C. elegans Tracking en Behavioral Measurement

Fenotypering. De voortbeweging van C. elegans is een belangrijk hulpmiddel bij de ontdekking van genen en neuronen die betrokken zijn bij het gedrag van C. elegans. C. elegans vertoont stereotiepe locomotorische gedragingen, zoals voorwaartse en achterwaartse bewegingen en verschillende soorten draaiingen door hun vorm te veranderen. Om deze bewegingen over lange afstanden en met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te kwantificeren, hebben we een wormtracker gebouwd om de beweging van C. elegans vast te leggen terwijl deze over het oppervlak van een agarplaat kruipt.

We hebben daarnaast software ontwikkeld om deze bewegingen kwantitatief te isoleren en te analyseren met behulp van aangepaste programma's geschreven in LabVIEW en MATLAB. Een uitdaging van elk videotrackingsysteem is dat ze een enorme hoeveelheid hoogdimensionale data genereren. Ons programma voor beeldverwerking en data-analyse gaat om met deze uitdaging door de vormen van de worm te reduceren tot een set onafhankelijke componenten; we hebben het gedrag van de worm volledig gereconstrueerd als een functie van slechts drie tot vier dimensies.

Een agarplaat wordt verlicht door een glasvezellichtbron en vastgelegd met een camera. Dit systeem is gemonteerd op een XY-translatietafel. De tafel wordt bewogen door standaard stappenmotoren, die zijn aangesloten op een stappenmotorcontroller.

De controller en de camera zijn verbonden met de computer en worden aangestuurd door op maat gemaakte programma's geschreven in LabVIEW. De camera legt beelden vast van het oppervlak van een agarplaat en identificeert donkere objecten op een lichte achtergrond. Een kalibratiemarkering voor het automatische kalibratieproces wordt aangebracht door in het agaroppervlak te prikken.

Met een wormenprikker wordt de beeldkwaliteit aangepast zodat het computerprogramma objecten in realtime kan kwantificeren. De gain, helderheid en sluitertijd van de camera kunnen worden ingesteld om een donker object op een witte achtergrond te verkrijgen. Het gefilterde binaire beeld, dat door het trackingprogramma wordt gebruikt, kan worden gecontroleerd.

De software beschikt over een automatische kalibratiefunctie die de kalibratiematrix berekent door een testobject over een vaste afstand te verplaatsen. De afstanden in pixels worden door de kalibratiematrix gekalibreerd naar de stappen die door de stappenmotor worden gezet.

Na de kalibratie is het systeem gereed voor gebruik en hoeft het niet opnieuw gekalibreerd te worden, tenzij de vergroting wordt gewijzigd of de camera wordt verplaatst. Een koperen ring wordt gebruikt om de wormen te begrenzen en te voorkomen dat ze naar de rand van de plaat migreren. Verwarm de ring eerst door deze op een heatblock of een gelijkwaardig apparaat te plaatsen.

De ring moet gedurende ongeveer een minuut worden verhit. Plaats de ring op een verse agarplaat en druk lichtjes aan om deze in het agaroppervlak in te bedden. Een agarplaat gevuld met NGM-buffer wordt gebruikt om L4- en jonge volwassen stadia wormen te wassen om voedselresten te verwijderen.

Nadat de wormen in de NGM-buffer zijn opgepikt, laat u ze enkele minuten zwemmen. Plaats voorzichtig een van de gewassen wormen op de trackingplaat, nabij het centrum van de ring. Deze plaat zal later worden gebruikt voor de wormtracker.

Plaats de voorbereide plaat op het platform van de wormtracker. Start het LabVIEW-programma en selecteer indien nodig de opties, zoals de locatie voor afbeeldingen, het type afbeeldingen, de metingen en de camera-instellingen. Verplaats de microscoop met de joystick totdat er een afbeelding van de worm in het gezichtsveld op het computerscherm verschijnt.

Druk vervolgens op track om het trackingprogramma te activeren. Hier tonen we een worm die in real-time wordt gevolgd. Het computerprogramma meet de bewegingen van de binaire gefilterde beelden zoals getoond en kan metingen van dit beeld in real-time uitvoeren.

Na het tracken kan een reconstructie van de globale baan worden gemaakt op basis van de bewegingen van de stappenmotor, terwijl de lokale vormveranderingen van de worm in detail kunnen worden waargenomen. Wormen kruipen door golvende bewegingen te maken. We leggen deze bewegingen vast door de worm te skeletoniseren tot één centrale curve, om deze curve vervolgens te beschrijven als een reeks hoeken.

Vervolgens ontleden we de skeletten in hun fundamentele vormen, ook wel bekend als eigenvectoren. Met deze eigen modi kunnen we de vormen van de worm reconstrueren en de bewegingen van de worm kwantificeren. Met behulp van de eerste twee modi kunnen we specifiek de fasepositie van de undulerende cyclus van de worm vastleggen, zoals te zien is in het tweede paneel.

Het eerste paneel toont de gezamenlijke distributie van modus één en twee, waarbij een circulaire limietcyclus wordt benadrukt. De fasebeweging in één richting komt overeen met voorwaartse beweging, en de fasebeweging in de andere richting komt overeen met achterwaartse beweging. Bijgevolg komt de fasesnelheid overeen met de snelheid van de worm.

In de reële ruimte is de sterke correlatie tussen de fase en de werkelijke snelheid te zien in het laatste paneel. Door gebruik te maken van de fase-snelheid afgeleid van de Eigen-modus, kunnen we enkele subtiele details van het gedrag van de zee-elegantie onthullen die met het blote oog over het hoofd zouden worden gezien. Zo geeft de gezamenlijke distributie van de fase-snelheid en de fase duidelijk aan dat de wormen de voorwaartse staat bij voorkeur verlaten en betreden bij specifieke fasen van de beweging.

Hier hebben we een gebruiksvriendelijk trackingsysteem gedemonstreerd dat gedetailleerde beelden vastlegt van het gedrag van C. elegans terwijl deze over het oppervlak van ACA-platen kruipt. De hoeveelheid informatie in deze beelden is enorm en hoogdimensionaal, waardoor we ook een methode hebben ontwikkeld om de dimensionaliteit van de data te reduceren tot vier fundamentele maten. Deze maten zijn eenvoudig te interpreteren met betrekking tot het gedrag van de worm.

Dit werk is ontwikkeld om het gedrag van wormen bij geringe modificaties te meten, en het systeem kan ook worden gebruikt om neuronale activiteit te meten met behulp van genetisch gemodificeerde en gecoate regio's. Het systeem als geheel is flexibel in ontwerp en kan worden gebruikt met andere kruipsystemen zoals Doof law, LOEs.