondes, met de stam eigenschappen ongewijzigd blijven. </li><li> PK verteren de monsters. Voor een typische WB, mix 5 pi PK 80 ug / ml tot 5 pl monster (deze oplossing een uiteindelijke PK concentratie van 40 ug / ml zijn) en incubeer bij 37 ° C gedurende een uur. Voeg 10 ul van gel loading buffer. Kook deze oplossing gedurende 10 minuten. Laat de oplossing afkoelen en plaats 10 ul in de gel. </li><li> Om het succes van amplificatie berekenen WB voeren van de PK-gedigereerd samples om de hoeveelheid geamplificeerd PrP Sc schatten door ze te vergelijken met hetzij de unsonicated controles 20,21 Figuur 2, Paneel C of in vaststaande PK-onverteerd recombinant PrP. </li></ol> 5. Het vermijden van Kruisbesmetting Kritische stappen worden genomen om kruisbesmetting en het ontstaan ​​van valse positieven door de novo vorming van protease resistente producten te minimaliseren. </p&gt; <ol><li> Gebruik een speciale set van dissectie-instrumenten (dwz tang, pincet, schaar) voor monstername voor elke prionstam. </li><li> Voor homogeniseren geïnfecteerde hersenen worden gebruikt als substraat PMCA Veeg de pipetten met 1% bleekmiddel. Week de sonificator de PCR-buis rek, weefsel homogenisatoren, en PCR-buis deurvakken met 1% bleekwater gedurende 10 minuten en spoel grondig met gedestilleerd water. </li><li> Bedek het werkgebied met een frisse Versi-Dry Lab Soaker elke keer een nieuw monster worden gehomogeniseerd, een nieuwe PMCA experiment is om voorbereid te zijn, of wanneer aliquoteren tussen sPMCA rondes. </li><li> Gebruik nieuwe handschoenen elke keer nieuwe monsters worden behandeld (vooral bij het overbrengen van monsters tussen sPMCA rondes). </li><li> Gebruik korte sonicatie uitbarstingen voor elke PMCA cyclus. Cycli van 5 sec sonicatie gecombineerd met 10 min incubatie is voldoende om prionen te versterken zonder de novo genereren PrP Sc 1,20,21,23,24. Zoals andere laboratoria hebben aangetoond, waardoor desonicatie tijd, waardoor de amplitude sonificatie en uitbreiding van het aantal cycli PMCA verhoogt de kans op de novo PrP Sc vorming 2. </li></ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+physical+properties+of+the+prion+protein+from+two+strains+of+the+transmissible+mink+encephalopathy+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent.</a> J. Virol. 66, 2096-2101 (1992).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+PrP+properties+suggest+the+molecular+basis+of+strain+variation+in+transmissible+mink+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Distinct PrP properties suggest the molecular basis of strain variation in transmissible mink encephalopathy.</a> J. Virol. 68, 7859-7868 (1994).</li>
<li>Bessen, R. A., Marsh, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+biologically+distinct+strains+of+transmissible+mink+encephalopathy+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of two biologically distinct strains of transmissible mink encephalopathy in hamsters.</a> J. Gen. Virol. 73, 329-334 (1992).</li>
<li>Castilla, J., Gonzalez-Romero, D., Saa, P., Morales, R., De Castro, J., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+the+species+barrier+by+PrP%28Sc%29+replication+in+vitro+generates+unique+infectious+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions.</a> Cell. 134, 757-768 (2008).</li>
<li>Castilla, J., Morales, R., Saa, P., Barria, M., Gambetti, P., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+propagation+of+prion+strains%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cell-free propagation of prion strains.</a> EMBO J. 27, 2557-2566 (2008).</li>
<li>Caughey, B., Raymond, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scrapie-associated+form+of+PrP+is+made+from+a+cell+surface+precursor+that+is+both+protease-+and+phospholipase-sensitive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive.</a> J. Biol. Chem. 266, 18217-18223 (1991).</li>
<li>Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+native+prions+from+minimal+components+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Formation of native prions from minimal components in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9741-9746 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. G., Fraser, H., Meikle, V. M., Outram, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+between+different+scrapie+agents+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Competition between different scrapie agents in mice.</a> Nat. New Biol. 237, 244-245 (1972).</li>
<li>Gonzalez-Romero, D., Barria, M. A., Leon, P., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+infectious+prions+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Detection of infectious prions in urine.</a> FEBS Lett. 582, 3161-3166 (2008).</li>
<li>Green, K. M., Castilla, J., Seward, T. S., Napier, D. L., Jewell, J. E., Soto, C., Telling, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high+fidelity+prion+amplification+within+and+across+prion+species+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Accelerated high fidelity prion amplification within and across prion species barriers.</a> PLoS Pathog. 4, e1000139(2008).</li>
<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
<li>Saunders, S. E., Shikiya, R. A., Langenfeld, K., Bartelt-Hunt, S. L., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+efficiency+of+soil-bound+prions+varies+with+soil+type%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Replication efficiency of soil-bound prions varies with soil type.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
<li>Shikiya, R. A., Ayers, J. I., Schutt, C. R., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infecting+prion+strains+compete+for+a+limiting+cellular+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Co-infecting prion strains compete for a limiting cellular resource.</a> Journal of. 84, 5706-5714 (2010).</li>
<li>Shikiya, R. A., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+high+titer+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of high titer prions.</a> Journal of virology. , (2011).</li>
<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Uitdagingen van het amplificeren besmettelijke prion-eiwitten zijn de lange incubatietijd en de kosten van de in vivo experimenten. De PMCA techniek is een kosteneffectieve manier om besmettelijke prionen agenten te versterken. Verschillende laboratoria hebben het vermogen van PMCA nauwkeurig prion stammen amplificeren in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24. Prionziekten worden overgedragen tussen soorten. Bessen en Marsh effectief hebben geënt hamsters met overdraagbare e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens / Equipment </td><td> Fabrikant </td><td> Cat. Aantal </td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> Tenbroeck Tissue Grinder </td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> Neslab EX-7 Water Bath </td><td> Thermo Electron </td><td> Neslab EX-7 </td></tr><tr><td> 0,2 ml PCR Tube Strips </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T9284-100ML </td></tr><tr><td> Compleet Proteaseremmer </td><td> Roche </td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> JT Baker </td><td> 4040-00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Mallinckrodt Baker Mediatech </td><td> 21 tot 031-CV </td></tr><tr><td> Versi-Dry Lab soakers </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> Repti Therm Heater </td><td> Zoo Med Laboratories, Inc </td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

eiwit misfolding cyclische versterking van prionen

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prionen zijn infectieuze agentia die de onvermijdelijk fatale overdraagbare spongiforme encefalopathie (TSE) veroorzaken bij dieren en mensen 9,18. De prion eiwit heeft twee verschillende isovormen, niet-infectieuze gastheer gecodeerd eiwit (PrP C) en infectieus eiwit (PrP Sc), een abnormaal gevouwen isovorm van PrP C 8. Een van de uitdagingen van het werken met prion middelen is de lange incubatietijd voorafgaand aan de ontwikkeling van klinische tekenen die volgden gastheer inoculatie 13. Dit traditioneel opdracht lange en dure dieren bioassay studies. Verder zijn de biochemische en biofysische eigenschappen van PrP Sc slecht vanwege hun bijzondere conformatie en aggregatietoestanden gekarakteriseerd. PrP Sc kan zaad de omzetting van PrP C PrP Sc in vitro 14. PMCA een in vitro techniek die wordt Advantage van dit vermogen gebruik sonificatie en incubatie cycli om grote hoeveelheden PrP Sc produceren hogere snelheid, een systeem met overmaat PrP C en kleine hoeveelheden van het PrP Sc seed 19. Deze techniek heeft bewezen effectief te recapituleren de soort en stam specificiteit van PrP Sc omzetting van PrP C tot prionstam interferentie emuleren, en zeer lage niveaus van PrP Sc amplificeren van geïnfecteerde weefsels, vloeistoffen en milieumonsters 6,7,16, 23. Dit document beschrijft de PMCA protocol, met inbegrip van aanbevelingen voor het minimaliseren van verontreiniging, het genereren van consistente resultaten, en kwantificeren van die resultaten. We bespreken ook verschillende PMCA toepassingen, inclusief productie en karakterisering van besmettelijke prion stammen prionstam interferentie en de detectie van prionen in het milieu.

Protein misfolding cyclische amplificatie (PMCA) wordt gebruikt om PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24 amplificeren. Een succesvolle PrP Sc amplificatie wordt aangetoond door een verhoging in bandintensiteit op Western blots van de PK-resistente prioneiwit (migreren tussen 19 en 30 kDa voor hamster prion afgeleide stammen) zoals getoond in figuur 3. De toename van de band intensiteit na PMCA geeft amplificatie van het PK-resistente PrP Sc materiaal. Suc...

Protein misfolding cyclische amplificatie (PMCA) is een in vitro assay voor de studie van prion conversie en spanning en species barrières. Het kan ook worden gebruikt als een prion detectie assay.

Eiwit misfolding Cyclische Versterking van prionen

Prionen zijn infectieuze agentia die de onvermijdelijk fatale transmissibele spongiforme encefalopathie (TSE) bij dieren en mensen veroorzaken9,18. Het prioneiwit ...

Het doel van deze procedure is om hamster-geadapteerde PreOn-stammen in vitro succesvol te amplificeren. Dit wordt bereikt door eerst niet-geïnfecteerd hamsterbrein te homogeniseren om als substraat te dienen, en vervolgens het geïnfecteerde weefsel voor te bereiden om als inoculum te worden gebruikt. De tweede stap bestaat uit het mengen van het substraat en het inoculum in PCR-buisjes, waarna eiwit-misfolding cyclische amplificatie of PMCA wordt uitgevoerd door middel van sonicatie- en incubatiecycli.Vervolgens wordt het geamplificeerde materiaal verdund met vers substraat en in vitro serieel geamplificeerd, waarna PMCA wordt uitgevoerd. Ten slotte worden de monsters gedigereerd met proteinase K en vervolgens geanalyseerd via western blot. Uiteindelijk kan de toename in bandintensiteit in de western blot worden gebruikt om de in vitro amplificatie van de prionstam te bepalen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het PreOn-veld, zoals: wat zijn de belangrijke cofactorfactoren die betrokken zijn bij de PreOn-amplificatie? Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode slechts moeite hebben met kleine maar belangrijke details met betrekking tot de techniek, evenals met het voorkomen van kruiscontaminatie van monsters. Veeg vóór het homogeniseren de pipetten af met 1% bleekmiddel en verzadig ook de sonicate PCR-buisrekken, weefselhomogenisatoren en PCR-buisopbergrekken met bleekmiddel.Spoel na 10 minuten alle apparatuur grondig af met gedestilleerd water en bedek vervolgens het werkoppervlak met een schone Verly dry lab Soaker. Gebruik nu een 10 buric weefselhomogenisator en vers bereide, ijskoude conversiebuffer om een niet-geïnfecteerde hamsterhersenen te homogeniseren tot een 10% gewicht-per-volume oplossing. Voeg de PMCA-substraatoplossing toe, breng het homogenisaat vervolgens over in 15 milliliter conische buizen en clarificeer de gehomogeniseerde oplossing door centrifugatie bij 500 ×g gedurende 30 seconden.Breng vervolgens het resulterende supernatant voorzichtig over in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes, waarbij het grote pelletaliquot wordt vermeden. Om de PMCA-seedoplossing te bereiden, wordt het geoogste infectieuze materiaal gehomogeniseerd tot een oplossing van 10% gewicht per volume zoals zojuist gedemonstreerd, maar met daros fosfaatgebufferde zoutoplossing of DPBS in plaats van conversiebuffer, waarna de oplossing wordt verdeeld over 0,6 milliliter microcentrifugebuisjes. Bedek vóór het begin van de amplificatieprocedure het werkblad met een schone, droge laboratoriumdoek; breng het PMCA-substraat over naar een 200 microliter dunwandige PCR-buisstrip en verdun het PMCA-seed hierin in een verhouding van 1:20, waarbij in totaal vier replica's in rood gelabelde buisjes worden geplaatst.Plaats twee replica's van een aliquot van 15 µL van elk monster in blauw gelabelde PCR-buisjes om te gebruiken als onbehandelde controle bij -80 °C. Plaats nog eens twee replica's van een aliquot van 15 µL van elk monster in PCR-buisjes om te bewaren bij 37 °C als aanvullende onbehandelde controle. Plaats vervolgens de onbehandelde controles bij -80 °C in een vriezer van -80 °C en plaats de overige onbehandelde controles in een incubator van 37 °C voor de duur van de PMCA-reactie.Begin nu de eerste PMCA-amplificatieronde door de PCR-buisstrip met de resterende 70 µL van elk monster in een sonicator te plaatsen, die is aangesloten op een recirculerend waterbad dat is ingesteld op een constante temperatuur van 37 °C. Een PCR-buis met alleen PMCA-substraat kan worden toegevoegd als schijncontrole om te controleren op kruiscontaminatie. Vul niet meer dan 30% van de buishouder van de sonicator door de PCR-buisjes te verspreiden over de hoorn van de microplaat. Houd ten minste één rij lege ruimte tussen de PCR-buisstrips en zorg dat er niet meer dan vier buisjes per strip aan elkaar zijn verbonden.De amplificatie van P-R-P-S-C varieert over de gehele microplate-hoorn. De beste amplificatie-efficiëntie van P-R-P-S-C wordt bereikt binnen een straal van vijf centimeter vanaf het centrum van de microplate-hoorn. Eén ronde PMCA bestaat uit 144 cycli met vijf seconden sonicatie en 10 minuten incubatie per cyclus, gedurende ongeveer 24 uur per PMCA-ronde; stel tijdens de sonicatie de amplitude zo in dat het uitgangsvermogen tussen 155 en 170 watt ligt.Plaats een aquariumverwarmingsmatje op het sonicatiedeksel om condensvorming van water te voorkomen, wat kan leiden tot kruiscontaminatie van de monsters. Schud de buisjes elke vijf uur om condensvorming van water op de gewelfde doppen van de PCR-buisjes te voorkomen nadat de ronde is voltooid. Verwijder de buisjesstrip uit de rotor en centrifugeer de monsters kort.Vortex de buisjes vervolgens voorzichtig, waarbij de oplossing tegen de dop wordt gehouden om contaminatie te voorkomen wanneer de doppen worden geopend, om zo contaminatie bij het openen van de buisjes verder te minimaliseren. Vermijd contact met de rand en plaats de dop op een schone Kim wipe. Breng vervolgens voor seriële PMCA van de PreOn-stam 5 µL van het gesoniceerde monster over in 95 µL vers PMCA-substraat.Gebruik voor elk monster nieuwe handschoenen. Neem vervolgens twee aliquots van 15 µL uit elk van de gesoniceerde monsters en bewaar één aliquot bij -80 °C en de andere bij 37 °C. Onderwerp voor de niet-gezaaide controle-oplossingen voor de tweede PMCA-ronde de residuen aan een tweede PMCA-ronde, zoals zojuist gedemonstreerd.Deze stap kan naar behoefte worden herhaald. Een PCR-buisje met uitsluitend PMCA-substraat van het niet-geïnfecteerde brein kan worden toegevoegd om kruiscontaminatie te controleren. Nadat de monsters voor het gewenste aantal ronden zijn gesoniceerd, mengt u 5 µL proteinase K (18 µg/mL) met 5 µL van het gesoniceerde monster, de -80 °C controle en de 37 °C controle in afzonderlijke PCR-buisjes en verteert u het monster gedurende één uur bij 37 °C.Voeg vervolgens 10 µL gelstlaadbuffer toe aan het gedigesteerde monster en kook de oplossing gedurende 10 minuten. Nadat deze is afgekoeld, wordt 10 µL van het mengsel van monster en gellaadbuffer op een Western blot-gel geladen. Om de hoeveelheid geamplificeerde P-R-P-S-C te bepalen, wordt de hoeveelheid proteinase K-gedigesteerd monster in de Western blot vergeleken met ofwel de onbehandelde controles of met bekende hoeveelheden proteinase.K onverteerd recombinant. P-R-P-C-P-M-C-A wordt gebruikt om P-R-P-S-C in vitro te amplificeren. De succesvolle amplificatie van het hamster-geadapteerde PreOn-eiwit hamster CWD en drowsy TME is te zien in deze Western blot-analyse door de bandintensiteiten voor en na PMCA te vergelijken. Proteinase K-digestie van P-R-P-S-C gevolgd door Western blot-analyse laat een bovenste, middelste en onderste band zien die respectievelijk overeenkomen met het di-, mono- en glycosylerde prioneiwit. Sommige PreOn-stammen kunnen worden onderscheiden op basis van hun elektroforetische mobiliteit.Er is bijvoorbeeld een verschil van twee kilodalton in migratie tussen de hamster CWD- en de drowsy TME PreOn-stammen. Deze getrouwe amplificatie wordt waargenomen door een vergelijkbare elektroforetische migratie van de met PMCA geamplificeerde PreOn hamster CWD-stam in vergelijking met het overeenkomstige hamster CWD-seed, evenals voor de drowsy TME-stam in vergelijking met het drowsy TME-seed. Indien er geen kruiscontaminatie of de novo P-R-P-S-C vorming optreedt, moeten de Western blot-analyses van de OFM-controle PMCA-monsters helder blijven na digestie met proteinase k.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden elk stuk apparatuur te reinigen voordat een nieuw monster wordt gebruikt, om zo kruiscontaminatie te voorkomen.

protein-misfolding-cyclic-amplification-of-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

SDD-AGE is een nuttige techniek voor de detectie en karakterisering van amyloid-achtige polymeren in de cellen. Hier laten we zien een aanpassing dat maakt deze techniek vatbaar is voor grootschalige toepassingen.

Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering van zeer actieve Hsp104, een hexamere AAA + eiwit van gist, die koppels ATP hydrolyse aan eiwit desaggregatie. Deze regeling maakt gebruik van een His6-gelabeld bouwen voor affiniteitszuivering...

Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase

Incubate with a proteolytic enzyme to digest the normal prions, leaving the resistant aggregates intact.

Detection of Misfolded Prion Protein Aggregates in Mouse Brain Tissue Using Western Blotting

This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme<em&gt; C. elegans</em

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van een eenvoudige, snelle en efficiënte prion amplificatie techniek, de real-time schokkend-geïnduceerde conversie (RT-QuIC) methode.

Real-time schokkend-geïnduceerde conversie Assay voor het opsporen van CWD prionen in fecaal materiaal

Vergaren van bewijs ondersteunt het idee dat de pathogene eiwit-aggregaten neurodegeneratieve ziekten verspreiden tussen cellen met prion-achtige eigenschappen gekoppeld. Hier beschrijven we een methode waarmee visualisatie van cel naar cel verspreiding van prion-achtige aggregaten in de model-organisme, Drosophila melanogaster.

Controle van cel naar cel transmissie van Prion-achtig eiwit-aggregaten in Drosophila Melanogaster

Aaseters hebben potentieel om besmettelijke overdraagbare spongiforme encefalopathie prionen translokeren in hun uitwerpselen te ziektevrije gebieden. We detail methoden die worden gebruikt om te bepalen of de muis aangepast scrapie prionen infectieus blijven na passage al is het spijsverteringskanaal van de Amerikaanse kraaien (Corvus brachyrhynchos), een gemeenschappelijke consument van dode dieren.

Procedures voor het identificeren van Besmettelijke Prions na passage door het spijsverteringsstelsel van een vogelsoort

Leer de PMCA-techniek voor het versterken van prionstammen in vitro met behulp van hamsterhersenweefsel. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van prionconversie en het ontwikkelen van detectiemethoden.

Eiwit misfolding Cyclische Versterking van prionen

Meer video's verkennen