Het beoordelen van replicatie en Beta cel functie in Adenovirally-getransduceerde Geïsoleerd Rodent Eilandjes
June 25th, 2012
Dit protocol maakt het mogelijk factoren te identificeren die de functionele beta cel massa moduleren om potentiële therapeutische doelen voor de behandeling van diabetes te vinden. Het protocol bestaat uit een gestroomlijnde methode om eilandje replicatie-en bèta-cel functie te beoordelen in geïsoleerde eilandjes rat na manipulatie van genexpressie met adenovirussen.
Het algemene doel van deze procedure is om signaalroutes te identificeren die veranderingen in functionele bètacellenmassa reguleren. Dit wordt bereikt in geïsoleerde rattenoogjes door overexpressie of onderdrukking van de expressie van een gen met behulp van adenovirale vectoren. Na deze manipulatie wordt de bètacellenfunctie beoordeeld door insulinesecretie en oogje-replicatie gemeten door gelabelde thymidine-incorporatie.
Uiteindelijk kunnen deze tests aantonen of een gen van belang de bètacellenproliferatie en/of functie in vitro reguleert. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het oogledenbiologieveld te beantwoorden, zoals of een bepaald onderdeel van een signaalroute de bètacellengroei en -functie beïnvloedt? Bereid een zes-wels plaat zonder weefselkweekcoating voor door twee milliliters gewijzigd medium toe te voegen aan het vereiste aantal wells.
Een typisch experiment kan bijvoorbeeld drie wells vereisen, één voor een controle zonder virus, één voor een viruscontrole en één voor de experimentele groep. Verwarm de plaat tot 37 graden Celsius in een weefselkweekincubator gedurende ten minste 30 minuten. Direct na de isolatie van het rattenoogje, plaats één tot 200 oogjes in elke well van de voorbereide plaat. 60 oogjes zullen worden gebruikt voor biochemische tests en de overige oogjes kunnen worden gebruikt voor genexpressiestudies of immunoblotting. Zorg ervoor dat de plaat voorzichtig opzwelt om de oogjes naar het midden van elke well te brengen.
Pipetteer vervolgens onmiddellijk het adenovirus direct op de oogjes. In het midden van de schaal. Gebruik een tot 500 vermenigvuldigingen van infectie, afhankelijk van de effectiviteit van het adenovirus bij het overexpresseren of knocken van uw eiwit van belang.
Efficiënte adenovirale penetratie tot het midden van het oogleden verhoogt de consistentie van de resultaten. Het transduceren van de oogleden direct na de isolatie is essentieel.
Verstoor de plaat gedurende vijf minuten niet, verplaats deze vervolgens naar de incubator gedurende 24 uur. Verwijder de volgende dag de plaat uit de incubator en zorg ervoor dat de oogjes voorzichtig naar de centra van de wells zwellen. Breng de oogjes over naar een nieuwe well met vers medium met behulp van een micropipet van 200 microliter.
Als de oogjes aan de plaat vast komen te zitten, kunnen ze voorzichtig worden losgemaakt met de pipettetip. Het is nuttig om een controlevirus te gebruiken dat GFP expresseert om de adequate transductie-efficiëntie te verifiëren door confocale microscopie te gebruiken om de penetratie van het adenovirus in de eilandjekerncultuur te visualiseren. Cultiveer de eilandjes nog een tot drie dagen, waarbij het medium dagelijks wordt ververst.
De cultuurtijd moet worden geoptimaliseerd door middel van pilootstudies en varieert op basis van de experimentele doelen. Voor de laatste 24 uur, incorporeer getritieerd thymidine in het medium met een concentratie van één micro curie per millimeter medium. Bereid eerst vers 50 milliliter van het werkende SAB in een 50 milliliter conische buis en verwarm het in een waterbad van 37 graden Celsius.
Pipetteer 10 milliliter van het werkende SAB in een 15 milliliter conische buis en voeg 66,8 microliter van 2,5 molaire D glucose toe. Om de hoge glucose SAB voor te bereiden, voeg 44,8 microliter van 2,5 monolo D glucose toe aan de resterende 40 milliliter van het werkende SAB. Om de lage glucose SAB te bereiden, label vervolgens drie microcentrifugebuisjes van 1,7 milliliter.
Voor elke well van de zes-wels plaat en voeg één milliliter PBS toe aan elke buis. Vergeet niet om institutionele protocollen te volgen voor de omgang met en de verwijdering van de radioactieve oogjes. Gebruik een stereoscoop of standaardmicroscoop om 20 vergelijkbaar gedimensioneerde oogjes te selecteren en over te brengen naar elke microcentrifugebuis.
Elke buis kan bijvoorbeeld vijf kleine, tien middelgrote en vijf grote oogjes bevatten. Hoewel de resultaten aan het einde van het experiment worden genormaliseerd op het totale eiwitgehalte, is het van cruciaal belang om de oogjes tussen de groepen op grootte te matchen. Laat de oogjes door middel van zwaartekracht of door centrifugatie op de bodem van de buis bezinken en zuig, weeg het PBS met een micropipet op en ga verder met het voorbereiden van de oogjes voor de biochemische tests.
Om de oogjes voor de insulinesecretietest voor te bereiden, moeten ze eerst worden voorgeïncubeerd met lage glucose SAB. Om dit te doen, voeg 400 microliter van de lage glucose SAB toe aan de buizen en plaats ze met doppen in de weefselkweekincubator. Voor 60 minuten. Na een uur, zuig de voorgeïncubeerde lage glucose SAB weg. Herhaal de voorincubatieprocedure om basale insulinesecretie te meten.
Om gestimuleerde insulinesecretie te meten, gebruik in plaats van lage glucose SAB 400 microliter van hoge glucose SAB en incubeer de oogjes zoals eerder beschreven gedurende 60 minuten na incubatie in hoge of lage glucose SAB. Aspirateer en het SAB voor de insuline radio-immunoassay, die wordt uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. Ga vervolgens verder met de thymidine-incorporatietest met behulp van dezelfde verzameling oogjes. Begin met de oogjes die zojuist zijn gebruikt voor de insulinesecretietest.
Voeg één milliliter PBS toe en laat de oogjes door middel van zwaartekracht bezinken. Zuig vervolgens het PBS op met een micropipet. Gooi weg en herhaal deze stap nog een keer.
Voeg vervolgens 500 microliter ijskoud trichloroazijnzuur toe aan de oogjes en incubeer ze gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer de buizen bij vier graden Celsius. Zuig vervolgens af en gooi de TCA weg.
Voeg vervolgens 80 microliter 0,3 normale natriumhydroxide toe en incubeer de oogjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Tijdens deze incubatie, vortex de monsters krachtig gedurende vijf tot tien seconden elke tien minuten. Voeg in parallel vier milliliter van een conno safe tellende cocktail toe aan zeven milliliter vloeibare scintillatietellingsbuisjes.
Wanneer de incubatie van de oogjes voorbij is, voeg 50 microliter van de oogjes toe aan een scintillatiebuis. Schud de af
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol maakt de identificatie van signaalroutes mogelijk die functionele bètacellenmassa reguleren, wat cruciaal is voor diabetesbehandeling. De methode beoordeelt eilandjereplicatie en bètacelffunctie in geïsoleerde ratteneilandjes door manipulatie van genexpressie met behulp van adenovirale vectoren.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Endocrinologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Begrip van bètacellenmassa is vitaal voor diabetesonderzoek.
- Geïsoleerde ratteneilandjes dienen als model voor het bestuderen van bètacelffunctie.
- Genexpressie kan worden gemanipuleerd om de effecten ervan op bètacellen te bestuderen.
- Insulinachteruitscheiding en eilandjereplicatie zijn belangrijke indicatoren van bètacellengezondheid.
Doel van de studie
- Om factoren te identificeren die functionele bètacellenmassa moduleren.
- Om potentiële therapeutische doelen voor diabetesbehandeling te vinden.
- Om de impact van specifieke genen op bètacellenproliferatie en -functie te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Manipulatie van genexpressie met behulp van adenovirale vectoren.
- Beoordeling van bètacelffunctie door meting van insulinesecretie.
- Evaluatie van eilandjereplicatie via incorporatie van getritieerd thymidine.
- Gebruik van een zes-putjesplaat zonder weefselcultuurcoating voor experimenten.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van specifieke genen die bètacellengroei beïnvloeden.
- Demonstratie van de relatie tussen genexpressie en bètacelffunctie.
- Inzichten in signaalroutes die bètacellenmassa beïnvloeden.
- Potentiële therapeutische doelen voor diabetes geïdentificeerd.
Conclusies
- Het protocol biedt een gestroomlijnde aanpak om bètacellenbiologie te bestuderen.
- Manipulatie van genexpressie kan belangrijke inzichten in diabetes onthullen.
- Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van endocrinologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Manipulating gene expression in isolated rodent islets using adenoviral vectors enables systematic evaluation of pathways regulating beta cell replication and function, a critical inflection point for diabetes therapeutic discovery. This approach provides predictive confidence in target validation by distinguishing effects on cell proliferation from impacts on insulin secretion. The method supports risk-adjusted portfolio decisions by clarifying whether candidate targets enhance beta cell mass without compromising function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of candidate gene function in beta cell growth and insulin secretion.
- Supports mechanistic de-risking by isolating effects on replication versus function.
- Facilitates identification of targets that increase functional beta cell mass for diabetes research.
- Provides a controlled system for pathway clarification and hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Establishes validated islet models for quantitative assessment of gene manipulation outcomes.
- Delivers reproducible insulin secretion and replication readouts for downstream screening.
- Supports assay standardization through normalization to protein content and size-matched islets.
- Enables reliable evaluation of gene targets for further compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant mechanisms in diabetes.
- Provides continuity from discovery-stage gene validation to preclinical target prioritization.
- Supports translational biomarker development by linking gene effects to functional outputs.
- Reduces late-stage biological risk by clarifying target impact on both proliferation and function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early-stage target validation, mechanistic de-risking, and assay development for diabetes research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of gene function in beta cell replication and insulin secretion.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Delivers normalized measurements of DNA synthesis and insulin secretion for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro gene validation with disease-relevant functional endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for systematic evaluation of multiple gene targets in islet biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes gene manipulation and functional assessment in isolated islets.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying target effects early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets for diabetes therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in islet isolation, adenoviral transduction, and functional assays.
- Demands access to tissue culture, confocal microscopy, and liquid scintillation counting infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of assay protocols and normalization strategies.
- Adaptation to other model systems may require optimization of viral delivery and assay conditions.
- Radioactive labeling and protein quantification steps require compliance with institutional safety protocols.
