Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van ¹⁵ N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Het algemene doel van het volgende experiment is om specifiek eiwitten te identificeren die interageren met een bepaald doeleiwit in celextracten die oplosbare en membraaneiwitten bevatten. Eerst bereiken we volledige metabolische labeling van chlamydomonas-cellen met stikstof 14 en stikstof 15 en genereren cel-lysaten die een TP bevatten en niet bevatten. Een optionele cross-linking stap helpt om tijdelijke eiwit-eiwitinteracties te stabiliseren. Vervolgens scheiden we de cel-lysaten in fracties, verrijkt met onoplosbare en membraaneiwitten waaruit het doeleiwit, zijn specifieke interactiepartners.

Een controle-eiwit en besmettende eiwitten worden immuno geprecipiteerd en toegelicht. Nu mengen we de immuno geprecipiteerde eiwitten en verteren ze drievoudig en analyseren ze door tandem LCMS. De resultaten onderscheiden tussen echte en valse interactiepartners door verschillende stikstof, 14 stikstof 15 peptideverhoudingen voor eiwitten die specifiek interageren met het doeleiwit en gelijke stikstof te tonen.

14 stikstof 15 peptideverhoudingen voor het doeleiwit, het controle-eiwit en besmettende eiwitten. De methode van keuze voor het analyseren van eiwit-eiwitinteracties is om het eiwit van keuze direct met zijn interactie te immunoprecipiteren. Partners uit celextracten waar beide voorkomen in hun native bevestiging en concentraties.

Bij het doen hiervan worden echter ook besmettende eiwitten geprecipiteerd, voornamelijk omdat ze interageren met de antilichamen die worden gebruikt, aangezien moderne massaspectrometers uiterst gevoelig zijn. Ze zullen ondubbelzinnig ook de besmettende eiwitten identificeren en daardoor is het onmogelijk om fout van ware interactiepartners te onderscheiden. Dit probleem wordt opgelost door de hier getoonde techniek, die is gebaseerd op 15 N metabolische labeling immunoprecipitatie affiniteitsmodulatie hier gemedieerd door de A TP-toestand en kwantitatieve massaspectrometrie.

De techniek zal worden getoond door Stefan SCH Malinger, die een senior PhD-student is in mijn laboratorium. Na het labelen van de cellen gedurende 10 generaties, breng je twee aliquoten van elk stikstof 14 en stikstof 15 gelabelde chlamydomonas-cellen over naar 4G SA-buizen, oogst door centrifugatie Resus, suspendeer de pellets in twee milliliter ijskoud lyseerbuffer en breng de suspensies over naar 15 milliliter Falcon-buizen, verzamel de resterende cellen met een extra één milliliter lyseerbuffer per Eloqua. Voeg 50 microliter van 25 x proteaseremmer en 12,5 microliter van één molair magnesiumchloride toe, soniseer monsters vier keer 20 seconden op ijs voor volledige cel ISIS met 22ste pauzes ertussen voor koeling.

Bereid vier zes milliliter sucrose kussens in SW 41 TI dunne wandbuizen. Leg voorzichtig het hele volume van de cel-lysaten op de sucrose kussens. Balanseer met lyseerbuffer en centrifugeer om oplosbare eiwitcomplexen van membranen te scheiden.

Breng de oplosbare eiwitcomplexen van de bovenkant van de gradiënt over in vier 15 milliliter Falcon-buizen. Zorg ervoor dat je geen delen van het sucrose kussen overbrengt. Voeg vervolgens aan elk monster 10% Triton X 100 toe tot een eindconcentratie van 0,5%Mix zorgvuldig en voeg lyseerbuffer toe tot een totaal volume van zeven milliliter.

Voor SDS-pagina en immunobloedanalyses. Zet 70 microliter van elk oplosbaar celextract opzij in een verse 1,5 milliliter conische buis en voeg 70 microliter van twee XSDS-monsterbuffer toe. Gooi vervolgens de sucrose kussens weg uit de SW 41 TI dunne wandbuizen en voeg drie milliliter lyseerbuffer toe aan elke pellet.

Voeg een milliliter van 10%tritton X 100 toe tot een eindconcentratie van 2%Na het oplossen van elke pellet door sonicatie, voeg lyseerbuffer toe tot een totaal volume van vijf milliliter en centrifugeer. Zoals eerder, oogst de bovenste fracties van membraaneiwitcomplexen in 15 milliliter Falcon-buizen. Voeg lyseerbuffer toe die 2%tritton X 100 bevat tot een eindvolume van zeven milliliter.

Gebruik 70 microliter van deze monsters voor SDS-pagina en immunobloedanalyses. Equilibreer eerst het antilichaam gekoppelde eiwit. A sero beads met twee vier milliliter wasbeurten van lyseerbuffer verdund tot acht milliliter en gealiquoteerd.

Een milliliter van de suspensie in elk van de acht 15 milliliter Falcon-buizen die oplosbare of membraaneiwitcomplexen bevatten van een TP-rijk en een TP-verarmd stikstof 14 en stikstof 15 gelabelde cellen incuberen gedurende twee uur bij vier graden Celsius op een buisrol om eiwitcomplexen te bezinken, pellet de parels door centrifugatie, gooi de supernatanten weg, laat een klein volume vloeistof op de parels achter om besmetting door eiwitten die aan de plastic wanden blijven te voorkomen. Breng monsters over naar verse 1,5 milliliter conische buizen om alle resterende parels in de Falcon-buizen te verzamelen. Voeg nog eens 0,8 milliliter lyseerbuffer met 0,1%tritton toe aan elk vortex, centrifugeer voorzichtig en breng de buffer met resterende parels over naar de einorbuizen Na verschillende wasstappen, centrifugeer monsters gedurende 15 seconden bij 16.100 keer G en vier graden Celsius.

Verwijder eerst de monstersupernatanten met een normale pipette. Verwijder vervolgens alle resterende supernatant volledig met de 50 microliter Hamilton-spuit. Voeg aan elk monster 100 microliter vers bereide elutiebuffer toe en incubeer in een thermomixer bij 800 RPM, centrifugeer de monsters gedurende 15 seconden bij 16.100 keer G en 25 graden Celsius.

Breng nu elk supernatant over naar een verse buis met behulp van een schone 50 microliter Hamilton-spuit. Voeg ook 50 microliter elutiebuffer toe aan de parels, verwerk zoals bij monsters eerder en verzamel de respectieve eluaten. Vergeet niet om 30 microliter van alle monster EIT's voor SDS-pagina en immunobloedanalyses te reserveren.

Combineer nu de eludeerde precipitaatjes van plus en min A TP-behandelde stikstof 14 en stikstof 15 gelabelde oplosbare en membraaneiwitten. Voer vervolgens reductie alkylering en initiële hoge ureumvertering uit zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Ga verder met een triptych-vertering op een draaiwiel gedurende minimaal 16 uur.

Bij