Bemonstering Human Inheemse Speeksel peptidoom Met behulp van een Lollipop-Like Ultrafiltratie Probe: vereenvoudigen en te verbeteren Peptide Detection voor Klinische massaspectrometrie

Deze studie naar spekselpeptiden maakt gebruik van een lolly-achtige ultrafiltratieprobe, gevolgd door directe nano lc LT Q massaspectrometrie-analyse. Assembleer eerst de LLUF-probe met behulp van een polyethersulfonmembraan en een ethyleenpropeenbuisje. Verzamel vervolgens spekselfracties van vrijwilligers en verwerk deze via de LLUF-probe om het speksel te bemonsteren.

Ga vervolgens direct over tot nano L-C-L-T-Q massaspectrometrie en analyseer de gegevens van speekselmonsters met en zonder LLUF-probebehandeling. Uiteindelijk kan het speekselpéptiid worden verkregen door de L-C-M-S-S-gegevens te analyseren en de geïdentificeerde peptiden tussen de twee monsters te vergelijken. Deze aanpak, waarbij een lolly-achtige ultrafiltratieprobe wordt gekoppeld aan een directe nano LC LTQ massaspectrometrie-analyse, biedt belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden, zoals het verteren van speekseleiwitten tot peptiden.

Vervolgens wordt massaspectrometrieanalyse uitgevoerd; de LUF PRO vereenvoudigt en reinigt het speeksel en verbetert tevens de MS-detectie van peptiden in het totale speeksel voor klinische toepassingen. Gebruik epoxylijm om de polyether-cellulosemembranen op de randen van de driehoekige polypropyleenpaddles te verzegelen. Bevestig daarna een Teflon gefluoreerde ethyleenpropyleenbuis aan een cilinderuitgang van een driehoek.

Steriliseer de polypropyleen peddels en de probes gedurende de nacht met 70% alcohol. Om de juiste afdichting te evalueren, worden de LLUF-probes twee uur ondergedompeld in een blauw dextraan-oplossing van 50 mg/mL. Bevestig de afwezigheid van blauw dextraan in de verzamelde monsters.

Werf gezonde vrijwilligers in de leeftijd van 20 tot 40 jaar. Laat de proefpersoon na een spoeling van de mond met water monsters van ongestimuleerd speeksel spugen in een op ijs gekoeld vat. Voeg alle monsters samen en bewaar deze op ijs.

Ga direct na de afname naar een ruimte van 4 °C met 200 µL speeksel voor de bemonstering met LLUF-sondes. Week nu het polyether-celmembraan in menselijk speeksel in een kweekschaal. Creëer een negatieve druk door een spuit leeg te trekken om een ultrafiltratieproces voor bemonstering uit het speeksel te simuleren.

Bepaal vervolgens de eiwitconcentraties. Bereid één microgram per microliter van de speekseleiwitmonsters voor voor analyse via nano LC-massaspectrometrie. Voor de monsteranalyse gebruiken we een Exigent nano LC die online is gekoppeld aan een Finnegan LTQ-massaspectrometer. Laad eerst vijf microliter van de onverteerde speekselmonsters via de autosampler op de trapkolom van het nano LC-systeem.

Na een wasstap wordt de klep omgeschakeld en wordt een lineaire gradiënt van 0 tot 50% buffer B naar de trap en de C 18-scheidingskolom geleid. Verzamel met de data-afhankelijke modus van Excalibur ms ms-spectra van de vier sterkste MS-ionen met een intensiteit boven 1 x 10⁴. Voer voor elk monster dubbele runs uit van drie verschillende afzonderlijke preparaties.

Importeer vervolgens het datafile in het Sequester Sorcerer 2-systeem en selecteer een zoekopdracht tegen een passende humane NCBI-proteïnedatabase met gebruik van non-enzymspecifiteit. Na het Sequester-zoeken worden de resultaten automatisch gefilterd, gevalideerd en weergegeven in Peptide Prophet en Protein Prophet op basis van de Sequester-resultaten. Peptide Prophet schat een uitgebreide waarschijnlijkheidsscore (P-score) in voor de vraag of de toewijzing van een peptide correct of incorrect is, en identificeert tevens aanvullende informatie over elke peptidevolgorde.

Protein profit berekent een waarschijnlijkheidsscore van nul tot één voor elk eiwit op basis van peptiden die zijn toegewezen aan Ms.Ms-spectra. Deze sectie bepaalt het vermogen van LLUF-sondes om orale bacteriën te verwijderen voor bacteriële detectiekweek; de speekselmonsters vóór en na de collectie met de LLUF-sonde worden op agarplaten geplaatst voor een test op aerobe bacteriën. Gebruik antibioticavrije LB-agarplaten bij 37 °C gedurende één dag en gebruik voor anaerobe bacteriën een gaspack voor de kweek.

De monsters in bru-bouillon, auger-platen onder anaerobe omstandigheden bij 37 °C gedurende één dag. De vervaardiging van lolly-achtige ultrafiltratieapparaten vergemakkelijkt het bemonsteren van speeksel in een gesimuleerde orale omgeving. In dit systeem wordt een negatief geladen polyethersulfonmembraan met een molecular weight cutoff van 30 kilodalton gelijmd aan een polypropyleenpedel en voor de LLUF-sonde geplaatst om grotere eiwitten in het speeksel weg te filteren.

Om de menselijke mondholte na te bootsen, wordt een spons met behulp van een spuit gedrenkt in speeksel. Het speeksel wordt gefilterd en opgevangen via de aangesloten slang. Door LC-chromatogrammen van speeksel vóór en na LLUF-bemonstering te vergelijken, konden inheemse speekselpeptiden worden geïdentificeerd via nano L-C-L-T-Q massaspectrometrie.

Aangezien deze differentiële chromatogrammen worden verkregen zonder chemische of enzymatische digestie, vereenvoudigen ze de monstervoorbereiding voor klinische doeleinden. In dit monster leidde LLUF-elucidatie van de verschillende eiwitsamenstellingen tot de identificatie van 131 peptiden in onverteerde speeksel.

Deze peptiden zijn fragmenten afgeleid van diverse proline-rijke eiwitten. Actine, alfa-amylase, alfa-1-globine, bèta-globine, histatine-1, keratine-1, mucine-7, polymere immunoglobuline-receptor, serine en S100A9. De 26 unieke peptiden die in speeksel zijn geïdentificeerd na filtering met LLUF-probes zijn fragmenten die hoofdzakelijk zijn afgeleid van diverse proline-rijke eiwitten.

Dit peptide, afgeleid van alfa-amylase, werd uitsluitend gedetecteerd in een speekselmonster dat zonder LLUF-probes was verzameld, wat de capaciteit van LLUF-probes om grote eiwitten te verwijderen illustreert. Meest intrigerend is dat, na het verwijderen van grotere eiwitten, verschillende sequentiepeptiden detecteerbaar waren in het met LLUF-probes bemonsterde speeksel; in het bijzonder werden peptiden met proline-rijke c-termini geïdentificeerd in monsters na ultrafiltratie met LLUF-probes. U heeft nu een goed inzicht in hoe u A-L-L-L-L-U-F PRO kunt gebruiken voor eenvoudig speeksel voor massaspectrometrie.

Een betere analyse is zeer belangrijk voor het verzamelen van simpel speeksel onder consistente omstandigheden. Zodra men dit beheerst, geloof ik dat deze techniek binnen drie uur correct kan worden uitgevoerd. Deze benadering met een lolly-achtige ultrafiltratieprobe gekoppeld aan directe nano LC-LT-QMS-spectrometrie faciliteert klinische toepassingen voor biomarkers bij de diagnose van menselijke ziekten.