Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van

Het algemene doel van het volgende experiment is het identificeren van eiwitten die specifiek interageren met een bepaald doeleiwit in celextracten die oplosbare en membraaneiwitten bevatten. Bereik eerst een volledige metabole markering van chlamydomonas-cellen met stikstof 14 en stikstof 15 en genereer cellysaten met en zonder een TP. Een optionele cross-linking-stap helpt om transiënte eiwit-eiwitinteracties te stabiliseren. Scheid vervolgens de cellysaten in fracties, verrijkt met onoplosbare en membraaneiwitten, waaruit het doeleiwit en de specifieke interactiepartners worden geïsoleerd.

Een controleproteïne en contaminerende proteïnen worden immunoprecipiteerd en geëlukt. Meng vervolgens de immunoprecipiteerde proteïnen, voer een drievoudige digestie uit en analyseer deze via tandem LCMS. De resultaten maakten onderscheid tussen ware en valse interactiepartners door verschillende ratio's van 14N/15N-peptiden aan te tonen voor proteïnen die specifiek interageren met het doeleiwit, en gelijke stikstofratio's voor overige proteïnen.

14 stikstof 15 peptide-ratio's voor het doeleiwit, het controle-eiwit en contaminerende eiwitten. De voorkeursmethode voor het analyseren van eiwit-eiwitinteracties is het immunoprecipiteren van het gekozen eiwit direct samen met zijn interactiepartners uit celextracten, waarin beide in hun natuurlijke conformatie en concentraties voorkomen.

Wanneer dit echter gebeurt, slaan ook contaminerende eiwitten neer, voornamelijk omdat ze interageren met de gebruikte antilichamen, aangezien moderne massaspectrometers extreem gevoelig zijn. Deze zullen onmiskenbaar ook de contaminerende eiwitten identificeren, waardoor het onmogelijk is om onderscheid te maken tussen foutpositieven en echte interactiepartners. Dit probleem wordt opgelost door de hier getoonde techniek, die is gebaseerd op 15 N metabole labelings-immunoprecipitatie-affiniteitsmodulatie, hier gemedieerd door de ATP-status, en kwantitatieve massaspectrometrie.

De techniek zal worden gedemonstreerd door Stefan SCH Malinger, een senior PhD-student in mijn laboratorium. Nadat de cellen gedurende 10 generaties zijn gelabeld, worden twee aliquoten van zowel stikstof 14- als stikstof 15-gelabelde Chlamydomonas-cellen overgebracht naar 4G SA-buisjes en geoogst door centrifugatie. Resuspendeer de pellets in twee milliliters ijskoude lysisbuffer en breng de suspensies over naar 15 milliliter Falcon-buisjes; verzamel de resterende cellen uit elke aliquot met een aanvullende milliliter lysisbuffer. Voeg 50 microliters 25x proteaseinhibitor en 12,5 microliters 1 molar magnesiumchloride toe. Sonicate de monsters vier keer gedurende 20 seconden op ijs voor volledige cellysis, met tussentijdse pauzes van 20 seconden voor afkoeling.

Bereid vier sucrosekussens van 6 ml voor in SW 41 TI dunwandige buisjes. Breng het volledige volume van de cellysaten voorzichtig aan op de sucrosekussens. Vul aan met lysisbuffer en centrifugeer om oplosbare proteïnecomplexen van membranen te scheiden.

Overbreng de oplosbare proteïnecomplexen van de bovenkant van de gradiënt naar vier Falcon-buisjes van 15 milliliter. Zorg ervoor dat er geen delen van het sucrosekussen worden overgebracht. Voeg vervolgens aan elk monster 10% Triton X 100 toe tot een eindconcentratie van 0,5%. Meng voorzichtig en voeg lysisbuffer toe tot een totaalvolume van zeven milliliter.

Voor SDS-PAGE en immuno-bloedanalyses. Breng 70 µL van elk oplosbaar celextract over naar een nieuwe conische buis van 1,5 mL en voeg 70 µL van een twee X SDS-monsterbuffer toe. Verwijder vervolgens de sucrose-kussens uit de SW 41 TI dunwandige buizen en voeg drie mL lysisbuffer toe aan elk pellet.

Voeg één milliliter 10%tritton X 100 toe tot een eindconcentratie van 2%. Voeg na het oplossen van elk pellet door sonicatie lysisbuffer toe tot een totaal volume van vijf milliliter en centrifugeer. Oogst, zoals voorheen, de bovenste fracties van membraaneiwitcomplexen in 15 milliliter falcon tubes. Voeg lysisbuffer met 2%tritton X 100 toe tot een eindvolume van zeven milliliter.

Gebruik 70 µL van deze monsters voor SDS-PAGE en immuno-bloedanalyses. Equilibreer eerst het antilichaam-gekoppelde eiwit. Was de sero-beads twee keer met 4 mL lysisbuffer, verdun dit tot 8 mL en verdeel over aliquots.

Voeg één milliliter van de suspensie toe aan elk van de acht 15 milliliter falcon-buizen die oplosbare of membraaneiwitcomplexen bevatten van TP-verzadigde en TP-uitgeputte stikstof 14 en stikstof 15 gelabelde cellen; incubeer gedurende twee uur bij vier graden Celsius op een buizenroller om eiwitcomplexen neer te slaan. Pelleteer de beads door centrifugatie en verwijder de supernatanten, waarbij een klein volume vloeistof bovenop de beads wordt achtergelaten om contaminatie door eiwitten die aan de plastic wanden kleven te voorkomen. Transfer de monsters naar nieuwe 1,5 milliliter conische buizen om alle resterende beads in de falcon-buizen te verzamelen. Voeg nog eens 0,8 milliliter lysisbuffer met 0,1% tritton toe aan elk monster, vortex kort, centrifugeer voorzichtig en transfer de buffer met de resterende beads naar de einor-buizen. Na verschillende wasstappen worden de monsters gedurende 15 seconden gecentrifugeerd bij 16.100 ×g en vier graden Celsius.

Verwijder eerst de supernatanten van de monsters met een normale pipet. Verwijder vervolgens alle resterende supernatant volledig met de 50 µL Hamilton-spuit. Voeg aan elk monster 100 µL vers bereide elutiebuffer toe en incubeer in een thermomixer bij 800 RPM; centrifugeer de monsters gedurende 15 seconden bij 16.100 ×g en 25 °C.

Breng nu elk supernatant over naar een nieuw buisje met een schone Hamilton-spuit van 50 µL. Voeg ook 50 µL elutiebuffer toe aan de kralen, zoals eerder bij de monsters is gedaan, en voeg de respectievelijke eluate samen. Vergeet niet om 30 µL van alle monster-EIT's te reserveren voor SDS-PAGE en immunoblots-analyses.

Combine nu de geëlueerde precipitaties van de met plus en minus ATP behandelde stikstof-14 en stikstof-15 gelabelde oplosbare en membraanproteïnen. Voer vervolgens reductie-alkylering en een initiële hoge ureumvertering uit zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Ga verder met een triptiek-vertering op een rotatiewiel gedurende ten minste 16 uur.

Bij 37 °C. Pelleteer de tripsine-beads door vijf minuten te centrifugeren bij 16 100 ×g en 4 °C. Draag de supernatanten over naar nieuwe eppendorfbuisjes van 2 mL.

Was de oude buisjes met 50 µL 20 mM ammoniumbicarbonaat, 0,5% azijnzuur en voeg dit samen met de eerste supernatanten. Om zelfgemaakte C 18-tips voor het ontzouten van de monsters voor te bereiden, snijdt u met een injectienaald twee schijfjes uit emcor C 18-materiaal en plaatst u deze in een 200 µL pipetpunt. Prik vervolgens gaatjes in de doppen van vier 2 mL einor-buisjes en plaats de tips hierin. Conditioneer de C 18-stadiumtips met 50 µL oplossing B en centrifugeer drie minuten bij 800 ×g en 25 °C.

Equilibreer vervolgens de C 18 stage tips met 100 µL oplossing, centrifugeer drie minuten bij 800 G en 25 °C. Herhaal deze equilibratiestap nogmaals. Laad vervolgens 100 µL van de supernatanten van de triptische digesties op de C 18 stage tips en centrifugeer drie minuten bij 800 G en 25 °C.

Herhaal het laden van de kolom voor een volledige applicatie van de monster-supernatanten. Na het wassen van de C 18 stage tips, elueer de tryptische peptiden in een nieuwe 1,5 milliliter einor tube met 50 microliters van oplossing B; centrifugeer gedurende drie minuten bij 800 G en 25 degrees Celsius. Herhaal de elutiestap eenmaal en droog de peptiden vervolgens volledig in een speed VAC reus.

Suspendeer de gedroogde peptiden in 20 µL van oplossing A en incubeer gedurende ten minste één uur op ijs, onderbroken door twee incubaties van 15 minuten in een sonicatiebadcentrifuge gedurende 20 minuten bij 16.100 ×g en 4 °C, en breng Senna aan op nano C-M-S-M-S HSP 70. Heat shock proteins staan erom bekend alleen in afwezigheid van een TP te interageren met specifieke cos-chaperonnen en substraten; in deze met stikstof 14 gelabelde celextracten zijn hs P 70 B en CGE one bijna uitsluitend gelokaliseerd in de oplosbare fractie, onafhankelijk van de A TP-status. Daarentegen is CF one beta gelokaliseerd in zowel de oplosbare als de membraanverrijkte fracties.

Aangezien sonicatie een deel van CF one beta afscheurt van het membraan waar A TP Synthes is gelokaliseerd, dient dit als ladingscontrole voor beide fracties. Vergelijkbare hoeveelheden H HSP 70 B werden neergeslagen met anti HSP 70 B-antilichamen uit stikstof 14- en stikstof 15-gelabelde oplosbare extracten, onafhankelijk van de A TP-status. In tegenstelling hiermee werden lage niveaus van HS P 70 B-eiwit neergeslagen uit membraanfracties, waarbij iets grotere hoeveelheden afkomstig waren uit TP-uitgeputte membraanfracties vergeleken met TP-verzadigde fracties, zoals verwacht op basis van de affiniteit van CGE E one voor hs.

HSP 70 B is contextafhankelijk. Geen CGE 1 werd co-geprecipiteerd met HSP 70 B in TP-rijke oplosbare of membraanfracties. De hoeveelheden CGE 1-eiwit die co-geprecipiteerd werden met HSP 70 B uit TP-depleteerde oplosbare fracties en TP-depleteerde membraanfracties correleren kwantitatief met de hoeveelheid geprecipiteerd HSP 70 B. De interactie van CGE 1 met HSP 70 B uitsluitend in de ADP-toestand wordt ook waargenomen in de analyse via massaspectrometrie.

In dit experiment werden precipitaten voorbereid voor mengsels van met stikstof-14 gelabelde extracten zonder een TP en met stikstof-15 gelabelde extracten met een TP. Terwijl de zwaar en licht gelabelde vormen van het HS P 70 B-peptide met gelijke intensiteiten werden gedetecteerd, werd alleen de licht gelabelde vorm van het CGE one-peptide uit de TP-uitgeputte extracten gedetecteerd. Dezelfde peptiden uit het anti HS P 70 D DB-precipitaat, afgeleid van mengsels van wederkerig gelabelde oplosbare celextracten, worden hier getoond. Overeenkomstig werd alleen de zwaar gelabelde vorm van het CGE one-peptide in TP-uitgeputte extracten gedetecteerd, evenals zowel de licht als de zwaar gelabelde HSP 70 B-peptiden.

Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u een co-precipitatie-experiment uitvoert met monstervoorbereiding voor massaspectrometrische analyse. Vergeet niet dat contaminaties met menselijke eiwitten, in het bijzonder keratine, uw profielmetingen in de massaspectrometer zullen verstoren; daarom zijn veiligheidsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen, een schone omgeving en reagentia van LCMS-zuiverheid cruciaal tijdens het uitvoeren van deze procedure.