C. elegans Tracking en Behavioral Measurement

Fenotyping.De voortbeweging van zeeelegantie is een belangrijk hulpmiddel bij de ontdekking van genen en neuronen die betrokken zijn bij het gedrag van zeeelegantie. Zeeelegantie ondergaat stereotiepe voortbewegingen zoals voorwaartse en achterwaartse bewegingen en verschillende soorten bochten door hun vorm te veranderen. Om deze bewegingen over lange afstanden en met hoge ruimtelijke en temporele resolutie te kwantificeren, hebben we een wormtracker gebouwd om de beweging van zeeelegantie vast te leggen terwijl deze op het oppervlak van een agarplaat kruipt.

We hebben ook software ontwikkeld om deze bewegingen kwantitatief te isoleren en te analyseren met behulp van aangepaste programma's geschreven in lab view en matlab. Een uitdaging van alle videotrackingsystemen is dat ze een enorme hoeveelheid gegevens genereren die zeer dimensionaal is. Ons programma voor beeldverwerking en gegevensanalyse gaat deze uitdaging aan door de wormvormen te reduceren tot een set onafhankelijke componenten, we hebben het wormgedrag volledig gereconstrueerd als functie van slechts drie tot vier dimensies.

Een agarplaat wordt verlicht door een vezellichtbron en gefotografeerd met een camera. Dit systeem is gemonteerd op een XY-translatietafel. De tafel wordt bewogen door standaard stapmotoren, die zijn aangesloten op een stapmotorcontroller.

De controller en camera zijn aangesloten op de computer en worden bediend door aangepaste programma's geschreven in lab view. De camera beeldt het oppervlak van een agarplaat af en identificeert donkere objecten op een lichte achtergrond. Een kalibratiemarkering voor het automatische kalibratieproces wordt gemaakt door in de agaroppervlakte te prikken.

Met een wormpick wordt de beeldkwaliteit aangepast zodat het computerprogramma objecten in realtime kan kwantificeren. De versterking, helderheid en sluitertijd van de camera kunnen worden aangepast om een ​​donker object op een witte achtergrond te verkrijgen. Het gefilterde binaire beeld, dat door het trackingprogramma wordt gebruikt, kan worden gecontroleerd.

De software heeft een automatische kalibratiefunctie die de kalibratiematrix berekent door een testobject te verplaatsen. Op een vaste afstand. De afstanden in pixels worden gekalibreerd naar stappen genomen door de stapmotor door de kalibratiematrix.

Na kalibratie is het systeem klaar om te gaan en hoeft het niet opnieuw te worden gekalibreerd, tenzij de vergroting wordt gewijzigd of als de camera opnieuw wordt geplaatst. Er wordt een koperen ring gebruikt om de wormen te temmen en te voorkomen dat ze naar de rand van de plaat migreren. Verwarm de ring eerst door hem op een warmteblok of equivalent te plaatsen.

De ring moet ongeveer een minuut worden verwarmd. Plaats de ring op een verse agarplaat en druk lichtjes naar beneden om hem in het agaroppervlak te betten. En een agarplaat gevuld met NGM-buffer zal worden gebruikt om L vier en wormen in het stadium van jonge volwassene van voedselresten te wassen.

Na het plukken van wormen in de NGM-buffer, laat ze een paar minuten zwemmen. Plaats voorzichtig een van de gewassen wormen op de trackingplaat nabij het midden van de ring. Deze plaat zal later worden gebruikt voor de wormtracker.

Plaats de voorbereide plaat op de wormtracker-trap. Voer het lab view-programma uit en selecteer indien nodig opties, zoals locatie voor afbeeldingen, typen afbeeldingen, metingen en camera-instellingen. Gebruik de joystick om de microscoop te verplaatsen totdat een afbeelding van de worm zichtbaar is in het gezichtsveld op het computerscherm.

Druk vervolgens op track om het trackingprogramma te activeren. Hier laten we een worm zien die in realtime wordt gevolgd. Het computerprogramma meet de bewegingen van binaire gefilterde afbeeldingen zoals getoond en kan metingen van deze afbeelding in realtime maken.

Na het volgen kan een reconstructie van de globale baan worden gemaakt vanuit de stapmotorbewegingen terwijl de lokale vormveranderingen van de worm in detail kunnen worden gezien. Wormen kruipen door golfbewegingen te maken. We vangen deze bewegingen door de worm te skeletten in een enkele middelste curve en beschrijven vervolgens deze curve als een set van hoeken.

We ontleden vervolgens de skeletten in hun fundamentele vormen, ook wel bekend als eigenvectoren. Met deze eigenmodi kunnen we de wormvormen reconstrueren en de bewegingen van de worm kwantificeren. Met behulp van de eerste twee modi kunnen we specifiek de fasepositie van de golfbewegingscyclus van de worm vastleggen zoals te zien is in het tweede paneel.

Het eerste paneel toont de gezamenlijke verdeling van modi een en twee, waarbij een cirkelvormige limietcyclus wordt gemarkeerd. De fasebeweging in één richting komt overeen met voorwaartse beweging en de fasebeweging in de andere richting komt overeen met achterwaartse beweging. Dus, de fasesnelheid komt overeen met de snelheid van de worm.

In de reële ruimte kan de sterke correlatie van de fase en de reële wereldsnelheid worden gezien in het laatste paneel. Met behulp van de uit de eigenmodus afgeleide fasesnelheid kunnen we enkele subtiele details van zeeelegantiegedrag onthullen die door het oog zouden worden gemist. Bijvoorbeeld, de gezamenlijke verdeling van de fasesnelheid en fase geeft duidelijk aan dat de wormen de voorwaartse toestand bij voorkeur op specifieke bewegingsfasen verlaten en binnengaan.

Hier hebben we een eenvoudig te gebruiken trackingsysteem gedemonstreerd dat detailafbeeldingen van siliconengedrag vastlegt als een kruip op het oppervlak en ACA-platen. De hoeveelheid informatie die in deze afbeeldingen is opgenomen, is enorm en zeer dimensionaal, en daarom hebben we ook een methode gecreëerd om de dimensionaliteit van de gegevens in de vier fundamentele maten te verminderen. Deze maten zijn gemakkelijk te interpreteren met betrekking tot het wormgedrag.

Dit werk is gegenereerd om het gedrag van wormen bij lagere modificaties te meten, en het systeem kan ook worden gebruikt om neuronale activiteit te meten met behulp van genetisch genetisch en gecoate regio's. Het systeem als geheel is flexibel in ontwerp en kan worden gebruikt met andere kruipsystemen zoals Doof law, LOEs.