Name: In vitro analyse van PDZ-afhankelijke CFTR Macromoleculaire signaalcomplexen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Leer de assemblage van PDZ-afhankelijke CFTR macromoleculaire signaalcomplexen in vitro. Deze methode maakt directe detectie en visualisatie van eiwitinteracties mogelijk voor onderzoek naar cellulair signaaltransductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ons werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association (Groot-Zuidoost Affiliate) Begin-subsidie-in-aid 0765185B, de Elsa U. Pardee Foundation onderzoek te verlenen, en Wayne State University intramurale het opstarten van het fonds en de Cardiovascular Research Institute Isis Initiative award. Deze methode van in-vitro-CFTR macromoleculaire complexe assemblage werd oorspronkelijk ontwikkeld door dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).

1. Expressie en zuivering van recombinante Tagged fusie-eiwitten in bacteriën <ol><li> Versterken gedefinieerd gebieden van de C-staart (de laatste 50 tot 100 aminozuren met de PDZ motieven in C-terminus) voor CFTR, LPA 2 MRP2, MRP4, β 2 AR en NHERFs (full-length of PDZ1 of PDZ2 domeinen ) met PCR benadering. </li><li> Kloon de PCR producten in pGEX4T-1 vector voor GST-fusie-eiwitten (zoals GST-NHERFs, GST-MRP4 CT) pMAL-C2 vector voor MBP-fusie-eiwitten (zoals MBP-β 2 AR CT, MBP-CFTR CT ) en pET30 voor zijn-S-fusie-eiwitten (zoals His-S-CFTR CT, zijn-S-PDZK1). </li><li> Transformeer in een protease-deficiënte E. coli stam (BL21-DE3) mogelijke recombinant eiwitafbraak minimaliseren. </li><li> &#39;S nachts Grow de cultuur bij 37 ° C in Luria-Bertani medium (pH 7,0) met de juiste antibiotica (zoals ampicilline of kanamycine). Verdun de nacht cultuur 1:10 en groeien nog 2 uur bij 37 ° C. Induce met 0,5-1 m M IPTG komende 4 uur bij 30 ° C. Pellet de cellen door centrifugeren bij 8000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Lyseren van de cellen in Sucrose buffer (50 m M Tris-HCl, pH 8,0, 1 m M EDTA, 1 m M PMSF en 10% sucrose) met lysozym (1 mg / ml), 0,2% Triton X-100, en protease remmers. Gebruik 20 ml voor celpellet afkomstig van 1 L van cultuur. </li><li> Meng op een roterende schud gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Spin bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Verzamel de heldere bovenstaande vloeistof. </li><li> In de heldere supernatant, voeg 1 ml van de volgende hars / agarose parels (50% slurry in Sucrose Buffer): <ul><li> Glutathion agarose parels voor GST fusie-eiwitten. </li><li> Talon kralen voor Zijn-S fusie-eiwitten. </li><li> Amylose hars MBP fusieproteïnen. </li></ul></li><li> Mix gedurende 4 uur bij 4 ° C op een roterende schudder. </li><li> Was de kralen door resuspenderen in 1x PBS (15 ml), het mengen van 2 min, spinnen bij 800 x g gedurende 2 minuten en de supernatant. Herhaal deze stap voor zes keer. </li><li> Elueer het eiwit van de bolletjes met respectieve elutiebuffer (2 ml elutiebuffer per 1 ml van korrels). <ul><li> Elutiebuffer voor GST fusieproteïnes: 25 m M Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M NaCl en 20 m M gereduceerd glutathion. </li><li> Elutiebuffer Zijn fusieproteïnen: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), 500 m M NaCl en 200 m M imidazool. </li><li> Elutiebuffer voor MBP fusieproteïnen: 20 m M Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M NaCl, 1 m M EDTA, 1 m M DTT en 10 m M maltose. </li></ul></li><li> Dialyze het geëlueerde eiwit tegen 2 L van 1x PBS bij 4 ° C (mogelijke eiwitafbraak vermijden). Wijzig PBS om de 4 uur voor vier keer. Concentreer de proteïne met een Centricon filter (10.000 MW afgesneden, Millipore) en slaan de kleine aliquots bij -80 ° C. </li><li> Dethermelijnen de eiwitconcentratie van de Bradford methode. Beoordelen eiwitkwaliteit door SDS-PAGE met BSA als standaard. Als de integriteit van het eiwit niet bevredigend is de secundaire zuivering zoals gelfiltratie of ionenwisseling worden. (Bijvoorbeeld, hebben wij een G-75 Sepharose kolom verder te zuiveren GST-fusie-eiwit). </li></ol> 2. Cel Cultuur en cellysaat Voorbereiding <ol><li> Cultuur baby hamster nier (BHK) cellen die stabiel over-express CFTR-wt en CFTR-his10 of BHK cellen die tijdelijk over-express Flag-LPA 2-wt of Flag-LPA 2-ΔSTL en Madin-Darby Canine Kidney (MDCK ) cellen die stabiel overexpressie MRP2 in Minimum Essential Medium Eagle&#39;s (MEM) 10% foetaal kalfsserum en penicilline / streptomycine in polystyreen flessen bij 37 ° C met met 5% CO2. </li><li> Cultuur humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen die stabiel over-express CFTR-wt en CFTR-his10 in Dulbecco&#39;S gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en penicilline / streptomycine in polystyreen flessen bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Lyseren van de cellen in lysisbuffer (PBS - 0,2% Triton-X-100 aangevuld met een mengsel van proteaseremmers die 1 m M fenylmethylsulfonylfluoride, 1 pg / ml aprotinine, 1 pg / ml leupeptine, 1 pg / ml pepstatine) gebruik 500 ul lysisbuffer per 60 mm petrischaaltje en 1000 ul lysisbuffer per 100 mm petrischaal. </li><li> Rock de cellysaten gedurende 20 min bij 4 ° C en het onoplosbare materiaal door centrifugeren bij 16.000 xg verwijderen gedurende 15 min bij 4 ° C. Bepaal de eiwitconcentratie van de Bradford-test. </li></ol> 3. In Vitro Montage van een CFTR-bevattende Macromoleculaire Complex (CFTR-PDZK1-MRP4) <ol><li> In 200 ul van lysis buffer (PBS - 0,2% Triton-X 100 + protease-remmers), voeg 20 ug gezuiverd GST-MRP4-C terminal50 aa (CT50) fusie-eiwit. </li><li> Voeg verschillende hoeveelheden (0-40 ug) gezuiverd His-S-PDZK1 fusieproteïne. </li><li> Meng de twee eiwitten in een roterende menger bij 22 ° C gedurende 1-2 uur. </li><li> Voeg 20 ul glutathion parels (50% suspensie) in het eiwitmengsel, en verder mengen nog 1 h. Deze stap wordt ook wel paarsgewijze binding. </li><li> Gedurende deze tijd, de voorbereiding van de HEK293 cellysaten met een overexpressie van Vlag-CFTR (WT), zoals hierboven in stap 2 beschreven). </li><li> Tweemaal wassen complex met lysisbuffer. Spin op 800 xg gedurende 1 min voor elke wasbeurt en zorgvuldig het supernatant te zuigen na elke wasbeurt. Wees voorzichtig niet te zuigen uit de kralen in de bodem. </li><li> Voeg de hierboven bereide HEK293 cellysaten de kralen en voorzichtig bij 4 ° C gedurende 3 uur gemengd (of een nacht). </li><li> Was de korrels uitgebreid driemaal met lysisbuffer zoals beschreven in stap 3.6). </li><li> Elueer de eiwitten met behulp van 30 ul monster buffer (5 ×): 0,6 M<html> Tris-HCl (pH 6,8), 50% glycerol, 2% SDS en 0,1% broomfenolblauw, bevattende 5% β-mercapto-ethanol. </li><li> Incubeer in 37 ° C waterbad gedurende 10-15 min, en draaien bij 5000 g gedurende 30 s te precipiteren de korrels. </li><li> Laad alle het eluaat op 4-15% gel. </li><li> Run SDS-PAGE voor ongeveer 30-40 minuten. </li><li> Overdracht eiwitbanden de PVDF membraan, 1,5 uur. </li><li> Blok het membraan TBS-Tween met 5% niet-vet melk. </li><li> Incubeer de membraan met primaire antilichaam (zoals anti-CFTR IgG, R1104) bij 4 ° C, &#39;s nachts. </li><li> Was het membraan met TBS-Tween gedurende 5 minuten zes keer. </li><li> Incubeer de membraan met secundair antilichaam (zoals geit anti-muis HRP geconjugeerde antistof 2e) gedurende 45 min bij 22 ° C. </li><li> Was het membraan met TBS-Tween gedurende 5 minuten zes keer. </li><li> Visualiseer de eiwitbanden via ECL. </li><li> Representatieve zijn weergegeven in figuur 1. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. representatieve resultaten Een voorbeeld van CFTR bevattende macromoleculair complex signaal is gemonteerd in vitro is weergegeven in figuur 1. Een macromoleculaire complex werd gevormd tussen MRP4 C-terminale 50 aminozuren (MRP4-CT50), PDZK1, en ​​full-length CFTR (Figuur 1, onderaan). De complexvorming verhoogde dosisafhankelijk met toenemende hoeveelheden van de intermediaire eiwit PDZK1 (figuur 1 onder) 18. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4091/4091fig1.jpg" /> Figuur 1. Een aanschouwelijke representatie van de macromoleculair complex assay (boven). Een macromoleculair complex waargenomen in vitro met drie eiwitten (GST-MRP4-CT50, zijn-S-PDZK1 en Flag-CFTRwt) in een dosis-afhankelijke wijze (onder) 18. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; CFTR-Nherf1-β 2 AR (ref. 14) </td><td> CFTR-Nherf2-LPA 2 (ref. 15) </td><td> CFTR-PDZ eiwitten-MRP-2 (ref. 17) </td><td> CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16) </td></tr><tr><td> Affiniteit kralen </td><td> Amylose hars </td><td> S-eiwit agarose </td><td> Amylose hars </td><td> Glutathion agarose </td></tr><tr><td> Gezuiverd eiwit-1 </td><td> MBP-β 2 AR CT </td><td> His-S-CFTR CT </td><td> MBP-CFTR CT </td><td> GST-MRP4 CT </td></tr><tr><td> Gezuiverd eiwit-2 </td><td> GST-Nherf1 </td><td> GST-Nherf2 </td><td> GST-PDZ eiwitten </td><td> His-S-PDZK1 </td></tr><tr><td> Gezuiverd eiwit-3 (of cellysaten) </td><td> CFTR-wt of CFTR-his10 (BHK-of HEK cellysaten) </td><td> VlagLPA-2-wt of Flag-LPA 2-ΔSTL (BHK cellysaten) </td><td> MRP2 (MDCK cellysaten) </td><td> Gezuiverd Flag-CFTR-wt of CFTR-his10 (of cellysaten) </td></tr><tr><td> Antilichaam </td><td> Anti-CFTR IgG </td><td> Anti-Flag HRP </td><td> Anti-MRP2 IgG </td><td> Anti-Flag HRP </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Samenvatting van verschillende CFTR-bevattende complexen macromoleculaire gemonteerd in vitro.

<ol><li>Anderson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+CFTR+is+a+chloride+channel+by+alteration+of+its+anion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity.</a> Science. 253, 202-205 (1991).</li>
<li>Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR.</a> Cell. 68, 809-818 (1992).</li>
<li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+impermeability+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chloride impermeability in cystic fibrosis.</a> Nature. 301, 421-422 (1983).</li>
<li>Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+intracellular+transport+and+processing+of+CFTR+is+the+molecular+basis+of+most+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis.</a> Cell. 63, 827-834 (1990).</li>
<li>Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+heterozygote+resistance+to+cholera+toxin+in+the+cystic+fibrosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model.</a> Science. 266, 107-109 (1994).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+chloride+channel+in+the+apical+compartments%3A+spatiotemporal+coupling+to+its+interacting+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners.</a> Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).</li>
<li>Chao, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+intestinal+CFTR+Cl-+channel+by+heat-stable+enterotoxin+and+guanylin+via+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase.</a> Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+and+outward+rectifying+chloride+channels+are+distinct+proteins+with+a+regulatory+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship.</a> Nature. 363, 263-268 (1993).</li>
<li>McNicholas, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+a+renal+K%2B+channel+%28ROMK2%29+to+the+inhibitory+sulfonylurea+compound+glibenclamide+is+enhanced+by+coexpression+with+the+ATP-binding+cassette+transporter+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).</li>
<li>Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+activates+aquaporin+3+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).</li>
<li>Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+drives+Na%2B-nHCO-3+cotransport+in+pancreatic+duct+cells%3A+a+basis+for+defective+HCO-3+secretion+in+CF%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF.</a> Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).</li>
<li>Ahn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interaction+between+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+and+HCO3-+salvage+mechanisms+in+model+systems+and+the+mouse+pancreatic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct.</a> J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).</li>
<li>Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Cl-+channel+and+CFTR-associated+ATP+channel%3A+distinct+pores+regulated+by+common+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates.</a> Embo. J. 17, 898-908 (1998).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+chloride+channels+by+syntaxin+and+Munc18+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms.</a> Nature. 390, 302-305 (1997).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+1A+is+expressed+in+airway+epithelial+cells%2C+where+it+modulates+CFTR+Cl%28-%29+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents.</a> J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+complex+of+beta+2+adrenergic+receptor%2C+CFTR%2C+and+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin-binding+phosphoprotein+50+is+regulated+by+PKA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+inhibits+cholera+toxin-induced+secretory+diarrhea+through+CFTR-dependent+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions.</a> J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+coupling+of+cAMP+transporter+to+CFTR+chloride+channel+function+in+the+gut+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia.</a> Cell. 131, 940-951 (2007).</li>
<li>Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+carcinogen+NNK+transporter+MRP2+regulates+CFTR+function+in+lung+epithelia%3A+implications+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer.</a> Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).</li>
<li>Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+motif+found+in+the+beta2-adrenergic+receptor%2C+P2Y1+receptor+and+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+determines+binding+to+the+Na%2B%2FH%2B+exchanger+regulatory+factor+family+of+PDZ+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).</li>
<li>Short, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apical+PDZ+protein+anchors+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+to+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton.</a> J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).</li>
<li>Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessory+protein+facilitated+CFTR-CFTR+interaction%2C+a+molecular+mechanism+to+potentiate+the+chloride+channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity.</a> Cell. 103, 169-179 (2000).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3KARP+mediates+the+association+of+ezrin+and+protein+kinase+A+with+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+airway+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells.</a> J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golgi-associated+PDZ+domain+protein+modulates+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+plasma+membrane+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression.</a> J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).</li>
<li>Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+PDZ+protein+regulates+the+activity+of+guanylyl+cyclase+C%2C+the+heat-stable+enterotoxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).</li>
<li>Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+by+competitive+interactions+of+molecular+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).</li>
<li>Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+DeltaF508-CFTR+trafficking+via+a+GRASP-dependent+unconventional+secretion+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway.</a> Cell. 146, 746-760 (2011).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+intermolecular+and+intramolecular+interactions+regulating+CFTR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function.</a> Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).</li>
<li>Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CFTR+Interactome+in+the+Macromolecular+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes.</a> Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine+receptor+CXCR2+macromolecular+complex+regulates+neutrophil+functions+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit protocol we aangetoond dat een werkwijze voor in vitro montage en detectie van een CFTR met macromoleculaire signaleringscomplex met gezuiverde eiwitten (of eiwitfragmenten) en / of cellysaten Zoals eerder 16-19,29,30. Om dit te bereiken de beste resultaten de volgende kritische punten tijdens de voorbereiding vereisen speciale aandacht: <ul><li> Het is belangrijk dat de pH van de elutiebuffer aangepast tot 8,0 na toevoegen gereduceerd glutathion als zuivering van GST-fusieproteïne zoals b...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> pGEX4T-1 vector </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td> voorheen Amersham Biosciences </td></tr><tr><td> pMAL-C2 vector </td><td> New England BioLabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> pET30 vector </td><td> Merck Chemicals </td><td> 69077-3 </td><td> voorheen Novagen </td></tr><tr><td> Glutathion agarose parels </td><td> BD Biosciences </td><td> 554780 </td><td></td></tr><tr><td> Amylose hars </td><td> New England BioLabs </td><td> E8021S </td><td></td></tr><tr><td> Talon kralen </td><td> Clontech </td><td> 635501 </td><td></td></tr><tr><td> gereduceerd glutathion </td><td> BD Biosciences </td><td> 554782 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> imidazol </td><td> Visser </td><td> BP305-50 </td><td></td></tr><tr><td> maltose </td><td> Visser </td><td> BP684-500 </td><td></td></tr><tr><td> S-eiwit agarose </td><td> Merck Chemicals </td><td> 69704-3 </td><td> voorheen Novagen </td></tr><tr><td> Anti-Flag HRP </td><td> Sigma </td><td> A8592 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CFTR IgG </td><td> Custom-made </td><td> R1104 </td><td> mAb herkennen CFTR epitoop op aa 722-734 </td></tr><tr><td> Anti-MRP2 IgG </td><td> Chemicon International </td><td> MAB4148 </td><td> Nu een deel van Millipore </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Specifieke reagentia en materialen.

in vitro analyse van pdz-afhankelijke cftr macromoleculaire signaalcomplexen

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), een chloride kanaal voornamelijk gevestigd zijn op de apicale membranen van epitheliale cellen, speelt een cruciale rol in transepitheliaal vloeistof homeostase 1-3. CFTR is betrokken bij twee belangrijke ziekten: cystische fibrose (CF) 4 en secretoire diarree 5. In CF, is de synthese of functionele activiteit van het CFTR Cl-kanaal verminderd. Deze aandoening treft ongeveer 1 op de 2.500 blanken in de Verenigde Staten 6. Overmatige CFTR-activiteit is ook betrokken in geval van toxine-geïnduceerde secretoire diarree (bijvoorbeeld door cholera toxine en warmte stabiele E. coli enterotoxine), die cAMP of cGMP productie in de darm 7 stimuleert. Opstapelen van bewijsmateriaal dat suggereert het bestaan ​​van fysieke en functionele interacties tussen CFTR en een groeiend aantal andere eiwitten, waaronder vervoerders, ionkanalen, receptoren, kinasen, fosfatasen, signaaling moleculen en cytoskelet elementen en deze interacties tussen CFTR en bindende eiwitten aangetoond kritisch bij de regulering CFTR-gemedieerde transepitheliaal ionentransport in vitro en in vivo 8-19. In dit protocol richten we ons alleen op de methoden die helpen bij de studie van de interacties tussen CFTR carboxyl-terminale staart, die een eiwit-bindend motief bezit [aangeduid als PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motief], en een groep van raamwerk eiwitten die een specifieke binding module bevatten genoemd PDZ domeinen. Tot nu toe zijn verschillende PDZ raamwerk eiwitten is gerapporteerd dat de carboxyl terminal staart van CFTR binden met verschillende affiniteiten zoals Nherf1, Nherf2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-geassocieerde ligand), Shank2 en 20-27 bevatten. De PDZ motief in CFTR dat wordt herkend door PDZ steiger eiwitten is de laatste vier aminozuren aan de C-terminus (dat wil zeggen, 1477-Dtrl-1480 in de menselijke CFTR) 20. InteressantCFTR kunnen binden meer dan een PDZ-domein van zowel NHERFs en PDZK1, zij het ​​met verschillende affiniteiten 22. Dit multivalency met betrekking tot CFTR binding is gebleken functionele betekenis suggereert dat PDZ raamwerk eiwitten kunnen vorming van CFTR macromoleculaire vergemakkelijken signaalcomplexen specifieke / selectieve en efficiënte signalering in cellen 16-18. Meerdere biochemische testen zijn ontwikkeld om te studeren CFTR-met eiwit interacties, zoals co-immunoprecipitatie, pull-down test, paarsgewijs bindingstest, colorimetrische paarsgewijs bindingstest, en macromoleculaire complexe assemblage-test 16-19,28,29 . Hier richten we ons op de gedetailleerde procedures voor het samenstellen van een PDZ motief-afhankelijke CFTR-bevattende macromoleculaire complex in vitro, die op grote schaal wordt gebruikt door ons laboratorium om eiwit-eiwit of domein-domain interacties van CFTR 16-19,28,29 te bestuderen.

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), een epitheliale chloride kanaal, is gemeld om te communiceren met verschillende eiwitten en belangrijke cellulaire processen te reguleren, onder wie de CFTR PDZ motief-gemedieerde interacties zijn goed gedocumenteerd. Dit protocol beschrijft methodes die we ontwikkeld tot een PDZ-afhankelijke CFTR macromoleculaire signaleren van complexe monteren<em&gt; In vitro</em&gt;.

In vitro analyse van PDZ-afhankelijke CFTR Macromoleculaire signaalcomplexen

De cystische fibrose transmembraangeleidingsregulator (CFTR), een chloridekanaal dat zich hoofdzakelijk bevindt in de apicale membranen van epitheelcellen, speelt een ...

Het algemene doel van deze procedure is om in vitro een macromoleculair signaleringscomplex samen te stellen van de cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) die afhankelijk is van PDZ. Om dit te bereiken, worden recombinant getagde fusie-eiwitten tot expressie gebracht in bacteriën en vervolgens gezuiverd. Vervolgens worden cellysaten verkregen uit culturen die CFTR of CFTR-bindende eiwitten tot expressie brengen.Vervolgens worden de CFTR en bindingsproteïnen in vitro gecombineerd om het macromoleculaire signaleringscomplex dat CFTR bevat, te assembleren. Daarna wordt er Western blotting uitgevoerd, wat de vorming van CFTR macromoleculaire complexen aantoont en vervolgens via Western blotting wordt beoordeeld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat we direct de vorming van een individueel eiwitrijk macromoleculair complex met CFTR kunnen detecteren en visualiseren.Deze methode kan dus inzicht bieden in de vorming van macromoleculaire complexen met CFTR. De methode kan ook worden toegepast bij het samenstellen van niet-eiwitcomplexen die niet betrokken zijn bij CFTR, zoals het macromoleculaire signaleringscomplex van

in-vitro-analysis-pdz-dependent-cftr-macromolecular-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De cel permeabele crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionaat)] stabiliseert van voorbijgaande aard en labiele...

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

Om de interactie van een proteïne test met haar doel lipide gebruikten we MACS en Annexine V-geconjugeerde magnetische kralen en lipide vesicles gesynthetiseerd uit het doel lipiden en Annexine V-bindend fosfatidylserine. Eiwitten gebonden aan de doelgroep lipide zijn co-gezuiverd en geanalyseerd na elutie van de kralen.

Lipide bolletjes-gemedieerde affiniteitschromatografie met behulp van Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): een nieuwe methode om eiwit-lipide Interactie Analyze

Een efficiënte procedure om de oligomerisatie neiging van single-pass transmembraan-domeinen (TMDs) te beoordelen wordt beschreven. Chimère eiwitten bestaande uit de TMD gefuseerd aan ToxR worden uitgedrukt in een E. coli stam verslaggever. TMD-geïnduceerde oligomerisatie oorzaken dimerisatie van ToxR, activatie van transcriptie en de productie van de reporter eiwit-galactosidase.

Transmembraan domein oligomerisatie Propensity bepaald door ToxR Assay

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie biedt een hoge doorvoer kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze methodologie kan worden toegepast op mapping eiwitbindingsplaatsen en screenen factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

Heterologe expressie en zuivering van het cystische fibrose transmembraan geleiding regulator (CFTR) zijn belangrijke uitdagingen en beperkende factoren in de ontwikkeling van geneesmiddelen therapieën voor cystic fibrosis. Dit protocol beschrijft twee werkwijzen voor de isolatie van milligram hoeveelheden CFTR voor functionele en structurele studies.

Zuivering van het Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator eiwit dat tot expressie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier beschreven is een snelle en efficiënte procedure voor de functionele reconstitutie van gezuiverde wildtype en mutante CFTR-eiwit dat activiteit behoudt deze chloride kanaal, die defect in Cystic Fibrosis. Jodide efflux uit opgelost proteoliposomen gemedieerd door CFTR maakt studies van het kanaal en de effecten van kleine moleculen.

Functionele Het oplossen en Channel activiteit Metingen van gezuiverde wildtype en mutante CFTR eiwit

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Wij bieden een protocol voor in vitro zelforganisatie testen van geest en mij op een ondersteunde lipide dubbelgelaagde in een open huis. Daarnaast beschrijven we hoe omsluiten de bepaling in lipide-geklede PDMS microcompartments na te bootsen in vivo voorwaarden door reactie opsluiting.

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Hier beschrijven we een protocol voor een algemene pulse-chase-methode, waarmee de kinetische analyse van vouwing, vervoer en afbraak van eiwitten te volgen in levende cellen.

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Leer de assemblage van PDZ-afhankelijke CFTR macromoleculaire signaalcomplexen in vitro. Deze methode maakt directe detectie en visualisatie van eiwitinteracties mogelijk voor onderzoek naar cellulair signaaltransductie.

In vitro analyse van PDZ-afhankelijke CFTR Macromoleculaire signaalcomplexen

Meer video's verkennen