Het creëren van Defined Gasvormige omgevingen om de gevolgen van hypoxie Studie naar C. elegans

Het doel van het volgende experiment is het opzetten en onderhouden van een hypoxiekamer met behulp van een continue-stroommethode. Dit wordt bereikt door de benodigde buizen, kolven en kamers voor de procedure te verkrijgen en te vervaardigen. Sluit in een tweede stap de zuurstoftank aan en selecteer de stroomsnelheid om het gewenste niveau van hypoxie te creëren.

Hydrateer het gas door het door een borreltraps te leiden die gevuld is met gedeïoniseerd water. Verbind het gehydrateerde gas met de hypoxiekamer en plaats de testmonsters in de kamer om ze bloot te stellen aan hypoxische omstandigheden. De resultaten tonen Hi F1-afhankelijke embryonale letaliteit bij hypoxie aan op basis van de observatie van de levensvatbaarheid tot aan de volwassenheid.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals glove boxes, is dat deze eenvoudig en goedkoop in het laboratorium te vervaardigen is en een nauwkeurige en reproduceerbare concentratie gassen in de omgevingskamer biedt. Hoewel deze methode inzicht biedt in de hypoxische respons bij de nematode C elegance, kan deze ook worden aangepast voor andere systemen, waaronder grotere modelorganismen en celculturen. Daarnaast kan het worden gebruikt om andere gassen te bestuderen, waaronder koolstofdioxide en waterstofsulfide.

Dit protocol demonstreert hoe men een hypoxiekamer construeert. Gas wordt bewaard in samengeperste gastanks met gedefinieerde zuurstofconcentraties, waaraan een tweetrapsregelaar is bevestigd. Het gas stroomt de onderkant van de doorstroombuis binnen en verlaat de bovenkant met de juiste stroomsnelheid.

Het gas stroomt vervolgens de borreltuim in, waardoor het gas wordt gehydrateerd. Het gas stroomt vervolgens via de inlaatklep de hypoxiekamer in, waardoor de monsters aan hypoxie worden blootgesteld. Ten slotte ontsnapt het gas via een in de kamer geboord uitlaatgat naar de kamer.

Een Pyrex crystallisatieschaal of een arrow pack-doos kan worden gebruikt als behuizing van de omgevingskamer. Het volume van de container moet tot een minimum worden beperkt en het materiaal moet gasdicht zijn. Boor met een koolstof- of diamantboor een gat in één zijde van de container en monteer hierin een plastic slangnippel.

Meng de epoxy voordat u deze aanbrengt op de doos en de koppeling. Herhaal vervolgens dezelfde procedure aan de tegenovergestelde zijde van de container, waarbij het tweede gat verschoven is ten opzichte van het eerste. Om de turbulente menging te verhogen, gebruikt u FEP- of nylonbuisjes met een buitendiameter van one eighth inch om de samengaste tanks te verbinden met een debietregelaar, zoals een massflowcontroller of een rotameter.

De gascilinders moeten gedefinieerde zuurstofconcentraties hebben, gebalanceerd met stikstof, conform een gecertificeerde standaard voor zuurstofgehalte of voor anoxische condities. Gebruik voor pure stikstof een tweetrapsregelaar waarbij de tweede trap is ingesteld op de gewenste druk. Raadpleeg de instructies in het schriftelijke protocol voor het selecteren van een geschikte stroomsnelheid.

Sluit vervolgens de slang van de tweetrapsregelaar aan op de debietregelaar die de stroomsnelheid van het gas dat de kamer binnenkomt, beheerst. De uitlaat van de debietregelaar is verbonden met een gaswasfles met een gesinterde cilinder die gedestilleerd water bevat. Sluit daarna de slang aan de andere zijde van de wasfles aan op een van de koppelingen van de klimaatkamer.

Dit zal het gas dat de environmental chamber binnentreedt hydrateren. Gebruik vacuümvet om de kamer af te dichten. Plaats vervolgens gewichten op het deksel van de kamer om een luchtdichte afsluiting te garanderen.

Test de afdichting door een kleine hoeveelheid water in de palm van een handschoen aan de gasuitlaatfitting van de kamer te houden en te controleren op bellen. Genereer vervolgens gesynchroniseerde populaties van sea Elgan. Plaats één tot 100 GR-volwassenen in een druppel alkalische bleekoplossing op het oppervlak van een ongeïnoculeerde kweekplaat voor nematoden.

Laat de bleekoplossing na een incubatieperiode van ten minste acht uur in de plaat trekken. Breng de gesynchroniseerde L1-larven over naar een plaat waarin levende OP 50-bacteriën zijn gezaaid. Laat alternatief GRA-volwassenen gedurende twee tot drie uur eitjes op de plaat leggen om een groep wormen te genereren die synchroon zullen ontwikkelen, of selecteer L4-larven uit een gemengde populatie om jonge embryo's te verzamelen.

Hussel de volwassen GR-wormen in een klein volume water met een scheermesje in het twee- tot viercelstadium en breng de embryo's vervolgens over met een mondpipet voordat de wormen naar de plaat worden overgebracht voor blootstelling aan hypoxische condities. Plaats een ring van 10 milligram per milliliter palmitinezuur in ethanol langs de rand van de platen om te voorkomen dat de wormen van het oppervlak van de agarplaat ontsnappen.

Het palmitinezuur zal neerslaan uit de oplossing. Terwijl de ethanol verdampt en een fysieke barrière vormt om uniformiteit te waarborgen, dient u ervoor te zorgen dat het water in de gaswasfles wordt vervangen vóór blootstelling in de klimaatkamer. Nadat de wormen naar de platen zijn overgebracht, sluit u de platen af in de klimaatkamer, start u de gasstroom en behoudt u de blootstelling gedurende de gewenste tijd voor de assay.

Voor de levensvatbaarheid van embryo's tot volwassenheid laat u de wormen 48 uur ontwikkelen na terugkeer naar kamertemperatuur, op welk punt ze in het vierde larvale stadium of één dag oude volwassenen zouden moeten zijn; score daarna de levensvatbaarheid tot volwassenheid. Om wormen die aan hypoxische blootstelling zijn onderworpen te visualiseren, brengt u de wormen over naar een druppel M9 op een dekglas van 22 millimeter vierkant en plaatst u dit indien nodig ondersteboven op een kussentje van 2% agarose in M9.

25 millimolair amol of 10 millimolair natriumazide kan als anestheticum worden gebruikt. Alternatief kan de transparante omgevingskamer na blootstelling aan hypoxie direct op de tafel van een dissectiescoop worden geplaatst. Er worden twee weergaven getoond, waarvan één de volledige gasstroomopstelling bevat.

De andere met alleen de kamer op de microscooptafel. Kweek Bristol N2-wormen op vier 10 centimeter hoge kweekplaten totdat de meerderheid van de wormen GR-volwassenen zijn. Was de wormen in een 15 milliliter conische buis met een één-op-vijf alkalische bleekoplossing en incubeer onder rotatie totdat de wormen beginnen op te lossen.

Niet langer dan vijf minuten. Was de wormen drie keer met M9 door telkens tussen de wasbeurten door te centrifugeren op 1.500 ×g, zonder de plaat te breken. Verdeel de gebleekte embryo's over acht 150 millimeter NGM-platen en laat de embryo's gedurende ongeveer 48 uur uitgroeien tot L4-larven.

Verplaats de platen bij 22 °C naar de environmental chamber en stel ze gedurende vier uur, of voor de duur die in het experimentele ontwerp is gespecificeerd, bloot aan hypoxische en anoxische condities. Verwijder voor het oogsten van de monsters snel het deksel van de hypoxische kamer. Neem één monsterplaat, sluit de kamer direct weer en noteer de stappen.

Na het verwijderen van de wormen uit de hypoxie moet dit gehele proces minder dan twee minuten duren. Gebruik gedestilleerd water om de wormen op een nylon filter te wassen en giet ze vervolgens in een gelabelde conische buis van 15 milliliter die 100 µL 1% SDS bevat. Centrifugeer de wormen in SDS in een desktopcentrifuge bij 1.500 ×g gedurende 15 tot 20 seconden.

Gebruik na de pauze een vacuüm om het grootste deel van het supernatant uit de buis te verwijderen, waarbij het wormpellet ongemoeid blijft. Draagt u met een pipet het wormpellet samen met een vooraf bepaald volume vloeistof over naar een gelabelde 1,5 µL microcentrifugeebuis. Als het monster gebruikt zal worden voor SDS-PAGE, kan deze buis een gelijk volume van tweedubbele eiwitlaadkleurstof bevatten; sluit de buis en dompel deze onder in vloeibare stikstof.

Herhaal dit proces totdat alle monsters zijn geïsoleerd. Volg deze procedures ook voor de controlemonsters van de huisruklucht voor consistentie; monsters kunnen worden bewaard bij -20 °C. Deze figuur toont de levensvatbaarheid van embryo's die zijn blootgesteld aan 1000 parts per million zuurstof, 5.000 parts per million zuurstof en normoxia rond 210.000 parts per million zuurstof.

De embryo's worden gedurende 24 uur aan elke conditie blootgesteld in zuurstofkamers met een continue stroom. De wormen werden overgebracht naar normoxische condities en kregen 48 uur de tijd om zich te ontwikkelen tot volwassenen, waarna de levensvatbaarheid tot het volwassen stadium werd gescoord. Na deze procedure kunnen monsters worden verzameld voor verdere analyse via Western blot, QPCR of fysiologische assays, zoals levensduur of nageslachts productie.

Na het bekijken van deze video moet u een goed beeld hebben van hoe u een hypoxia-kamer met continue doorstroming in uw eigen laboratorium kunt opzetten.