In vitro analyse van PDZ-afhankelijke CFTR Macromoleculaire signaalcomplexen

Het algemene doel van deze procedure is om in vitro een macromoleculair signaleringscomplex samen te stellen van de cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) die afhankelijk is van PDZ. Om dit te bereiken, worden recombinant getagde fusie-eiwitten tot expressie gebracht in bacteriën en vervolgens gezuiverd. Vervolgens worden cellysaten verkregen uit culturen die CFTR of CFTR-bindende eiwitten tot expressie brengen.

Vervolgens worden de CFTR en bindingsproteïnen in vitro gecombineerd om het macromoleculaire signaleringscomplex dat CFTR bevat, te assembleren. Daarna wordt er Western blotting uitgevoerd, wat de vorming van CFTR macromoleculaire complexen aantoont en vervolgens via Western blotting wordt beoordeeld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat we direct de vorming van een individueel eiwitrijk macromoleculair complex met CFTR kunnen detecteren en visualiseren.

Deze methode kan dus inzicht bieden in de vorming van macromoleculaire complexen met CFTR. De methode kan ook worden toegepast bij het samenstellen van niet-eiwitcomplexen die niet betrokken zijn bij CFTR, zoals het macromoleculaire signaleringscomplex van SecC2. Onlangs hebben we met dezezelfde methode aangetoond dat onze chemokinereceptor CXCR2 fysiek een eiwitcomplex vormde met de downstream-effector.

PRC bèta drie medieert het wilde type nr. 1 in neutrofielen met behulp van PCR. Amplificeer het DNA dat codeert voor de laatste 50 tot 100 aminozuren die de PDZ-motieven aan de C-terminus bevatten. Voor de cAMP-transporter, MRP vier en het PDZ 1-domein van natrium-waterstofuitwisselingsregulerende factor of N-H-E-R-F.

Kloon vervolgens de RP vier PCR R-producten in PGE X vier T één om GST-fusie-eiwitten te genereren, en het PDZ één-domein van N-H-E-R-F in PET 30. Transformeer de bacteriën via hitte-shock om hiss s-fusie-eiwitten te genereren. Kweek de cultuur in SOC-medium, in een protease-deficiënte e coli-stam, gedurende de nacht bij 37 °C in een schuddende incubator in 50 milliliters LB-medium met de juiste antibiotica voor de vector.

Verdun de volgende dag de cultuur 1:10 in 500 milliliters Luria-Berti-medium en incubeer de cultuur opnieuw onder schudcondities bij 37 °C. Na twee uur werd de transcriptie van het recombinante eiwit gedurende vier uur geïnduceerd met 0,5 tot 1 millimolar IPTG bij 30 °C.

Breng na de incubatie de culturen over naar centrifugebuizen van 250 milliliter en pellet de cellen door centrifugatie bij 8,000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en voeg 20 milliliter sucrosebuffer toe die lysozym bevat. Voeg één milligram per milliliter 0,2% Triton X 100 en protease-remmers toe om de cellen te lyseren, en breng de bacteriële suspensie over naar een schone centrifugebuis van 50 milliliter.

Meng gedurende 30 minuten op een rotatieschudder bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens 30 minuten bij 20.000 ×g bij vier graden Celsius. Na de centrifugatie zal de supernatant helder zijn en bevindt zich een onoplosbaar app-pellet onderin de buis.

Verzamel de heldere supernatant in een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens één milliliter van de geschikte hars toe aan de supernatant. Aero beads gesuspendeerd als een 50% slurry in sucrose buffer glutathione.

Aero beads moeten worden gebruikt voor GST-fusie-eiwitten en talon beads voor His-S-fusie-eiwitten. Meng gedurende vier uur bij vier graden Celsius op een rotatieschudmachine. Centrifugeer de beads vervolgens bij 800 ×g gedurende twee minuten.

Was ze vervolgens door ze te resuspenderen in 15 milliliters PBS en meng ze gedurende twee minuten op een rotator. Verwijder tot slot het supernatant. Herhaal deze stap zes keer na de zesde wasbeurt.

Om het eiwit uit de kralen te elueren, voegt u twee milliliter van de juiste elutiebuffer toe voor elke milliliter kralen en mengt u dit gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Giet het volledige elueerde eiwit inclusief de kralen in een kolom en verzamel de doorstroom als elueerd eiwit. Draagt u vervolgens het UD-eiwit over naar dialysetubing.

Dialyseer de geëlueerde eiwitten tegen twee liter PBS terwijl er wordt geroerd bij vier graden Celsius. Vervang de PBS vier keer om de vier uur na de dialyse. Concentreer het eiwit tot 0,5 tot één milliliter.

Gebruik een centrifugale filter met een afsnijwaarde van 10.000 megawatt. Verdeel het monster in aliquaten van 200 µL. Bewaar één aliquoot voor analyse en bewaar de overige bij -80 °C.

Bepaal de proteïneconcentratie met de Bradford-methode. Beoordeel de proteïnekwaliteit via SDS-PAGE met behulp van BSAS-standaarden. Indien de integriteit van de proteïne niet bevredigend is, kunnen secundaire zuiveringsprocedures zoals gelfiltratie of ionenuitwisseling worden toegepast.

HEK 2 93-cellen die wild-type flag CFTR tot expressie brengen, dienen te worden gekweekt zoals beschreven in het bijbehorende document. Verwijder het medium van de cellen en was deze met PBS. Voeg vervolgens, om de cellen te lyseren, 500 µL lysisbuffer toe per 60 mm kweekschaal en schud de cellysaten 20 minuten bij 4 °C.

Breng de lysaten over naar nieuwe microcentrifugebuisjes. Centrifugeer vervolgens om de onoplosbare eiwitten te verwijderen bij 16 000 ×g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en verzamel de supernatanten. Bepaal de eiwitconcentratie met de Bradford-assay om de CFTR-bevattende macromoleculaire complexen in vitro samen te stellen.

Begin met het combineren van 20 µg gezuiverd G-S-T-M-R-P four C-terminal 50 aminozuur fusie-eiwit en toenemende hoeveelheden variërend van 0 tot 40 µg gezuiverd hiss S PD zk one fusie-eiwit in 200 µL lysisbuffer in een 1,5 mL microcentrifugebuis. Meng de twee eiwitten op een rotatiemenger bij 22 °C gedurende één tot twee uur. Voeg vervolgens 20 µL van een 50% slurry van glutathion-beads toe aan het eiwitmengsel en meng dit nogmaals één uur lang.

Deze stap wordt ook wel pairwise binding genoemd, waarbij G-S-T-M-R-P four CT 50 bindt aan SPD zk one. Bereid tijdens deze tijd de HEK 2 93 cellysaten voor die wild type flag CFTR overexpresseren, zoals beschreven in het vorige gedeelte van de video volgend op de pairwise binding stap. Was het complex twee keer met lysis buffer span bij 800 ×g gedurende één minuut per wasbeurt en aspireer na elke wasbeurt voorzichtig het supernatant.

Wees voorzichtig om de beads niet van de bodem op te zuigen. Voeg de HT K 2 93 cellysaten toe aan de beads en meng deze voorzichtig op een rotatiemixer bij vier graden Celsius gedurende drie uur of overnacht na de incubatie. Was de beads drie keer met lysisbuffer, waarbij na elke wasbeurt centrifugeert wordt zoals voorheen, ook na de laatste wasbeurt.

Om de eiwitten te elueren, voegt u 30 µL van vijf x monsterbuffer toe en incubeert u dit gedurende 10 tot 15 minuten in een waterbad van 37 °C. Centrifugeer vervolgens 1 minuut bij 5.000 ×g om de beads neer te slaan. Laad vervolgens al het eluaat op een 4 tot 15% SDS-PAGE-gel en laat deze lopen bij 200 V tot aan het einde van de gel. Na afloop van de run worden de eiwitbanden gedurende 1,5 uur bij 60 V overgebracht op een PVDF-membraan met behulp van een BioRad-transferapparaat.

Nadat de overdracht is voltooid, wordt het membraan gedurende één uur geblokkeerd in TBS tween met 5% ontvette melk. Ga verder met western blotting zoals beschreven in het bijbehorende document om CFTR-interagerende eiwitten te visualiseren. Een macromoleculair signaleringscomplex met CFTR werd in vitro samengesteld zoals beschreven in deze video en weergegeven in deze pictoriale weergave.

Een macromoleculair complex gevormd tussen de C-terminale 50 aminozuren van Mr.RRP four PD zk one en full-length CFTR om de dosisafhankelijkheid van de vorming van het macromoleculaire complex te bepalen. Toenemende hoeveelheden van het intermediaire eiwit PD ZK one werden toegevoegd zoals hier weergegeven. Het complex nam dosisafhankelijk toe, wat suggereert dat het intermediaire eiwit PD ZK one de interactie tussen CCF TR en Mr.Rrp four medieerde.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de voor western blotting geprepareerde monsters van het FTR-container-micromolecuulcomplex niet gekookt mogen worden, aangezien FTR-aggregatie een veelvoorkomend probleem is. In plaats daarvan moeten de monsters 10 tot 15 minuten bij 37 °C worden verwarmd voordat ze volgens deze procedure in de gel worden geladen. Andere methoden, zoals co-precipitatie, kunnen worden uitgevoerd om de endogene CFTR-complexen te beoordelen in cellen zoals luchtwagepitheelcellen en darmepitheelcellen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u in vitro een PTC-afhankelijk CFDR-macromoleculair signaleringscomplex assembleert.