Modeling Colitis geassocieerde kanker met Azoxymethaan (AOM) en dextransulfaat natrium (DSS)

Op dag nul werden de muizen geïnjecteerd met azoxymethaan of OM in de daaropvolgende week. Hun drinkwater wordt vervangen door een oplossing die dextraansulfaatnatrium of DSS bevat. In week drie krijgen de muizen gedurende de volgende twee weken water.

Deze DSS-watercyclus wordt nog twee keer herhaald. Na de tweede DSS-cyclus kunnen de muizen op tumoren worden onderzocht via een spiegelendoscopie.

Na week 10 worden de muizen geëuthanaseerd en worden de colons geoogst. De colons worden gespoeld en longitudinaal geopend. De colons worden beoordeeld op tumoromvang en het aantal tumoren.

Een longitudinale doorsnede van het colon in derden kan worden ingebed en ingeleverd voor histologische analyse. Met behulp van lichtmicroscopie kunnen tumoren worden geteld en geclassificeerd. Wij demonstreren een protocol waarin toediening van het genotoxische agens a OM wordt gevolgd door drie cycli van het pro-inflammatoire agens.

DSS genereert snel en consistent colontumoren bij muizen met morfologische en moleculaire gelijkenissen met die gezien bij colitis-geassocieerd kanker bij mensen. Label de muizen individueel met staartmarkeringen of oorklemmen op dag nul, noteer het basisgewicht van elke muis in een tabel en injecteer elke muis vervolgens met een oplossing van 10 milligram per kilogram van een OM-oefening. Wees voorzichtig bij het hanteren van OM, aangezien het een genotoxisch agens is. Op dag zeven worden de muizen gedurende de volgende week voorzien van een 2,5% DSS-oplossing als drinkwater. Om deze oplossing te bereiden, voegt u DSS-poeder toe aan gedestilleerd water en mengt u dit tot het is opgelost.

De oplossing is gereed nadat deze door een celluloseacetaatfilter van 0,2 micron is geleid. Om een continue toevoer van DSS-oplossing gedurende zeven dagen te garanderen, dient de DSS elke twee tot drie dagen te worden vervangen.

Zet de kooien na deze periode gedurende twee weken weer terug op water. Weeg de muizen twee tot drie keer per week en observeer op rectaal bloeden en diarree. Muizen met grote tumoren kunnen tijdelijk rectaal prolaps ontwikkelen, hoewel dit over het algemeen het overlevingspercentage niet vermindert.

Gewichtsverlies ten opzichte van de uitgangswaarde wordt gebruikt als een surrogaatmaat voor de ernst van de colitis. Een gewichtsverlies tot 10% in combinatie met twee tot drie dagen diarree en rectale bloedingen kan worden verwacht in de week na een volledige cyclus van DSS-endoscopie. De tweede of derde cyclus van DSS kan worden uitgevoerd om tumorgroei in vivo te bevestigen voorafgaand aan de euthanasie.

Aangezien het A-O-M-D-S-S-model zeer betrouwbaar is in het produceren van tumoren, is deze stap over het algemeen niet nodig. Slechts enkele muizen moeten met deze methode worden geëvalueerd, omdat deze het potentieel heeft om de tumoren van de muis te verstoren. Uw werkgebied moet een bekerglas met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS bevatten, evenals een leeg bekerglas.

Om gebruikt PBS te verwijderen, zuigt u acht tot 10 milliliters PBS op in een spuit en bevestigt u deze per gebruik aan het endoscoop. Voor het spoelen van intraluminale inhoud wordt elke muis geanestheseerd met geïnhaleerde of injecteerbare sedatie en wordt de muis met tape bij de staart en borst aan een platte plank bevestigd; de voetkussentjes van de muis kunnen worden vastgeklemd. Om adequate sedatie te garanderen, gebruikt u uw duim en wijsvinger om de onderbuik van de muis samen te knijpen zodat de anus zichtbaar wordt, waarna de muren endoscoop in het rectum van de muis wordt ingebracht.

Gebruik voorzichtig PBS om op te blazen en te irrigeren om het intraluminale zicht te verbeteren en fecale resten te verwijderen. Ga langzaam verder met het invoeren van de endoscoop terwijl u de monitor observeert. Voor de aanwezigheid van grove tumoren op dag 70 zou elke met A-O-M-D-S-S behandelde muis meerdere colontumoren moeten hebben en klaar moeten zijn voor beoordeling.

Deze fase kan met weken tot maanden worden uitgesteld als grotere tumoren gewenst zijn. Bereid een met PBS gevulde spuit voor die is voorzien van een sondeernaald. Een spuit gevuld met 10% formaline, basischirurgische scharen, scharen met afgeronde punten.

Een kleine spuit gevuld met 1% Ian Blue-oplossing en een fijne pincet. Leg daarnaast een koude tray klaar, een weegschaaltje met gekoelde PBSA, een nieuw scheermes voor het snijden en een fixatiebak gevuld met 10% formaline. Euthanaseer elke muis via isofluraan en cervicale dislocatie of een andere institutioneel goedgekeurde methode. Het definitieve gewicht en andere metingen kunnen nu worden vastgesteld.

Leg de muis op dit moment met de ventrale zijde naar boven op een snijplank. Spray de buik met 70%ethanol om haren uit het dissectiegebied te houden. Gebruik een pincet om de middellijn van de buik vast te pakken en maak een kleine incisie door de huid om het peritoneum bloot te leggen.

Gebruik zachte tractie om de huid van het peritoneum te scheiden en de volledige buikholte bloot te leggen. Maak een incisie in het peritoneum en breid deze incisie bilateraal uit langs de costale rand. Gebruik gesloten scharen om de dunne darm en het colon naar de zijkant te schuiven.

Hierdoor komen de mesenteriale lymfeklieren bloot te liggen, welke optioneel kunnen worden geoogst. Voor de beoordeling dient het genitourinaire stelsel naar beneden te worden geschoven om hetstygende colon en het rectum bloot te leggen; excideer de blaas en de voortplantingsorganen indien nodig om het bekken verder vrij te leggen. Wees voorzichtig om aangrenzende weefsels niet te beschadigen.

Snijd door de ramus inferior en superior van het schaambeen om de overgang van de anus naar het rectum vrij te leggen. Snijd de huid rond de anorectale overgang om het colon te bevrijden, terwijl er voorzichtig tractie naar boven wordt uitgeoefend. Met een mesenteriale pincet kunnen de aanhechtingen van het colon worden weggesneden of losgemaakt.

Het is belangrijk om een deel van de huid bij de anorectale overgang te behouden, aangezien dit gebied vaak wordt aangetast door dysplasie. Transecteer de dikke darm van de dunne darm vlak proximaal van het caecum. Scheid het caecum van het aangrenzende colon met behulp van een 18 gauge gavage-naald bevestigd aan een spuit van vijf milliliter.

Spoel de dikke darm door met ijskoud PBS, zodat de vloeistof in de fysiologische richting uitstroomt, met behulp van een schaar met afgeronde punten. Open de dikke darm langs het mesenterium. Leg de geopende dikke darm plat op het koude plateau.

Zorg ervoor dat het plateau voldoende is ontdooid om te voorkomen dat het weefsel bevriest. Breng met een vinger enkele druppels 1% Ian Blue aan om tumoren beter te kunnen visualiseren. Beoordeel het aantal en de grootte van de tumoren met een liniaal of maak foto's voor digitale analyse.

Kleine secties van de tumor in aangrenzend normaal weefsel kunnen op dit punt worden weggesneden voor toekomstige analyse via RNA-, eiwit- of immunohistochemische methoden, waarbij een deel van de colon overblijft voor histologische beoordeling. Breng 10% formaline aan in de resterende colon op de koude plaat via een spuit of met de vinger, en laat het weefsel gedurende ten minste 30 seconden fixeren. Op deze manier wordt de overdracht naar het fixatiebekken vergemakkelijkt.

Zorg ervoor dat residuen van formaline worden afgeveegd voordat een nieuwe geopende colon op hetzelfde plateau wordt geschilderd. Breng de colon over naar een bak gevuld met 10% formaline en zet de randen vast met spelden. Gooi na drie uur fixatie de formaline weg en vervang deze door 70% ethanol.

Dikke darmen kunnen onbeperkt worden bewaard in 70% ethanol. Gebruik lage warmte om een oplossing van 2% agar te maken en leg een schoon objectglas klaar op een glasplaat. Snijd de gefixeerde dikke darm in drieën en plaats de ongebruikte stukken terug in het ethanolbad.

Trim de secties tot een uniforme grootte met behulp van twee scheermesjes. Bed എല്ലാ de colonsecties en lagen in agar op de schone objectglas. Herhaal dit proces voor de volgende colon.

Snijd het segment uit, verwijder overtollige agar en plaats de ingebedde colon in een cassette voor verwerking en kleuring met hematoxine en eosine. Figuur één schets 그래프t het protocol voor de inductie van colitis-geassocieerde kanker. Figuur twee toont het lichaamsgewicht van de muizen ten opzichte van de nulmeting tijdens de toediening van OM en DSS.

Houd er rekening mee dat de muizen in de week na elke DSS-cyclus vijf tot 10% van hun lichaamsgewicht verliezen. Gewichtsverlies in dit experiment is een surrogaatmarker voor de ernst van de colitis. Figuur drie toont een weergave van tumoren in het distale colon via muren-endoscopie op dag 50 van de A-O-M-D-S-S-behandeling.

Let op de meerdere polypoïde massa's die het lumen van het distale colon blokkeren in panelen B en C, in vergelijking met het normale colon. In paneel a van figuur vier is een longitudinaal geopend muiscolon te zien waarop het macroscopische uiterlijk van de tumoren wordt geïllustreerd. Let op de hogere tumorlast in het distale colon en de karakteristieke getextureerde structuur van het proximale colon met weinig tumorgroei.

Figuur vijf toont tumoren die zijn geaccentueerd door toepassing van lc en blauwe kleuring. Let op hoe de kleurstof zowel de normale textuur van het colon als de grenzen van elke individuele tumor benadrukt. Dergelijke kleuring kan nuttig zijn bij het nauwkeurig meten van tumoroppervlakken met een liniaal of via digitale meting.

Figuur zes toont de representatieve verdeling van het gemiddelde aantal tumoren per muis behandeld met een OM en DSS. Let op dat de meerderheid van de tumoren zich in het distale colon bevindt en minder dan twee millimeter groot is. Figuur zeven toont in paraffine ingebedde longitudinale doorsneden van het colon in een cassette en een h&E-gekleurde slide.

Let op dat residuele S en blauwe kleuring h en e kleuring niet beïnvloeden. Een grote tumor is omcirkeld op de dia-afbeelding. De aanduidingen distaal, midden en proximaal zijn het resultaat van het in derden snijden van de gehele dikke darm tussen het caecum en de anus.

Figuur 8 toont de representatieve histologie van een tumor in het distale colon als gevolg van de toediening van OM en DSS. De getoonde fotomicrografieën zijn gekleurd met H en E-B-R-D-U en bèta-catenine en tonen dysplastische veranderingen die vergelijkbaar zijn met humane adenocarcinomen van het colon. In deze video hebben we een protocol gedemonstreerd voor ontsteking-gedreven colone tumorgenese bij muizen, waarbij gebruik is gemaakt van een enkele injectie van OM gevolgd door drie cycli van zeven dagen met DSS.

Gedurende een periode van 10 weken induceert dit model tumoren met histologische en moleculaire veranderingen die sterk lijken op die welke voorkomen bij colitis-geassocieerde kanker bij mensen, en biedt het een zeer waardevol model voor de studie naar oncogenese en chemopreventie bij deze ziekte.