High Throughput Single-cel en Multiple-cel Micro-encapsulatie
June 15th, 2012
De combinatie van monodisperse druppel generatie met traagheid ordening van cellen en deeltjes, beschrijven we een methode om een gewenst aantal cellen of deeltjes in te kapselen in een enkele druppel op kHz tarieven. We laten zien efficiëntie twee maal groter dan die van niet-geordende inkapseling voor enkel-en dubbel-deeltje druppels.
Toepassingen die cellen gebruiken die zijn ingekapseld in druppels van picoliter-formaat, zijn vaak beperkt door het onvermogen om het aantal cellen per druppel te beheersen. Dit protocol demonstreert een methode om cel-inkapselaaring te beheersen door twee verschillende microfluïdische fenomenen te combineren, vloeistofdynamische celadordening en druppelgeneratie bij een microscopische nozzle met flow-focussing. In een stroomopwaarts kanaal wordt een voldoende hoge stromingssnelheid van een waterige oplossing met opgeschorte cellen of deeltjes aangelegd om de vorming van treinen met gelijkmatige afstanden in de richting van de stroming stroomafwaarts te veroorzaken.
Een dropgeneratie-nozzle met flow-focussing wordt gebruikt om waterige druppels te vormen met kilohertz-frequenties in een door oppervlakteactieve stoffen gestabiliseerd toelaatbaar olie-dragervloeistof. De geordende celdeeltjes-treinen worden vervolgens gecombineerd met druppelgeneratie door de waterige en olie-stromingssnelheden af te stellen om druppelgeneratiesnelheden te verkrijgen die gesynchroniseerd zijn met de aankomst van longitudinaal geordende cellen of deeltjes bij de dropgeneratie-nozzle, terwijl deeltjes worden gebruikt als celsurrogaten. Om dit protocol te demonstreren moeten stromingssnelheden voldoende klein zijn om vloeistof te beperken.
Schuifspanningen op biologische cellen, het overlappen van de celordening en druppelgeneratie en celviabiliteit. Beperkingen op de waterige stromingssnelheid bieden een ideaal operationeel regime voor gecontroleerde inkapselaaring van enkele en meerdere cellen. Analyse van videomicroscopiegegevens toont aan dat zowel enkele als dubbele cel- of deeltjesinkapselatie-efficiënties de willekeurige enkapselaaring overtreffen en het aantal druppels dat niet het gewenste aantal cellen of deeltjes bevat aanzienlijk verminderen.
Beperking van cellen en druppels beperkt de verdunning van celsecreties, benadrukt celheterogeniteit en beheerst ook intercellulaire signalen in vergelijking met een bulksuspensie. Efficiënte middelen voor het inkapselen van deze cellen in druppels bieden een waardevol hulpmiddel voor biologische onderzoekers om met deze procedure te beginnen. Ontwerp een microkanaalpatroon zoals getoond in deze figuur in AutoCAD-software.
Het lange kanaalgedeelte vertegenwoordigt het waterige stromingsordeningskanaal met een breedte van 27 micron. Het uitvergrote nozzleschema toont gelijke kanaalbreedtes van 27 micron voor het waterige ordeningskanaal en het oliekanaal, gevolgd door de nozzlevernauwing van 22 micron en plotselinge uitzetting tot een breder kanaal van 61 micron. De apparaathoogte is 52 micron.
Zowel de waterige als olie-ingangen hebben grote puinfilters met openingen in de orde van de breedte van het ordeningskanaal zoals geïllustreerd door dit uitvergrote schema van de olie-inlaat. Hier is een echte afbeelding van het ordeningskanaal en de nozzle geïnjecteerd met kleurstof. Gebruik een externe fabrikant om een hoge resolutie transparantiemasque op Mylar-folie of kwarts af te drukken waarbij kanalen transparant zijn op een donkere achtergrond.
Maak vervolgens een siliconen en SU acht fotoresist-master voor replica-maling. Plak de mastermal op de onderkant van een petrischaal voor PDMS replica-maling. Nadat de replica-maling voltooid is en de apparaatcontour is uitgesneden, gebruik een 0,75 millimeter buitendiameter biopsie-pons om vloeistofpoorten te ponsen in de drie ronde gebieden die in deze figuur zijn getoond. Plak een dunne scotchtape op de patroonzijde van de PDMS en trek deze af om eventueel stof te verwijderen na plasma-binding.
De PDMS op een schone glazen microscoopslide. Plaats het hele apparaat in een oven en verwarm de oven geleidelijk op tot 120 graden Celsius. Laat het apparaat de hele nacht in de 120 graden Celsius oven staan om de binding te voltooien en de PDMS in zijn oorspronkelijke hydrofobe toestand terug te brengen.
Een alternatieve methode om het glazen oppervlak van het kanaal hydrofoob te maken is om een coating zoals aquae in de vloeistofpoorten te injecteren en vervolgens met lucht te spoelen. Gebruik een een milliliter spuit en een spuitnaald om enkele honderden microliters lucht op te trekken, gevolgd door een kleine hoeveelheid aqua die alleen de metalen spuittip kan vullen. Injecteer voorzichtig maar stevig de aqua en vervolgens de spoellucht in de vloeistofpoorten. Zonder de PDMS-glasbinding agressief te verbreken.
Herhaal het luchtspoelen op alle inlaat- en uitlaatpoorten terwijl je eventueel overtollig aqua afveegt om eventuele afzettingen te voorkomen die de kanalen kunnen verstoppen bij het drogen. Het controleren van de celconcentratie is essentieel om het juiste aantal cellen in het juiste aantal druppels te bereiken. Dit heeft twee uitdagende componenten.
De eerste is het geschatte concentratie van tevoren inschatten en de tweede is het handhaven van die concentratie tijdens het experiment Voor het specifieke apparaat dat in dit onderzoek wordt gebruikt, moeten cellen of deeltjes van acht tot vijftien micron voldoende zijn geordend voor gecontroleerde enkapselaaring. In deze demonstratie worden 9,9 micron polys diary-microsferen gebruikt als celsurrogaten om de waterige deeltjessuspensieconcentratie te bereiden om een ideale audit-enkapselaaring te bereiken, begin met een microsfeerstockconcentratie van 1% vaste stof per gewicht gebruikend eerdere gegevens voor volledige ordening. Als richtlijn verhoog de concentratie tot 1,5% vaste stof per gewicht door voorzichtig een milliliter van het stockmonster te centrifugeren, 250 microliters van het supernate vloeistof te verwijderen en deeltjes te resuspensiëren door middel van vortex-mengen of zachtere mengen.
Bij gebruik van cellen hebben zowel cellen als polystyreen deeltjes een soortelijk gewicht groter dan één, hoewel dit niet in deze video wordt getoond. Voor langdurige experimenten die enkele minuten tot uren duren, kan de oplossing op drijfvermogen worden afgestemd door een oplosmiddel zoals calciumchloride voor deeltjes of opti-prep voor cellen toe te voegen. Nadat de cel- of deeltjessuspensie klaar is, bereid een 10 milliliter monster van de continue fluorkoolstof-oliefase in een 15 milliliter centrifugeerbuis voor.
Meng de
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om de inkapsling van cellen in druppels van picolitergrootte te controleren door vloeistofdynamische celordening te combineren met druppelgeneratie. De aanpak zorgt voor hoogfrequente druppelgeneratie terwijl de controle over het aantal cellen per druppel wordt gehandhaafd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Celinkapsling
- Druppelgeneratietechnieken
Achtergrond
- Inkapsling van cellen in kleine druppels is cruciaal voor verschillende toepassingen.
- Vorige methoden ontbraken controle over het aantal cellen per druppel.
- Microfluidische technieken kunnen de precisie van celinkapsling verbeteren.
- Het combineren van verschillende microfluïdische fenomenen kan de efficiëntie verbeteren.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor nauwkeurige controle van celinkapsling in druppels.
- Om de effectiviteit van het combineren van celordening en druppelgeneratie te demonstreren.
- Om hogere inkapslingsefficiënties te bereiken in vergelijking met ongeordende methoden.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een flow focusing druppelgeneratie nozzle.
- Hoge stromingssnelheden om geordende treinen van cellen of deeltjes te creëren.
- Synchronisatie van druppelgeneratie met de aankomst van geordende cellen.
- Gebruik van oppervlakteactieve stof-gestabiliseerde olie als dragervloeistof voor druppelvorming.
Belangrijkste resultaten
- Gedemonstreerd controle over het aantal cellen per druppel.
- Behaalde druppelgeneratiesnelheden op kilohertzfrequenties.
- Vertoonde efficiënties die die van ongeordende inkapsling overtreffen.
- Gevalideerd de methode met behulp van zowel cellen als deeltjessurrogaten.
Conclusies
- De methode maakt efficiënte inkapsling van cellen in microfluïdische druppels mogelijk.
- Het combineren van celordening met druppelgeneratie verbetert de controle.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende biologische en biomedische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Controlling the number of cells per drop in microfluidic encapsulation addresses a key limitation in high-throughput screening and single-cell analysis, where random encapsulation leads to inefficient use of samples and increased downstream sorting. By synchronizing drop generation with ordered cell trains, this method significantly improves encapsulation efficiency for defined cell numbers, enhancing predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The approach supports scalable, reproducible workflows for early discovery and assay development, reducing biological variability and improving data quality in compound screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating defined numbers of cells to study homotypic and heterotypic interactions in controlled microenvironments.
- Operational Value: Increases the fraction of drops containing the desired number of cells, reducing waste and improving throughput in screening applications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides monodisperse, cell-confined drops that prevent dilution of biomarkers and amplify signals from cellular secretions, improving assay sensitivity.
- Operational Value: Supports kilohertz drop generation rates with high encapsulation efficiency, enabling scalable and reproducible assay formats for high-content screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of intercellular signaling and cellular heterogeneity in defined group sizes, supporting mechanistic de-risking of lead candidates.
- Operational Value: Allows re-merge of drops for downstream analysis, enabling continuity from discovery through preclinical validation without cross-contamination.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling controlled encapsulation at the assay preparation stage, supporting lead identification through improved signal-to-noise in cellular readouts and reducing false negatives from uneven cell loading.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise control over cellular composition in each drop, reducing noise from variable cell numbers.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized drops with quantitative outputs that improve reproducibility across runs and sites.
- Analytics: Generates encapsulation efficiency metrics (Pk=1, Pk=2) that allow teams to compare ordered vs. random encapsulation and assess workflow performance.
- Translational Research: Enables study of controlled cell-cell interactions, supporting biomarker alignment and preclinical continuity for immunomodulatory or co-culture dependent therapies.
- Enterprise Reuse: Represents a modular microfluidic capability adaptable to various cell types and particle surrogates, supporting platform-level investment over single-use techniques.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity from uncontrolled cell heterogeneity.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via synchronized drop generation and cell ordering, minimizing batch-to-batch variability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions through improved data quality and reduced false hits in screening cascades.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization by enabling more reliable assessment of compound effects in physiologically relevant cellular contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, flow rate optimization, and particle concentration control to maintain ordered trains.
- Depends on precise instrumentation including syringe pumps, high-speed imaging, and flow focusing nozzles with specific geometries.
- Necessitates cross-team standardization of particle/cell concentration protocols and buoyancy matching for long-term experiments.
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly regarding shear stress sensitivity and cell viability under high flow rates.
- Practical limitations include the need to balance flow rates for ordering versus jetting avoidance and the dependency on consistent particle concentration for optimal encapsulation efficiency.
