Het creëren van Defined Gasvormige omgevingen om de gevolgen van hypoxie Studie naar C. elegans

Het doel van het volgende experiment is om een hypoxiekamer op te zetten en te onderhouden met behulp van een continue stroommethode. Dit wordt bereikt door de benodigde buizen, kolven en kamers te verkrijgen en te fabriceren voor de procedure. Als tweede stap sluit u de zuurstoftank aan en selecteert u de stroomsnelheid om het gewenste niveau van hypoxie te creëren.

Hydraat het gas door het door een bubbelfles gevuld met gedeïoniseerd water te laten lopen. Verbind het gehydrateerde gas met de hypoxiekamer en plaats de testmonsters in de kamer om ze bloot te stellen aan hypoxische omstandigheden. Er worden resultaten verkregen die Hi F1 afhankelijke embryonale letaliteit in hypoxie laten zien op basis van het observeren van levensvatbaarheid tot volwassenheid.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals handschoenenkastjes, is dat het eenvoudig en goedkoop is om in het laboratorium te fabriceren en een nauwkeurige en reproduceerbare concentratie gassen in de omgevingskamer biedt. Hoewel deze methode inzicht biedt in de hypoxische respons in de nematode C elegance, kan deze ook worden aangepast aan andere systemen, inclusief grotere modelorganismen en celcultuur. Bovendien kan het worden gebruikt om andere gassen te bestuderen, inclusief kooldioxide en waterstofsulfide.

Dit protocol laat zien hoe een hypoxiekamer wordt gebouwd. Gas wordt opgeslagen in persluchtflessen met gedefinieerde zuurstofconcentraties, en een tweedelige regulator is bevestigd. Gas komt de bodem van de stroombuis binnen en komt aan de bovenkant met de juiste stroomsnelheid uit.

Het gas stroomt vervolgens naar de bubbelfles en hydrateert het gas. Het hydrogas stroomt vervolgens door de instroomklep naar de hypoxiekamer en stelt de monsters bloot aan hypoxie. Het gas komt uiteindelijk via een in de kamer geboord uitlaatgat in de ruimte.

Een Pyrex kristallisatiebakje of een pijlpakketbakje kan worden gebruikt als het lichaam van de omgevingskamer. Het volume van de container moet minimaal zijn en het materiaal moet ondoordringbaar zijn voor gas. Boor een gat in een zijde van de container met een koolstof- of diamanttip, boor en pas aan met een fitting voor plastic slangen.

Meng de epoxy voor aanbrenging op de doos en fitting. Herhaal vervolgens dezelfde procedure aan de andere kant van de container met de tweede gat die is verschoven ten opzichte van de eerste. Gebruik om turbulente menging te verhogen een buitendiameter van een achtste inch, FEP of nylon slang om de persluchtflessen aan te sluiten op een stroomsnelheidsregeling, zoals een massastroomsnelheidsregelaar of een rotormeter.

De gasflessen moeten gedefinieerde zuurstofconcentraties hebben die zijn gebalanceerd met stikstof die een gecertificeerde standaard is voor zuurstofgehalte of voor anoxische omstandigheden. Gebruik zuiver stikstof een tweedelige regulator met de tweede stap ingesteld op de gewenste druk. Zie de instructies in het schriftelijke protocol voor het selecteren van een geschikte stroomsnelheid.

Verbind vervolgens de slang van de tweedelige regulator met de stroombuis die de stroomsnelheid van het gas dat de kamer binnenkomt, regelt. De uitlaten van de stroombuis zijn verbonden met een gaswasfles met een frittencilinder die gedistilleerd water bevat. Verbind vervolgens de slang aan de andere kant van de wasfles met een van de aansluitingen op de omgevingskamer.

Dit zal het gas dat de omgevingskamer binnenkomt hydrateren. Gebruik vacuümvet om de kamer te verzegelen. Plaats vervolgens gewichten op het deksel van de kamer om een luchtdichte afdichting te garanderen.

Test de afdichting door een kleine hoeveelheid water in de palm van een behandschoende hand te houden bij de gastoestromingsfitting op de kamer en controleer op bubbels. Genereer eerst gesynchroniseerde populaties van zee Elgan. Plaats één tot 100 GR-volwassenen in een druppel alkalische bleekoplossing op het oppervlak van een ongezaaide nematodegroeimediaplaat.

Laat de bleekoplossing absorberen in de plaat na een incubatieperiode van minimaal acht uur. Breng de gesynchroniseerde L een larven over naar een plaat gezaaid met levende OP 50-bacteriën. Of laat GRA-volwassenen eieren leggen op de plaat gedurende twee tot drie uur om een groep wormen te genereren die synchronisch zullen ontwikkelen of kies L vier larven uit een gemengde populatie om jonge embryo's te verzamelen.

In het twee tot vier celstadium gebruikt u een scheermes om GR-volwassenen in een kleine hoeveelheid water te snijden en draagt u vervolgens de embryo's over met een mondpijp voordat u de wormen overbrengt naar de plaat voor blootstelling aan hypoxische omstandigheden. Plaats een ring van 10 milligram per milliliter palmitinezuur in ethanol rond de rand van de platen. Om te voorkomen dat de wormen ontsnappen aan het oppervlak van de agarplaat.

Het palmitinezuur zal uit de oplossing komen. Terwijl het ethanol verdampt en een fysische barrière vormt om uniformiteit te garanderen, zorg ervoor dat u het water in de gaswasfles vervangt voordat u het blootstelt in de omgevingskamer. Na het overbrengen van de wormen naar de platen, verzegelt u de platen in de omgevingskamer, start u de gasstroom en houdt u de blootstelling aan voor de gewenste tijd voor het onderzoek.

Voor de levensvatbaarheid van embryo's tot volwassenheid, laat u de wormen 48 uur ontwikkelen na de terugkeer naar kamerlucht, waarna ze de vierde larvenstadium of eendagsvolwassenen moeten zijn. Om de blootstelling aan hypoxie te visualiseren, brengt u de wormen over naar een druppel M negen op een 22 millimeter vierkante dekglas en keert u deze om op een kussen van 2% aros in M negen, indien nodig.

25 millimolair van amol of 10 millimolair natriumazid kan worden gebruikt als verdovingsmiddel. Of, na blootstelling aan hypoxie, kan de transparante omgevingskamer direct op het podium van een dissectiescoop worden geplaatst. Er worden twee weergaven getoond, een met de volledige gasstroomopstelling.

De andere met alleen de kamer op het microscooppodium. Laat Bristol N twee wormen groeien op vier 10 centimeter hoge groeiplatte tot de meerderheid