Name: Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van 15 N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Leer een verfijnde QUICK-methode voor het identificeren van eiwit-eiwitinteracties met behulp van 15N metabole labeling, immunoprecipitatie en kwantitatieve massaspectrometrie. Deze techniek onderscheidt ware interacties van verontreinigingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Olivier Vallon voor het antiserum tegen CF1β. Dit werk werd ondersteund door het Max Planck Instituut en subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (Systems Biology Initiative FORSYS, project GoFORSYS).

<ol><li>Perrakis, A., Musacchio, A., Cusack, S., Petosa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+a+macromolecular+complex%3A+the+toolkit+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating a macromolecular complex: the toolkit of methods.</a> J. Struct. Biol. 175, 106-112 (2011).</li>
<li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction%3A+mass+spectrometry-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 42-49 (2011).</li>
<li>Markham, K., Bai, Y., Schmitt-Ulms, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitations+revisited%3A+an+update+on+experimental+concepts+and+their+implementation+for+sensitive+interactome+investigations+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitations revisited: an update on experimental concepts and their implementation for sensitive interactome investigations of endogenous proteins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 389, 461-473 (2007).</li>
<li>Selbach, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+screening+by+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+%28QUICK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown (QUICK.</a> Nat Methods. 3, 981-983 (2006).</li>
<li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+recipe+for+stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+%28SILAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC).</a> Nat Protoc. 1, 2650-2660 (2006).</li>
<li>Heide, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+quantitative+immunoprecipitation+combined+with+knockdown+and+cross-linking+to+Chlamydomonas+reveals+the+presence+of+vesicle-inducing+protein+in+plastids+1+in+a+common+complex+with+chloroplast+HSP90C%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Application of quantitative immunoprecipitation combined with knockdown and cross-linking to Chlamydomonas reveals the presence of vesicle-inducing protein in plastids 1 in a common complex with chloroplast HSP90C.</a> Proteomics. 9, 3079-3089 (2009).</li>
<li>Nordhues, A., Miller, S. M., Muhlhaus, T., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+roles+of+molecular+chaperones+in+Chlamydomonas+and+Volvox%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">New insights into the roles of molecular chaperones in Chlamydomonas and Volvox.</a> International review of cell and molecular biology. 285, 75-113 (2010).</li>
<li>Mayer, M. P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones%3A+cellular+functions+and+molecular+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism.</a> Cell Mol. Life Sci. 62, 670-684 (2005).</li>
<li>Schroda, M., Vallon, O., Whitelegge, J. P., Beck, C. F., Wollman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chloroplastic+GrpE+homolog+of+Chlamydomonas%3A+two+isoforms+generated+by+differential+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The chloroplastic GrpE homolog of Chlamydomonas: two isoforms generated by differential splicing.</a> The Plant Cell. 13, 2823-2839 (2001).</li>
<li>Willmund, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEAT+SHOCK+PROTEIN+90C+is+a+bona+fide+Hsp90+that+interacts+with+plastidic+HSP70B+in+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">HEAT SHOCK PROTEIN 90C is a bona fide Hsp90 that interacts with plastidic HSP70B in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Physiol. 138, 2310-2322 (2005).</li>
<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarris%2C+EH+%22The+Chlamydomonas+Sourcebook%3A+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use%22">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use</a>. , Elsevier, Academic Press. San Diego, CA. (2008).</li>
<li>Mortensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSQuant%2C+an+open+source+platform+for+mass+spectrometry-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">MSQuant, an open source platform for mass spectrometry-based quantitative proteomics.</a> J. Proteome Res. 9, 393-403 (2010).</li>
<li>M?hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Shotgun+Proteomics+Using+a+Uniform+15N-Labeled+Standard+to+Monitor+Proteome+Dynamics+in+Time+Course+Experiments+Reveals+New+Insights+into+the+Heat+Stress+Response+of+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Shotgun Proteomics Using a Uniform 15N-Labeled Standard to Monitor Proteome Dynamics in Time Course Experiments Reveals New Insights into the Heat Stress Response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Bukau, B., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp70+and+Hsp60+chaperone+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines.</a> Cell. 92, 351-366 (1998).</li>
<li>Wandinger, S. K., Richter, K., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 283, 18473-18477 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben onlangs twee verbeteringen aan de QUICK aanpak: een verknopingsstap voor het vastleggen van voorbijgaande eiwit-eiwit interacties (QUICK-X), en een controle-precipitatie te normaliseren voor ongelijke neerslag efficiëntie 6. Hier hebben we een protocol met de twee andere verbeteringen van QUICK presenteren: ten eerste, vervangen we SILAC 5 voor 15 N metabolische labeling. De voordelen zijn dat 15 N metabolische labeling is veel goedkoper dan SILAC als 15 N wordt verschaft als eenvoudige anorganische zout. Bovendien met 15 N metabolische labeling QUICK kan op organismen prototrofisch voor alle aminozuren, zoals de meeste planten, schimmels en bacteriën. Slotte kan arginine naar proline interconversie inherent aan SILAC 5,6 geen probleem voor de kwantificering van 15 N gemerkte peptiden. Voorbeelden van geschikte instrumenten voor de kwantitatieve evaluatie van 15 N proteomics data zijn MSQUANT 12 of IOMIQS 13. Tweede introduceren wij affiniteit modulatie als middel voor specifiek reduceren van de hoeveelheid eiwitten interageren met een bepaald doeleiwit in een monster versus andere. De voordelen van deze benadering zijn dat de constructie van knockdown mutanten, die om modelsystemen moeilijk te genereren of kunnen worden gegenereerd om alle om wezenlijke doeleiwitten omzeilt. Bovendien voorkomt misverstanden door differentiële eiwitexpressie mogelijk gebeurt als reactie van de cel te kloppen-down een doeleiwit: als andere eiwitten downgereguleerd ook en kruisreageren met het antiserum voor immunoprecipitatie, zouden ze worden uitgelegd als echte interactiepartners van het doeleiwit. Tenslotte affiniteit modulatie maakt het overbodig vinden van een goede antilichaam-antigen to-ratio. Hoewel we passen onze protocol om Chlamydomonas reinhardtii als modelorganismeKan gemakkelijk worden aangepast aan andere organismen die kunnen worden gekweekt in celkweek en kan ammonium of nitraat als stikstofbron. Affiniteit modulatie van eiwitcomplexen door ATP / ADP kan direct worden toegepast op andere chaperones waarvan de wisselwerking met substraten en eiwitten cohort afhankelijk van de ATP toestand, zoals HSP90 of GroEL/HSP60/Cpn60 chaperone systemen 14,15, of andere systemen waarbij bindingsaffiniteiten worden gemoduleerd door ATP. Affinity modulatie ook werken wanneer verwantschap tussen eiwitinteracties worden gewijzigd door specifieke geneesmiddelen, zoals geldanamycine radicicol of bij HSP90 systemen 15. Een duidelijke beperking van ons protocol is dat het vereist affiniteitsgezuiverde antilichamen tegen een doeleiwit bekend is gevoelig voor een specifieke behandeling / geneesmiddel dat zijn affiniteit voor eiwitten partner moduleert. Daarom is geen high-throughput methode.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> ProteinA Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimethyl pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Bewaar gedroogde bij -20 ° C, direct te ontbinden voor gebruik </td></tr><tr><td> Proteaseremmer (complete, EDTA-vrij) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (Adenosin-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Creatinefosfaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Creatinefosfokinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP dithiobis [succinimidylpropionaat] </td><td> Thermo sientific </td><td> 22585 </td><td> Bewaar gedroogde bij 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge isotopenlaboratoria, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (Endoproteïnase Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine beads (Poroszyme Geïmmobiliseerde trypsine) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Meng krachtig direct voor gebruik </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 mm Disk </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; n metabole labeling, immunoprecipitatie, kwantitatieve massaspectrometrie en affiniteit modulatie

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Eiwit-eiwit interacties zijn essentieel voor vele biologische processen in de cel. Derhalve hun karakterisering speelt een belangrijke rol in lopend onderzoek en een overvloed van werkwijzen voor hun onderzoek beschikbaar 1. Eiwit-eiwit interacties vaak zeer dynamisch en kan afhangen van subcellulaire lokalisatie, post-translationele modificaties en de lokale omgeving eiwit 2. Daarom moeten ze worden onderzocht in hun natuurlijke omgeving, waarbij co-immunoprecipitatie bevorderen, de voorkeursmethode 3. Gecoprecipiteerde interactiepartners worden ofwel door immunoblotting in een gerichte benadering of door massaspectrometrie (LC-MS/MS) in een ongerichte wijze. De laatste strategie wordt vaak negatief beïnvloed door een groot aantal fout-positieve ontdekkingen, voornamelijk afkomstig van de hoge gevoeligheid van de moderne massaspectrometers die vol vertrouwen te sporen sporen van niet-specifiek precipiterende eiwitten. Een recent benadering voor dit probleem is gebaseerd op het idee dat verlaagde hoeveelheden van specifieke interactiepartners zal co-precipitaat met een bepaald doeleiwit waarvan cellulaire concentratie verminderd RNAi, terwijl de hoeveelheid niet-specifiek neerslaan eiwitten worden beïnvloed. Deze aanpak, genaamd QUICK voor kwantitatieve Immunoprecipitatie In combinatie met Knockdown 4, telt stabiele isotoop labeling van aminozuren in celcultuur (SILAC) 5 en de lidstaten om de hoeveelheden eiwitten immunogeprecipiteerd van wild-type en knock-down stammen te kwantificeren. Eiwitten in een verhouding van 1:1 kan worden beschouwd als verontreinigingen, die verrijkt in precipitaten van de wildtype als specifieke interactiepartners van het doeleiwit. Hoewel innovatieve, QUICK draagt ​​een aantal beperkingen: ten eerste, SILAC is dure en beperkt tot organismen die ideaal zijn auxotrofe voor arginine en / of lysine. Bovendien, wanneer zware arginine wordt toegevoerd, arginine naar proline interconversie resultaten additional massa verschuivingen voor elke proline in een peptide en licht verdunt zware met lichte arginine, waardoor kwantificering meer vervelend en minder nauwkeurig 5,6. Ten tweede, vereist dat antilichamen worden getitreerd zodat zij niet verzadigd met doeleiwit in extracten van knock-down mutanten. Hier we een gemodificeerde QUICK protocol dat bovengenoemde beperkingen van QUICK door vervanging SILAC 15 N metabolische labeling en vervangen RNAi-gemedieerde knock-down voor affiniteit modulatie van eiwit-eiwit interacties overwint. We tonen de toepasbaarheid van dit protocol met de eencellige groene alg Chlamydomonas reinhardtii als modelorganisme en de chloroplast HSP70B chaperonne als doeleiwit 7 (figuur 1). HSP70s is bekend interageren met specifieke co-chaperones en substraten alleen in staat ADP 8. We benutten deze eigenschap als een middel om de specifieke te controlereninteractie van HSP70B met nucleotide exchange factor CGE1 9.

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd op<sup&gt; 15N</sup&gt; Metabolische labeling, de modulatie van affiniteiten van eiwit-eiwit interacties door de aanwezigheid / afwezigheid van ATP, immunoprecipitatie en kwantitatieve massaspectrometrie.

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Eiwit-eiwitinteracties zijn fundamenteel voor veel biologische processen in de cel. Daarom speelt hun karakterisering een belangrijke rol bij ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het identificeren van eiwitten die specifiek interageren met een bepaald doeleiwit in celextracten die oplosbare en membraaneiwitten bevatten. Bereik eerst een volledige metabole markering van chlamydomonas-cellen met stikstof 14 en stikstof 15 en genereer cellysaten met en zonder een TP. Een optionele cross-linking-stap helpt om transiënte eiwit-eiwitinteracties te stabiliseren. Scheid vervolgens de cellysaten in fracties, verrijkt met onoplosbare en membraaneiwitten, waaruit het doeleiwit en de specifieke interactiepartners worden geïsoleerd.Een controleproteïne en contaminerende proteïnen worden immunoprecipiteerd en geëlukt. Meng vervolgens de immunoprecipiteerde proteïnen, voer een drievoudige digestie uit en analyseer deze via tandem LCMS. De resultaten maakten onderscheid tussen ware en valse interactiepartners door verschillende ratio's van 14N/15N-peptiden aan te tonen voor proteïnen die specifiek interageren met het doeleiwit, en gelijke stikstofratio's voor overige proteïnen.14 stikstof 15 peptide-ratio's voor het doeleiwit, het controle-eiwit en contaminerende eiwitten. De voorkeursmethode voor het analyseren van eiwit-eiwitinteracties is het immunoprecipiteren van het gekozen eiwit direct samen met zijn interactiepartners uit celextracten, waarin beide in hun natuurlijke conformatie en concentraties voorkomen.Wanneer dit echter gebeurt, slaan ook contaminerende eiwitten neer, voornamelijk omdat ze interageren met de gebruikte antilichamen, aangezien moderne massaspectrometers extreem gevoelig zijn. Deze zullen onmiskenbaar ook de contaminerende eiwitten identificeren, waardoor het onmogelijk is om onderscheid te maken tussen foutpositieven en echte interactiepartners. Dit probleem wordt opgelost door de hier getoonde techniek, die is gebaseerd op 15 N metabole labelings-immunoprecipitatie-affiniteitsmodulatie, hier gemedieerd door de ATP-status, en kwantitatieve massaspectrometrie.De techniek zal worden gedemonstreerd door Stefan SCH Malinger, een senior PhD-student in mijn laboratorium. Nadat de cellen gedurende 10 generaties zijn gelabeld, worden twee aliquoten van zowel stikstof 14- als stikstof 15-gelabelde Chlamydomonas-cellen overgebracht naar 4G SA-buisjes en geoogst door centrifugatie. Resuspendeer de pellets in twee milliliters ijskoude lysisbuffer en breng de suspensies over naar 15 milliliter Falcon-buisjes; verzamel de resterende cellen uit elke aliquot met een aanvullende milliliter lysisbuffer. Voeg 50 microliters 25x proteaseinhibitor en 12,5 microliters 1 molar magnesiumchloride toe. Sonicate de monsters vier keer gedurende 20 seconden op ijs voor volledige cellysis, met tussentijdse pauzes van 20 seconden voor afkoeling.Bereid vier sucrosekussens van 6 ml voor in SW 41 TI dunwandige buisjes. Breng het volledige volume van de cellysaten voorzichtig aan op de sucrosekussens. Vul aan met lysisbuffer en centrifugeer om oplosbare proteïnecomplexen van membranen te scheiden.Overbreng de oplosbare proteïnecomplexen van de bovenkant van de gradiënt naar vier Falcon-buisjes van 15 milliliter. Zorg ervoor dat er geen delen van het sucrosekussen worden overgebracht. Voeg vervolgens aan elk monster 10% Triton X 100 toe tot een eindconcentratie van 0,5%. Meng voorzichtig en voeg lysisbuffer toe tot een totaalvolume van zeven milliliter.Voor SDS-PAGE en immuno-bloedanalyses. Breng 70 µL van elk oplosbaar celextract over naar een nieuwe conische buis van 1,5 mL en voeg 70 µL van een twee X SDS-monsterbuffer toe. Verwijder vervolgens de sucrose-kussens uit de SW 41 TI dunwandige buizen en voeg drie mL lysisbuffer toe aan elk pellet.Voeg één milliliter 10%tritton X 100 toe tot een eindconcentratie van 2%. Voeg na het oplossen van elk pellet door sonicatie lysisbuffer toe tot een totaal volume van vijf milliliter en centrifugeer. Oogst, zoals voorheen, de bovenste fracties van membraaneiwitcomplexen in 15 milliliter falcon tubes. Voeg lysisbuffer met 2%tritton X 100 toe tot een eindvolume van zeven milliliter.Gebruik 70 µL van deze monsters voor SDS-PAGE en immuno-bloedanalyses. Equilibreer eerst het antilichaam-gekoppelde eiwit. Was de sero-beads twee keer met 4 mL lysisbuffer, verdun dit tot 8 mL en verdeel over aliquots.Voeg één milliliter van de suspensie toe aan elk van de acht 15 milliliter falcon-buizen die oplosbare of membraaneiwitcomplexen bevatten van TP-verzadigde en TP-uitgeputte stikstof 14 en stikstof 15 gelabelde cellen; incubeer gedurende twee uur bij vier graden Celsius op een buizenroller om eiwitcomplexen neer te slaan. Pelleteer de beads door centrifugatie en verwijder de supernatanten, waarbij een klein volume vloeistof bovenop de beads wordt achtergelaten om contaminatie door eiwitten die aan de plastic wanden kleven te voorkomen. Transfer de monsters naar nieuwe 1,5 milliliter conische buizen om alle resterende beads in de falcon-buizen te verzamelen. Voeg nog eens 0,8 milliliter lysisbuffer met 0,1% tritton toe aan elk monster, vortex kort, centrifugeer voorzichtig en transfer de buffer met de resterende beads naar de einor-buizen. Na verschillende wasstappen worden de monsters gedurende 15 seconden gecentrifugeerd bij 16.100 ×g en vier graden Celsius.Verwijder eerst de supernatanten van de monsters met een normale pipet. Verwijder vervolgens alle resterende supernatant volledig met de 50 µL Hamilton-spuit. Voeg aan elk monster 100 µL vers bereide elutiebuffer toe en incubeer in een thermomixer bij 800 RPM; centrifugeer de monsters gedurende 15 seconden bij 16.100 ×g en 25 °C.Breng nu elk supernatant over naar een nieuw buisje met een schone Hamilton-spuit van 50 µL. Voeg ook 50 µL elutiebuffer toe aan de kralen, zoals eerder bij de monsters is gedaan, en voeg de respectievelijke eluate samen. Vergeet niet om 30 µL van alle monster-EIT's te reserveren voor SDS-PAGE en immunoblots-analyses.Combine nu de geëlueerde precipitaties van de met plus en minus ATP behandelde stikstof-14 en stikstof-15 gelabelde oplosbare en membraanproteïnen. Voer vervolgens reductie-alkylering en een initiële hoge ureumvertering uit zoals beschreven in het bijbehorende manuscript. Ga verder met een triptiek-vertering op een rotatiewiel gedurende ten minste 16 uur.Bij 37 °C. Pelleteer de tripsine-beads door vijf minuten te centrifugeren bij 16 100 ×g en 4 °C. Draag de supernatanten over naar nieuwe eppendorfbuisjes van 2 mL.Was de oude buisjes met 50 µL 20 mM ammoniumbicarbonaat, 0,5% azijnzuur en voeg dit samen met de eerste supernatanten. Om zelfgemaakte C 18-tips voor het ontzouten van de monsters voor te bereiden, snijdt u met een injectienaald twee schijfjes uit emcor C 18-materiaal en plaatst u deze in een 200 µL pipetpunt. Prik vervolgens gaatjes in de doppen van vier 2 mL einor-buisjes en plaats de tips hierin. Conditioneer de C 18-stadiumtips met 50 µL oplossing B en centrifugeer drie minuten bij 800 ×g en 25 °C.Equilibreer vervolgens de C 18 stage tips met 100 µL oplossing, centrifugeer drie minuten bij 800 G en 25 °C. Herhaal deze equilibratiestap nogmaals. Laad vervolgens 100 µL van de supernatanten van de triptische digesties op de C 18 stage tips en centrifugeer drie minuten bij 800 G en 25 °C.Herhaal het laden van de kolom voor een volledige applicatie van de monster-supernatanten. Na het wassen van de C 18 stage tips, elueer de tryptische peptiden in een nieuwe 1,5 milliliter einor tube met 50 microliters van oplossing B; centrifugeer gedurende drie minuten bij 800 G en 25 degrees Celsius. Herhaal de elutiestap eenmaal en droog de peptiden vervolgens volledig in een speed VAC reus.Suspendeer de gedroogde peptiden in 20 µL van oplossing A en incubeer gedurende ten minste één uur op ijs, onderbroken door twee incubaties van 15 minuten in een sonicatiebadcentrifuge gedurende 20 minuten bij 16.100 ×g en 4 °C, en breng Senna aan op nano C-M-S-M-S HSP 70. Heat shock proteins staan erom bekend alleen in afwezigheid van een TP te interageren met specifieke cos-chaperonnen en substraten; in deze met stikstof 14 gelabelde celextracten zijn hs P 70 B en CGE one bijna uitsluitend gelokaliseerd in de oplosbare fractie, onafhankelijk van de A TP-status. Daarentegen is CF one beta gelokaliseerd in zowel de oplosbare als de membraanverrijkte fracties.Aangezien sonicatie een deel van CF one beta afscheurt van het membraan waar A TP Synthes is gelokaliseerd, dient dit als ladingscontrole voor beide fracties. Vergelijkbare hoeveelheden H HSP 70 B werden neergeslagen met anti HSP 70 B-antilichamen uit stikstof 14- en stikstof 15-gelabelde oplosbare extracten, onafhankelijk van de A TP-status. In tegenstelling hiermee werden lage niveaus van HS P 70 B-eiwit neergeslagen uit membraanfracties, waarbij iets grotere hoeveelheden afkomstig waren uit TP-uitgeputte membraanfracties vergeleken met TP-verzadigde fracties, zoals verwacht op basis van de affiniteit van CGE E one voor hs.HSP 70 B is contextafhankelijk. Geen CGE 1 werd co-geprecipiteerd met HSP 70 B in TP-rijke oplosbare of membraanfracties. De hoeveelheden CGE 1-eiwit die co-geprecipiteerd werden met HSP 70 B uit TP-depleteerde oplosbare fracties en TP-depleteerde membraanfracties correleren kwantitatief met de hoeveelheid geprecipiteerd HSP 70 B. De interactie van CGE 1 met HSP 70 B uitsluitend in de ADP-toestand wordt ook waargenomen in de analyse via massaspectrometrie.In dit experiment werden precipitaten voorbereid voor mengsels van met stikstof-14 gelabelde extracten zonder een TP en met stikstof-15 gelabelde extracten met een TP. Terwijl de zwaar en licht gelabelde vormen van het HS P 70 B-peptide met gelijke intensiteiten werden gedetecteerd, werd alleen de licht gelabelde vorm van het CGE one-peptide uit de TP-uitgeputte extracten gedetecteerd. Dezelfde peptiden uit het anti HS P 70 D DB-precipitaat, afgeleid van mengsels van wederkerig gelabelde oplosbare celextracten, worden hier getoond. Overeenkomstig werd alleen de zwaar gelabelde vorm van het CGE one-peptide in TP-uitgeputte extracten gedetecteerd, evenals zowel de licht als de zwaar gelabelde HSP 70 B-peptiden.Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u een co-precipitatie-experiment uitvoert met monstervoorbereiding voor massaspectrometrische analyse. Vergeet niet dat contaminaties met menselijke eiwitten, in het bijzonder keratine, uw profielmetingen in de massaspectrometer zullen verstoren; daarom zijn veiligheidsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen, een schone omgeving en reagentia van LCMS-zuiverheid cruciaal tijdens het uitvoeren van deze procedure.

a-protocol-for-identification-protein-protein-interactions-based-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

SILAC immunoprecipitatie experimenten vormen een krachtig middel voor het ontdekken van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, waar interacties gemakkelijk kan worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen en lage affiniteit interacties bewaard door het gebruik van minder stringente buffer omstandigheden.

Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Wij bieden een stapsgewijze protocol voor split-BioID, een eiwit fragmenten-complementatie test gebaseerd op de nabijheid-labeling techniek BioID. Geactiveerd op de interactie tussen twee bepaalde eiwitten, hierdoor de proteomics analyse van context-afhankelijke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving. De methode is eenvoudig, kosteneffectief en vereist alleen gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden.

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) gebruikt Flowcytometrie voor gevoelige detectie van verschillen in de overvloed van gerichte eiwit-eiwit interacties tussen twee monsters. QMI kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid biomateriaal, vereist geen genetisch gemanipuleerde Tags en kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk.

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Leer een verfijnde QUICK-methode voor het identificeren van eiwit-eiwitinteracties met behulp van 15N metabole labeling, immunoprecipitatie en kwantitatieve massaspectrometrie. Deze techniek onderscheidt ware interacties van verontreinigingen.

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van 15 N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie (Video) | JoVE Journal

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van

Meer video's verkennen